第六章 微生物的遗传变异和育种

nullnull 第七章 微生物的遗传变异和育种 遗传(heredity) 生物上一代将自己的一整套遗传因子传递给下一代的行为或功能，它具有稳定的特性。 遗传性 子代总保持与亲代相同的生物学特性。 遗传型(genotype) 生物体所具有的全套遗传物质总称。又称基因型。null型(phenotype) 在特定的外界环境中，通过生长和发育所表现出的种种形态和生理特征的总和，称为表型. 变异(variation) 生物体在某种外因或内因作用下所引起遗传物质的结构或数量的改变，即遗传型的改变。 饰变（modification） 不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。null第一节 遗传变异的物质基础 一 3个经典实验 (一)经典转化实验1928年Griffith进行的肺炎链球菌的转化实验null1944年Avery证实转化因子是DNAnull二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式 （一）7个水平 试简述微生物遗传物质存在的七个水平。 1 细胞水平 2 细胞核水平（plasmid） 3 染色体水平 4 核酸水平 5 基因水平（遗传功能单位） 6 密码子水平（遗传信息单位） 7 核苷酸水平（最低突变或交换单位）null（二）原核生物的质粒 什么是质粒？它有哪些特点？主要质粒有几类？各有何理论与实际意义？ 质粒：指游离于原核生物核基因组外,具有独立复制能力的小型共价闭合环状dsDNA分子,即cccDNA (circular covalently closed DNA)为典型的质粒。 质粒的特点： ① 染色体外遗传物质 ② 独立存在的，能自主复制的遗传物质。 ③ 双股环状DNA，可游离存在，也可整合到宿主DNA上。null质粒种类： 1、F质粒： 又称F因子（致育因子）：大肠杆菌中发现，含质粒为F+（♂）；无质粒为F-（♀）；质粒DNA整合到染色体上为Hfr. 2、R质粒： 携带有分解某种抗生素或药物酶系的基因的质粒，可以赋予宿主细胞耐或抗或分解或失活某种抗生素或药物的性能。R因子对多种抗生素有抗性,因此可作为筛选时的理想标记,也可用作基因载体。null3、Col质粒： 又称大肠杆菌素质粒或大肠杆菌素产生因子，大肠杆菌素(colicin)是一种E.coli的某些菌株所分泌的细菌毒素,具有通过抑制复制、转录、翻译或能量代谢等而专一地杀死其他肠道细菌的功能。 4、Ti质粒（诱癌质粒）： 诱癌质粒。根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)可引起许多双子叶植物的根癌,它是由该菌的Ti质粒所引起的。Ti质粒长200kb,是一大型质粒。Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。null5、Ri质粒 发根农杆菌或发根土壤杆菌细胞中含有Ri质粒，可侵染双子叶植物的根部，并诱生大量的毛状的不定根，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。 6 mega质粒： 又称巨大质粒，为近年来在根瘤菌属(Rhizobium)中发现的一种质粒, 比 一般质粒大几十倍至几百倍,故称巨大质粒,其上有一系列固氮基因。null7降解性质粒： 只在假单胞菌属(Pseudomonas)中发现。它们的降解性质粒可编码一系列能降解复杂物质的酶,从而能利用一般细菌所难以分解的物质作碳源。从而使这类细菌在污水处理、环境保护等方面发挥特有的作用。null第二节 基因突变和诱变育种 一基因突变 (一)突变类型 1 营养缺陷型 2 抗性突变型 3 条件致死突变型 4 形态突变型 5抗原突变型 6 产量突变型null(二)突变率 每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率，称突变率。 例如:突变率为10-8的，即指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。 （三）突变的特点 （1）不对应性 （2）自发性 （3）稀有性 （4）独立性 （5）诱变性 （6）稳定性 （7）可逆性 null　（四）基因突变的自发性和不对应性的证明 什么是影印平板培养法？它有何理论与实际应用？ 影印平板培养法定义： 是一种通过盖印章的方式，达到在一系列培养皿平板的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种和培养方法。null影印平板培养法基本过程： 把长有许多菌落(可多达数百个)的母种培养皿倒置于包有 灭菌丝绒布的木圆柱(直径略小于培养皿)上,然后可把这一“印章”上的细菌一一接种到不同的选择性培养基平板上,待培养后,对各皿相同位置上的菌落作对比后,就可选出适当的突变型。