醇提双黄连

醇提法制取双黄连片剂工艺及质量检查 Abstract:Objective To prepare the tablet of Fufang Shuanghuanglian，and check the quality of tablet. Methods The use of alcohol extract shuanghuanglian ,and single-punch Tablet press tablets.For tablet inspection to using dual-wavelength measure the content of baicalin The use 0f TLC identify baicalin honeysuckle forsythia Verify the use of inflammatory efficacy in mice Conclusion:The alcohol extract the shuanghuanglian which content of baicalin lower and efficacy was not obvious. 摘要:目的:制备复方双黄连片进行质量检查。方法：利用醇提法制得双黄连，并用单冲压片机压片，进行片剂检查，利用双波长测定黄芩苷的含量，利用TLC进行金银花、黄芩、连翘的鉴定，利用小鼠致炎验证药效。结果：片剂检查各项符合标准，黄芩苷含量低，小鼠肿胀率低。结论：醇提法制得双黄连片剂中黄芩苷的含量较低，药效较明显。 引言：双黄连用于疏风解，清热解毒。用于外感风热所致的感冒，症见发热、咳嗽、咽痛。主要有金银花、黄芩、连翘按照一定的比例进行处方配比。金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb的干燥花蕾或带初开花为常用中药，具有清热解毒，凉散风热之效主旨热毒血痢，风热感冒等症状，金银花的有效成分是绿原酸。黄芩具有泻实火，除湿热的功效，用于呼吸道感染、发热，肺炎，支气管炎，咳嗽有痰，肺热咳嗽湿热泻痢等的治疗，其主要成分有黄芩苷元，黄芩苷，汉黄芩素，喊黄芩苷和黄芩新素。连翘为木犀科植物连翘的干燥果实。性苦、微寒，归肺，新小肠结，有清热解毒，消肿散结的功效，是常用的中药材之一，连翘苷有抗菌功能. 1、 材料与器材 1．1药材与试剂： 黄芩 产地陕西 规格段 批号090801 生产企业河北康派中药材有限公司; 金银花 产地河南 规格朵 批号090401 生产企业河北康派中药材有限公司； 连翘 产地山西 规格个 生产企业 安国市祁澳中药饮片有限公司 微晶纤维素(MCC)，羧甲基淀粉钠(CMS-Na)，干淀粉，硬脂酸镁均为国产药用级； 连翘苷标准品、绿原酸标准品、黄芩苷标准品(中国生物制品检定所)； 甲醇为色谱纯；盐酸为分析纯； 1.2器材 电炉：青岛市即墨市顺祥电器厂 KH-250DB型数控超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司 CS-2脆碎度测试仪：天津市国铭医药设备有限公司 YD-1片剂硬度测试仪：天津市国铭医药设备有限公司 FA1004N分析天平：HANGPING YP601N电子天平：上海精密科学仪器有限公司 101型电热鼓风干燥箱：天津泰斯特有限公司 正丁醇（不少于99.0%）：天津市博迪化工有限公司 乙酸乙酯（≥99.0%）：SCRC国药集团化学试剂有限公司 乙酸乙酯（≥99.5%）：天津市博迪化工有限公司 甲醇（≥99.5%）：天津市博迪化工有限公司 三氯甲烷：烟台三和化学试剂有限公司 正丁醇：天津市博迪化工有限公司 CHCl3(≥99.0%)：上海埃比化学试剂有限公司 1DP单冲压片机(上海天驰制药机械合作公司)； 薄层色谱；CQ．250型超声波处理器(250W，40Hz)； MettlerAB204一N电子天平(Max 210 g；d=0．1 mg) 2、 方法与结果 2.1连翘和金银花的提取 称取连翘262.50g;金银花131.25g；1400ml，95%乙醇；置于2000ml圆底烧瓶内回流1h。再倒入1300ml，95%乙醇回流0.5h。用纱布过滤合并两次乙醇溶液。进行溶液浓缩，浓缩至黏稠状。放置24h。加入连翘和金银花各3g的细粉置于蒸发皿中搅拌加热至稠膏状，平坦与蒸发皿中。蒸发皿置于烘箱内烘干。研磨成细粉。 2.2黄芩的提取 取131.25g黄芩于500mL烧瓶中，加适量75%乙醇，回流提取每次半小时，两次，四层纱布过滤，合并滤液，得滤液350ml。滤液蒸馏回收乙醇，浓缩滤液至约70ml，于80℃下加2mol/L盐酸溶液调其pH至1.0--2.0，于80℃下保温一小时，减压抽滤，滤饼水洗至pH5.0，再以70%乙醇液洗至pH7.0，最后将沉淀低温干燥，备用。 