8、微生物遗传

null第八章 微生物遗传 Microbial heredity第八章 微生物遗传 Microbial hereditynull第一节 遗传的物质基础 第二节 原核生物的基因重组 第三节 真核微生物的基因重组 第四节 重组DNA技术第一节 遗传的物质基础第一节 遗传的物质基础种质连续理论：1883~1889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。 基因学说：1933年 Morgan发现了染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。 　 染色体是由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列核组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因的活性成分是蛋白质。 DNA是遗传的物质基础的证明：1944年以后，利用微生物为实验对象进行的三个著名实验一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验　　 遗传的物质基础是核酸，通过以下三个经典实验加以证明 。 　１、肺炎球菌的转化试验 　２、噬菌体感染试验 　３、植物病毒的拆开与重建试验一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验null（一）经典转化实验（transformation）： 1928年　F.Griffith， 研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌） S型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性 R型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性Griffith转化试验示意图Griffith转化试验示意图R型活菌S型活菌S型热死菌S型热死菌+R型活菌S型活菌（2）细菌培养实验 （1）动物实验 对小鼠注射活R菌或死S菌 ————小鼠存活 对小鼠注射活S菌————————小鼠死亡 对小鼠注射活R菌和热死S菌 ———小鼠死亡 抽取心血分离 活的S菌热死S菌—————不生长 活 R 菌—————长出R菌 热死S菌—————长出大量R菌和少量S菌（2）细菌培养实验平皿培养+活R菌null（3）S型菌的无细胞抽提液试验实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状，转变为S型细胞。活R菌+S菌无细胞抽提液——长出大量R菌和少量S菌null①加S菌DNA ②加S菌DNA及DNA酶以外的酶 ③加S菌的DNA和DNA酶 ④加S菌的RNA ⑤加S菌的蛋白质 ⑥加S菌的荚膜多糖 活R菌长出S菌只有R菌1944年O.T.Avery等从热死S型S. Pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分,并在离体条件下进行了转化试验:nullAvery的实验说明： 只有S型细菌的DNA才能将S. Pneumoniae的R型转化为S型;且DNA纯度越高，转化效率也越高。 也说明S型菌株转移给R型菌株的决不是遗传性状的本身，而是以DNA为物质基础的遗传信息。null（二）噬菌体感染实验1952 年Hershey和Chase利用示踪元素，对大肠杆菌 T2 噬菌体进行了这类实验。　1、将E.coli分别培养在以放射性32PO43-或35SO42-作为磷源或硫源的组合培养基中. 2、让 T2 噬菌体侵染培养后的E.coli ，从而使 噬菌体打上 35S 和 32P 的标记。 　3、标记的噬菌体再侵染不含标记元素的E.coli ，并在完成吸附和侵入后， 强烈搅拌洗涤，以便使吸附在菌体外表的 噬菌体蛋白质外壳脱离细胞并均匀分布，再进行离心沉淀，分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记。以35S标记蛋白质外壳噬菌体做感染实验沉淀中含 25%放射性以35S标记蛋白质外壳噬菌体做感染实验（1）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中上清液中含 75%放射性null（2）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中上清液中含 15%放射性沉淀中含 85%放射性以32P标记DNA的噬菌体做感染实验null　 实验结果：几乎全部 35S 都在上清液中，而几乎全部 32P 和细菌一起出现在沉淀物中。 　 实验说明：在其DNA中，含有包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。（三）植物病毒的重建实验（三）植物病毒的重建实验　　1956年，H. Fraenkel-Conrat用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了植物病毒重建实验。 　　具体步骤： 　　将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒： 选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒： （1）RNA（TMV）­ 蛋白质（HRV） （2）RNA（HRV）­ 蛋白质（TMV） 用两种杂合病毒感染寄主： （1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子 （2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。 