null影印平板培养法具体步骤：null影印平板培养法结论： 通过影印平板培养法,可以从在非选择性条件下生长的细菌群体中，分离出各种类型的突变种。 影印平板培养法不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用，而且在育种实践和其他研究中均有应用。 通过影印平板培养法直接证明了微生物的抗药性突变是自发产生,与相应的环境因素毫不相关的论点。null诱变育种的基本环节有哪些？关键是什么？何故？ 诱变育种： 是指利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学实验之用。 在诱变育种的过程中，诱变与筛选是两个主要环节， 由于诱变是随机，筛选是定向的，所以更为重要。null微生物诱变育种的基本环节（以选育高产变株为例）null诱变育种的原则 ① 选择简便有效的诱变剂 物理诱变剂：UV、激光；X射线、γ射线和快中子 化学诱变剂：烷化剂、碱基类似物和丫啶类化合物 ② 挑选优良的出发菌株（用于育种的原始菌株） ③ 处理单孢子（或单细胞）悬液 ④ 选用最适的诱变剂量 在育种实践中，常以杀菌率作为诱变剂的相对剂量，多采用杀菌率为70~75%甚至更低（30~70%）的相对剂量。null⑤充分利用复合处理的协同效应 ⑥利用和创造形态、生理与产量间相关的指标 ⑦高效筛选 初筛：以量（选留菌株的数量）为主，利用和创造形态、生理与产量间的相关指标，可在培养皿或摇瓶中进行。 复筛：以质（测定数据的精确度）为主，一般采用摇瓶培养或台式发酵罐进行发酵，然后对培养液进行分析测定，选出较理想的菌种。null试概括一下筛选营养缺陷突变株的主要步骤和方法。 营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。现分述如下： 第一步，诱变剂处理。 第二步，淘汰野生型： 在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。 第三步，检出缺陷型：具体方法很多。用一个培养皿即可检出的，有夹层培养法和限量补充培养法；在不同培养皿上分别进行对照和检出的，有逐个检出法和影印接种法。 第四步，鉴定缺陷型：可借生长谱法进行。null第三节 基因重组和杂交育种 基因重组： 两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程，称为基因重组（generecombination）或遗传重组。 一、原核微生物的基因重组 在原核微生物中，基因重组的方式主要有转化、转导、接合和原生质体融合几种形式null（一）转化（transformation） 受体菌直接接受供体菌的DNA片段而获得供体菌部分新的遗传性状的现象，就称转化或转化作用。受体菌再经复制就使自己变成一个转化子（transformant）。nullnull转化 过程null（二）转导（transduction） 通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，就称转导子（transductant）。null1．普遍转导（generalizedtransduction） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”，而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍转导。 2．局限转导（restricted或specializedtransduction） 指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。null普遍性转导null低频转导（LFT）裂解物的形成低频转导通过溶原菌释放的噬菌体所进行的转导，只能形成极少数的转导子（10-4 ~10-6）。 λλnullnull（三）接合（conjugation） 供体菌（“雄”）通过其性菌毛与受体菌（“雌”）相接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，从而使后者获得供体菌的新遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞，就是接合子（conju-gant）。 大肠杆菌的接合nullnullE．coli的F+ 、 F- 、Hfr和F′菌株的异同，并图示四者间联系。 E．coli分成四种相互有联系的接合型的菌株 F+菌株： 在细胞中存在着游离的F因子（1～4个），在细胞表面还有与F因子数目相当的性菌毛。当F+菌株与F-菌株相接触时，前者可通过性菌毛而将F因子转移到后者细胞内，因而使Fˉ菌株也转变成F+菌株（一般可达到100％）。 