2.3压片 （1）处方组成 材料 金银花 黄芩 连翘 微晶纤维素 羧甲基淀粉纳 乙醇 硬脂酸镁 重量（g） 1875 1875 3750 适量 适量 适量 适量 按照上表组成配置 （2）合并黄芩细粉、金银花和连翘细粉，加入微晶纤维素适量，迅速搅拌制成软材，过14~16目筛，制粒，湿粒在60摄氏度下烘干，加入适量硬脂酸镁混均后开始压片。最后制得88片。 2.4片重差异 取20片。称总重5.4997g，平均片重0.2750g 片重 0.2851 0.2557 0.2714 0.2860 0.2704 0.2691 0.2682 0.2859 0.2767 0.2759 个体差异 0.0101 -0.0193 -0.0036 0.0110 -0.0046 -0.0059 -0.068 0.0109 0.0017 0.0009 片重差异 3.7% 7.0% 1.3% 4.0% 1.7% 2.1% 2.5% 4.0% 0.6% 0.3% 片重 0.2682 0.2781 0.2851 0.2783 0.2853 0.2871 0.2541 0.2613 0.2734 0.2853 个体差异 -0.0068 0.0031 0.0101 0.0033 0.0103 0.0121 -0.0209 -0.0137 -0.0016 0.0103 片重差异 2.5% 1.1% 3.67% 1.2% 3.7% 4.4% 7.6% 5.0% 0.6% 3.7% 2.5脆碎度与硬度检查 脆碎度检查时取20片，总重5.3281g，从测试仪中取出后总重为5.3232g。没有出现片剂破碎。符合标准 硬度检查取5片 4.17 2.83 2.13 2.06 2.57 2.6崩解度检查 取6片，至于崩解仪中10min之内全部溶解。药典药材原药片应该在30分钟内崩解，实验结果不符合标准。 2.7双波长测定黄芩苷含量 对照品溶液：12.5mg置于50ml容量瓶中，加入50%甲醇适量，置水浴中振摇使其溶解，放置至室温，稀释至刻度，记得浓度为0.25mg/ml的溶液中。 标准曲线绘制：精密量取对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml置100ml容量瓶中加50%甲醇至刻度，摇均在分光光度计中277nm和377nm波长处分别测得吸收度A值，得ΔA,以ΔA对浓度C进行回归，得回归曲线ΔA=33.82C-0.2516 对照品：取20片，研磨，精密称取5.2570g药粉于100ml容量瓶中，加入适量的50%甲醇溶液,超声处理20分，稀释至刻度，滤过，精密量取1.00ml滤液于100ml容量瓶中,加入50%甲醇溶液至刻度,测此溶液277nm和377nm下的吸光度,。用50%甲醇做对照 波长(nm) 277 377 吸光度A 0.777 0.047 2.8黄芩、金银花、连翘的鉴定 （1）黄芩的鉴定 对照液 黄芩对照药材1g于小烧杯中，加甲醇30ml，超声波处理30MIN，过滤，滤液浓缩近干，加甲醇2ml溶解； 供试液 取片剂2片，于研钵中研磨，加甲醇30ml，超声波处理30MIN，过滤，滤液水浴浓缩至干，加甲醇2ml溶解 展开剂 正丁醇-冰乙酸-水（7：1：2） 显色剂 盐酸酸化的5%氯化铁乙醇溶液 在薄层板上点对照液、供试液、和标准品黄芩苷溶液三个对比点， 在层析缸内倒入展开剂，展开，晾干，喷以显色剂。 （2）连翘的鉴定： 对照液 称取连翘0.5g，加甲醇10ml，置水浴中回流20分，过滤，取滤液作为对照药材 供试液 取片剂1片，研钵中研磨，于小烧杯中加75%乙醇溶液10ml，并于超声波下处理10min，过滤，取滤液； 展开剂 三氯甲烷-甲醇（5：1） 显色剂 10%硫酸乙醇并于105℃下显色 照薄层色谱法试验，吸取对照品溶液、供试液、标准品连翘苷各5微升，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，在展开剂中展开，取出，晾干，喷以显色剂在105摄氏度加热至斑点显色清晰， 4）．金银花： 供试液 取片剂4片，研钵研磨，于小烧杯中加热水40ml溶解，加乙酸乙酯提取两次，每次15ml，合并乙酸乙酯提取后的水液，加盐酸溶液调其pH至1.0，再用乙酸乙酯提取两次，每次15ml，合并乙酸乙酯提取液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml（适量即可）溶解，滤过，取滤液 对照品 金银花对照药材10g，加水100ml煎煮1h，滤过，滤液加HCl调至PH1.0 展开剂 乙酸乙酯-甲醇-水（7：2.5：2.5）上层溶液 显色剂 氨制硝酸银试液烘干后显色 标准品 精密称定绿原酸加甲醇1mg/ml的溶液 照薄层色谱的试验方法展开，晾干，显色。 