结果说明，RNA也是遗传的物质基础结　论结　论　　通过这三个具有历史意义的经典实验，得到一个确信无疑的共同结论： 　　只有核酸才是负载遗传信息的真正物质基础。 微生物与高等生物具有共同的遗传本质。 nullPrusiner (1982)提出羊搔痒病因子是一种蛋白 质侵染颗粒(proteinaceous infectious particle), 并将之称做Prion或Virino。-------朊病毒1997年，Stanley B. Prusiner荣获诺贝尔奖null朊病毒的发现和思考:1）蛋白质是否可以作为遗传物质？ prion是生命的一个特例？ 还是仅仅为表达调控的一种形式？ 2）蛋白质折叠与功能的关系,是否存在折叠密码？ 朊病毒 一种具有传染性的蛋白质致病因子已知的传染性疾病的传播因子必须含有核酸null二、DNA的结构与复制A：腺嘌呤 T：胸腺嘧啶 C：胞嘧啶 G：鸟嘌呤 A-T（U） C-GDNA的双螺旋结构null1、DNA双螺旋结构理论 两条走向相反的多核苷酸链，以右手方向沿同一轴心平行盘绕成双螺旋，螺旋直径为2nm 两条链间借碱基对氢键相连。A与T之间有二个氢键，G与C之间有三个氢键。(RNA链中A与U之间为二个氢键，G与C之间为三个氢键)。这种碱基相配的关系称为碱基互补或碱基配对 一个DNA分子可含几十万或几百万个碱基对，两个相邻的碱基对之间的距离为0.34nm，每个螺旋的距离为3.4nm，包括10个碱基对。null2、 DNA的存在形式真核生物的DNA与组蛋白、非组蛋白结合形成染色体，DNA与组蛋白构成核小体，外有核膜包围，存在于细胞核中。 原核生物的DNA一般不与组蛋白结合，所形成一条环状染色体没有核膜包围，高度折叠形成一个核区。null4、遗传信息的传递生物体的遗传信息大多都贮存在DNA上，只有少数病毒的遗传信息贮存在RNA上。遗传信息的传递可概括为三个步骤，以DNA为例说明（分子遗传学的中心法则）： 将携带遗传信息的DNA复制；      将DNA携带的遗传信息转录到RNA上；    将RNA获得的信息翻译成蛋白质——中心法则。 null三、转录1、RNA聚合酶：大肠杆菌：α2ββˊσ 真核生物：RNA polyⅠ、Ⅱ、Ⅲ 2、启动子 原核生物：-10区 -35区 真核生物：TATA box（-25附近） CAAT box（-70附近） 3、终止子 不依赖ρ因子—强终止子 依赖ρ因子—弱终止子null4、转录过程：起始、延长、终止 5、转录后加工 原核生物：转录和翻译同步进行，形成多顺反子； 真核生物：5ˊ端加帽，3ˊ端加尾，剪切内含子连接外显子，形成单顺反子。null四、翻译1、氨酰t-RNA的合成 2、肽链合成起始 3、肽链合成延伸 4、肽链合成终止与释放null第二节 原核生物的基因重组一、基因组概念基因组（genome）: 一个物种的单倍体的所有染色体及其所包含的遗传信息的总称。 原核生物(如细菌),多为单倍体(在一般情况下只有一条染色体)；真核微生物,多条染色体,例如啤酒酵母有16条染色体，有时为双倍体 null二、微生物基因组结构的特点1、原核生物(细菌、古生菌)的基因组 1)染色体为双链环状的DNA分子(单倍体); 链环状的染色体在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中，该小体称为拟核(nucliod)，其上结合有类组蛋白蛋白质和少量RNA分子，使其压缩成一种手脚架形的致密结构。 2)基因组上遗传信息具有连续性; 一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。 微生物基因组DNA绝大部分用来编码蛋白质、RNA;用作为复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别和结合的位点等信号序列。null3)功能相关的结构基因组成操纵子结构; 操纵子(operon): 功能相关的几个基因（结构基因）前后相连,再加上一个共同的调节基因和一组共同的控制位点（启动子、操纵基因等）在基因转录时协同动作。 4)结构基因的单拷贝,rRNA基因的多拷贝; 5)基因组的重复序列少而短。 null2、真核生物（啤酒酵母）的基因组1）DNA与组蛋白构成染色体 2）有间隔子或内含子序列 3）没有明显的操纵子结构 4）含有一定数量的重复序列（低度、中度和高度重复） 遗传丰余：较高同源性的DNA重复序列null3、古细菌（詹氏甲烷球菌）的基因组1）古细菌的基因组结构类似于细菌，即在环形DNA分子上功能相关的基因组成操纵子结构，无内含子序列。 2）负责信息传递功能的结构（复制、转录和翻译）类似于真核生物，如启动子结构、复制起始因子、RNA聚合酶、翻译延伸因子等null一、质粒的分子结构定义：是一类小型共价闭合环状(covalently closed circle,简称CCC)的超螺旋双链核外DNA分子，能独立于细胞核进行自主复制。 一般有超螺旋(CCC)、线性（linear form,L）、环状(open circular form,OC)，三种形态。 大小：约为2-100×106 Dalton，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。三、染色体外遗传物质null二、性质 ①可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在； ②质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种， 严紧型质粒：复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个（1-5）个拷贝； 松弛型质粒：复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到10-200个或更多。 ③可成为基因工程的载体 ④对于细菌的生存并不是必要的 ⑤功能多样化null基因重组（gene recombination）：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式。 重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。重组是分子水平上的一个概念。 杂交（hybridization）则是细胞水平上的一个概念。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。 真核微生物中的有性杂交、准性杂交等原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。四、原核生物基因重组null基因重组是杂交育种的理论基础。 杂交育种的优点：①由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，故在方向性和自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。②利用杂交育种可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象 杂交育种的缺点：杂交育种的方法较复杂，目前还没有得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。到了70年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。基因重组的意义null（一）细菌的接合作用(conjugation) 通过供体细菌和受体细菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA 的过程。 在细菌中，接合现象研究最清楚的是大肠杆菌。发现能够进行接合现象的大肠杆菌有雄性与雌性之分，而决定它们性别的是由是否存在 F 因子所决定。 null1.实验证据1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Tatum E.coli k12的多重营养缺陷型杂交实验中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。null证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（ Bernard Davis，1950 ）null接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。 F 因子--又称致育因子，是一种质粒，分子量为 5×107 Da；既可以在细胞内独立存在, 具有自主的与染色体进行同步复制和转移到其他细胞中的能力,也可插入(即整合)到染色体上。 含有F因子--雄性细菌含有游离存在的F 因子，称为F + 菌株，有性菌毛 不含F因子--雌性细菌不含F 因子，称为F - 菌株，不产生性菌毛，可接受外来F质粒。 2.接合机制nulla）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株； b）F+菌株(“雄性”菌株)， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。 c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上,因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。 d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因 子。 细胞表面同样有性菌毛。以F′因子来传递供体菌基因的方式，称为F因子转导或性导。。 F因子的四种细胞形式 null1） F+×F-杂交 F+ ＋ F+ a) F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用； b) F因子的转移:双链之一被切断，一条链进入F-细菌 c）进入F-细菌中的一条链复制出互补链,F-成为F+ d）原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制null2）Hfr ×F-杂交 Hfr＋ F- Hfr菌株仍保持着F+细胞的特征。 当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区和染色体DNA向受体细胞转移。 F因子除先导区外，绝大部分处于转移染色体的末端，因转移过程常被中断，故F因子不易转入受体细胞中。 Hfr×F-杂交后的接合子多数仍然是F-。 染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。null中断杂交（interrupted mating）技术利用Hfr×F-的接合过程,在不同时间取样,并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌,然后受体细菌基因型,以时间(分钟)为单位绘制遗传图谱,该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。