F-菌株： 在F-菌株中不含F因子，细胞表面也没有性菌毛。但它可通过与F+菌株或F′菌株的接合而接受供体菌的F因子或F′因子，从而使自己转变成“雄性”菌株，也可接受来自Hfr菌株的一部分或全部遗传信息。nullHfr菌株：（高频重组，high frequency recombination strain） Hfr菌株是其F因子已从游离状态转变成在核染色体组特定位点上的整合状态。因为Hfr菌株与Fˉ菌株接合后发生重组的频率要比F+与F-接合后的重组频率高出数百倍，所以称为高频重组菌株。 F′菌株 ： 当Hfr菌株内的F因子因不正常切离而脱离核染色体组时，可重新形成游离的但携带一小段染色体基因的特殊F因子，称F′因子。具有 F′因子的菌株称为F′菌株 。nullnullnullHfr与F－菌株间的接合中断试验nullF质粒的4种存在方式及相互关系null（四）原生质体融合（protoplastfusion） 通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子（fusant）的过程，称为原生质体融合。null原生质体融合的操作示意图null二、真核微生物的基因重组 在真核微生物中，基因重组主要有有性杂交、准性杂交、原生质体融合和转化等形式，现以有性杂交和准性杂交为例加以介绍。 （一）有性杂交 杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。有性杂交，一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。 凡能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都可应用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。S. Cerevisiae 的双倍体和单倍体细胞的比较S. Cerevisiae 的双倍体和单倍体细胞的比较项 目 双倍体 单倍体 细 胞 大，椭圆形 小，球形 菌 落 大，形态均一 小，形态变化较多 液体培养 繁殖快，细胞较分散 繁殖较慢，细胞常聚集成团 在产孢子培养基上 形成子囊及子囊孢子 不形成子囊null（二）准性杂交（parasexualhybri-dization） 准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为原始的两性生殖方式，它可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。 准性生殖常见于某些真菌，尤其是半知菌中。准性生殖的过程：准性生殖的过程：①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体 ④体细胞交换和单倍体化。 准性生殖与有性生殖的比较准性生殖与有性生殖的比较 项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的 形态或生理上有 体细胞 分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体 与单倍体 基本相同 明显不同 双倍体变单倍体 的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现， 正常出现， 几率低 几率高null第四节 基因工程 一 基因工程定义 基因工程（genetic engineering） ： 又称遗传工程。是指人们利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、操纵、改造和重建细胞的遗传核心 — 基因组，使生物体的遗传性状发生定向变异，以满足于人类的需要。 null二 基因工程的基本操作 1、目的基因的取得 2、优良载体的选择 3、目的基因与载体DNA的体外重组 4、重组载体导入受体细胞 5、重组受体细胞的 筛选和鉴定 6、“工程菌”或“工程细胞”的大规模培养null三、 基因工程的应用 三、 基因工程的应用 1、在生产多肽类药物、疫苗中的应用 2、改造传统工业发酵菌种 3、动、植物特性的基因工程改良 4、基因工程在环境保护中的应用 null试述微生物在基因工程中的重要地位。 微生物和微生物学在基因工程中的重要性是极其显著的，甚至是无法取代的，从以下五方面就可得到充分的证实： ①载体—能充当基因工程供体DNA载体的，如果不是微生物本身（如病毒和噬菌体），就必然是微生物细胞中的质粒； ②工具酶—被誉为基因工程中的“解剖刀”和“缝衣针”的千余种特异工具酶，几乎均来自各种微生物；null③受体—作为基因工程中的受体，至今用得最多的都是具有优越体制、培养容易和能高效表达供体性状的各种微生物细胞，尤其是E．