2.9双黄连片的药效学研究 随机取四只小鼠，称取体重 编号 1 2 3 4 体重（g） 20.4 21.4 22.3 22.6 用二甲苯作为致炎剂，引起小鼠耳朵外廓皮肤肿胀，观察给药组和对照组的致炎耳壳的重量，并比较其肿胀率的差异 按照 （1）给药组，取编号1、2(二甲苯涂于左耳上) 编号 1 2 给药量（ml） 0.75 0.75 左耳重(g) 0.0065 0.0100 右耳重(g) 0.0056 0.0072 肿胀率% 16.07 38.89 （2）对照组，取编号3、4（二甲苯使左耳致炎） 编号 3 4 左耳重（g） 0.0064 0．0076 右耳重（g） 0.0053 0.0062 肿胀率% 20.75 22.58 2.10结果 （1）片重差异：药典规定小于3.0克的片剂，片重差异不能超过7.5%，由实验结果可得片重差异符合规定。 （2）脆碎度和硬度符合规定 （3）崩解时限，根据药典规定药材原料药在30分钟内全部崩解，在10分钟之内全部崩解，符合标准。 （4）黄芩苷的含量 A1=0.777 A2=0.047 ΔA=0.730 回归方程：ΔA=33.82C-0.2516 R=0.9988 x=0.01~0.025mg/ml 代入，得c=0.029mg/ml 稀释倍数为10000倍 取样5.2570g，则0.029*10000/ 5257=5.52% 药典规定，双黄连片剂0.53g重,其黄芩苷含量≥50mg/片， 其黄芩苷含量即≥9.43%。 故本实验所做片剂黄芩苷含量不符合规定。 （5）金银花、黄芩、银翘的鉴定 3、 讨论 1、 黄芩苷含量过低 与PH值、保温温度、保温时间有关。 在有关实验中进行正交试验筛选制备黄芩苷的最佳工艺。考察保温时间、保温温度、PH值的控制，黄芩加入12倍水煎煮两次，每次1.5h，90摄氏度下用盐酸调PH值为2，水浴保温15min。在其他有些实验也提出过在45摄氏度下保温24h。 当PH为1时，黄芩苷有少量的棕黑色物质，原因是强酸使黄芩苷水解所致 当PH为3时，溶液为黄色乳浊液，极难过滤且产量低。 根据相关文献可知，黄芩苷的产量低与这三个原因有很大的关系，而且醇提的时候会有更多的杂质带出，使黄芩苷包裹于杂质中或与其吸附。 2、 黄芩苷含量测定方法 除了利用双波长进行黄芩苷的测定，还可以根据药典的要求用HPLC的方法进行测定，但是很多实验得出药典所给的流动相甲醇：水（13：7）并不是最好的，黄芩苷与其他物质的分离度不好。有更多的实践得出最好的流动相是甲醇：0.2%磷酸溶液（48：52） 3、 连翘的提取方法 醇提连翘虽然可取但是成本太高，耗时，使有效成分不稳定，能量的传递无规则，提取的选择性较差，有效成分提取较低，而微波可与被分离物质直接作用，使其与周围环境分离，从而加快物质的分离速度，提高萃取效率。 4、 连翘的鉴定 使用TLC进行鉴定耗时而且受外界环境影响严重，所以鉴定可以使用YMC色谱，流动相为乙腈-水（25：75）下进行测定。 5、 金银花的含量鉴定存在的问题以及方法改进 金银花的有效成分为绿原酸，在醇提工艺步骤中成本过高，而且醇提会提取出更多的杂质。沉淀会包裹或吸附绿原酸，在干燥过程中绿原酸的稳定性容易被破坏。而且醇提的成本过高。 改进方法：有关文献中提到用正交试验进行绿原酸提取的最佳工艺。考察的因素有：加水倍数、煎煮时间、煎煮次数，最佳的工艺是加入水12倍，煎煮3次每次一个小时。 但是上面的方法也存在欠缺，又有文献提到今年来广泛应用有机化合物分离纯化的打孔吸附树脂法成为绿原酸成分纯化的有效手段，利用绿原酸具有一定的极性和水溶性这一特点使得选用大孔吸附树脂进行分离成为可能性。 6、小鼠给药组肿胀率过高的原因 因为个体差异的原因，如小鼠的体质较差，受惊等原因造成，有可能也包括人为原因使得给药组的肿胀率比对照组的高 解决方法：随机分组，用健壮雄鼠，使用多只小鼠进行试验，以及改进实验操作。 参考文献： 2005版《中国药典》 人卫版《药剂学》 刘恩荔等，打孔吸附树脂法分离纯化金银花中总有机酸的研究，《中草药》第37卷12期1792-1796 段晓颖，金银花水提工艺中绿原酸变化的研究，《中草药》第38卷8期1189-1190 Zhang X P Tian H The current situation in pharmacological study on baicalin 《中国药理学通报》2003，19（11）：1212-1215 孔慧等，黄芩苷制备工艺的研究，《中成药》2004，26（2）156-157