coli、Bacillus subtilis和Saccharomyces cerevisiae三种常见微生物和微生物化的高等动物、植物单细胞株； ④微生物工程—作为基因工程的直接成果仅是一株带有新性状的“工程菌”或“工程细胞”，而要它们进一步发挥巨大的经济效益和社会效益，就必须通过微生物工程（或称发酵工程）才能实现；null⑤目的基因的主要供体—尽管在基因工程中外源基因可以是任何生物对象，但是由于微生物代谢多样性和遗传多样性等方面具有独特优势，尤其生长在极端环境下的微生物—嗜极菌的重要基因优势，所以微生物却是一种常用的独特基因供体，而且整个微生物界将是一个最为富饶的和最重要的外源基因供体库。null第五节 菌种的衰退、复壮和保藏 一 菌种的衰退、复壮 菌种衰退的原因是什么？如何区分衰退、饰变与杂菌污染？ 菌种衰退的原因 （1）有关基因的自发突变 （2）育种后未经很好的分离纯化 （3）培养条件的改变 （4）污染杂菌null区分衰退、饰变与杂菌污染 衰退指由于自发突变的结果而使某物种原有一系列生物学性状发生量或质变的现象。     饰变是指不涉及及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。 杂菌污染则是指混入其它菌。 null 菌种是一个国家所拥有的重要生物资源 菌种保藏是一项重要的微生物学基础工作 菌种保藏机构的任务是在广泛收集实验室和生产菌种、菌株（包括病毒株甚至动、植物细胞株和质粒等）的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的 为此，在国际上一些工业较发达的国家中都设有相应的菌种保藏机构。例如： 中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM）， 美国典型菌种保藏中心（ATCC）， 二、菌种保藏null菌种保藏机构 有关国家有代表性的菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM） 我国CCCCM （China Committee for Culture Collection of Microorganisms） 采用斜面低温保藏法、 冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进行菌种保藏。 美国典型菌种保藏中心（ATCC） 美国ATCC（American Type Culture Collection）采用冷冻干燥保藏法和液氮保藏法来保藏所有菌种。null “ATCC”是一个什么组织？其菌种保藏方法有几种？有何优点？ “ATCC”是美国典型菌种保藏中心 在国际著名的美国ATCC（American Type Culture Collection）中，目前已改为仅采用两种最有效的方法，即保藏期一般达5～15年的冷冻干燥保藏法和保藏期一般达20年以上的液氮保藏法，以达到最大限度地减少传代次数和避免菌种衰退的目的。 nullnull菌种保藏的常用方法： （1）斜面冰箱保藏法： 将菌种接在适当的斜面上，待其生长丰满后，可放在4℃冰箱中保藏。此法一般可保藏1-6个月左右，各类菌种均可用此法进行保藏。简便。 （2）半固体穿刺保藏法： 将菌种接入半固体直立柱中，然后进行培养。待长好后，放入4℃冰箱中保藏。此法可保藏6-12个月，它适用于细菌、酵母的菌种保藏。简便。 null（3）石蜡油封存法： 如果将无菌石蜡油加入到上述保藏的菌种中，使菌种与空气隔绝，则保藏效果更佳，一般可保藏1-2年。根据同样的道理，用灭菌的橡皮塞代替棉花塞，效果更好。此法适用于各类菌种的保藏。（对石油发酵微生物不适宜）简便。较简便。 （4）甘油悬液保藏法： 此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。采用－70℃，保藏期可达10年。null（5）砂土管保藏法： 取过筛河砂，用10%盐酸浸泡，用水洗净后，烘干。再取瘦土，以4：1量混合，装入小试管、灭菌后，滴入几滴菌种悬液，用接种针搅匀。然后放入干燥器中，抽气干燥，放入低温保藏。此法一般可保藏1-10年。它适用于产生孢子的微生物的保藏。简便有效。 （6）冷冻干燥保藏法： 将高浓度的菌液装入灭菌的安瓿瓶中，放在低温条件下抽气干燥，其中的水分因升华而逸出，形成完全干燥的菌块，然后将安瓿瓶在真空条件下融封。这种方法因菌体内的水分全部被抽掉，无法进行任何代谢作用，所以保藏期很长，一般在5-10年以上。它适用于各大类微生物的保藏。繁而高效。null（7）液氮超低温保藏法： 简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（－196℃）下保藏的方法。适宜于各大类微生物保藏。保藏期10年以上。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。繁而高效。null