null大肠杆菌基因组 很大(全部转移需要100分钟),其遗传图谱须用多株F因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成null3）F′×F-杂交 F′＋ F′ F′×F-与F+×F-的不同： 供体的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞 a）与染色体发生重组； b）继续存在于F′因子上，形成一种部分二倍体；细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）null(二) 细菌的转导（transduction）由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式:一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。 能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体（转导子）。 根据媒介噬菌体的不同，转导的方式分为： 普遍转导 转导 局限转导 null由缺陷型噬菌体误包（而非整合）供体细菌DNA 中的任何一部分片段（包括核外遗传物质在内）后，当它再次感染受体细菌时，使后者获得了这部分遗传性状的现象，称为普遍性转导。它的转导频率为 10-5～10-8。 意外的发现： 1951年,Joshua Lederberg和Norton Zinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用,用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行的实验 用“U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！ 1、普遍性转导（generalized transduction）null实验过程： 以其野生型菌株作为供体菌 营养缺陷型菌株作为受体菌 P22噬菌体作为转导媒介，对供体菌是烈性噬菌体，对受体菌是温和噬菌体 噬菌体裂解第一个宿主时可能有三种情况： 1）包入的完全是噬菌体的DNA（正常噬菌体） 2）包入的完全是细菌DNA（完全缺陷噬菌体） 3）部分带有噬菌体基因的DNA（部分缺陷噬菌体） 转导分别是由后两种噬菌体参与进行的。 原因：噬菌体的DNA包装酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点并进行切割,以“headful”的包装机制包装进P22噬菌体外壳,形成缺陷噬菌体。null结果： 由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体细胞不会发生往常的溶原化，也不显示其免疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体；而由于导入的外源DNA片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，在通过双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。null转导模型null普遍性转导的三种后果：外源DNA被降解，转导失败完全转导流产转导转导DNA不能进行重组和复制,但其携带的基因可经过转录而得到表达。能在选择性培养基平板上形成微小菌落null溶原菌经诱导后，少数前噬菌体从宿主染色体脱落时产生错误切割，把宿主的某些基因整合到噬菌体的基因组上，当这样的噬菌体侵染另一宿主菌时，噬菌体 DNA 与受体菌的 DNA 同源区段配对，通过双交换而整合到受体菌的染色体组上，使受体菌获得了供体的这部分遗传特性，从而形成转导子，它的转导频率为 10-6。2、局限性转导（specialized transduction）如：λ前噬菌体位点两端是细菌染色体的gal＋和bio＋，经诱导后噬菌体与寄主DNA分离。但在极低的频率下会出现错切，从而使邻接的的细菌DNA（包含gal或bio基因）被一起切除转导至受体菌。nullnull局限性转导与普遍性转导的主要区别:null溶源转变与转导的不同？温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化,因噬菌体的基因整合到宿主染色体上,而使后者获得了新性状的现象。a)不携带来自供体菌的外源基因，是噬菌体自身基因使宿主获得新性状 b)当宿主丧失其原噬菌体时，通过溶源转变而获得的新性状也随之消失 c）这种噬菌体是完整的,而不是缺陷的 d）获得新性状的是溶源化的宿主细胞，不是转导子 溶源转变：null（三）细菌的遗传转化（genetic transformation）转化：指同源或异源的游离DNA分子（质粒和染色体DNA）被自然或人工感受态细胞提取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。这些被转化的游离的DNA片段称为转化因子 。转化后的受体菌，称为转化子。 1928年,Griffith发现肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae）的转化现象null进行转化，需要二方面必要的条件： 1、建立了感受态的受体细胞 感受态细胞：受体菌最容易接受外源DNA片段并实现转化的生理状态称为感受态。 自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制； 人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，常用CaCl2法，电穿孔。 2、外源游离DNA分子（转化因子） 转化因子通常是双链DNA。 null转化过程： ① 从供体菌提取出转化因子双链DNA片段； ② 吸附：双链DNA 片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合； ③ 切割：在结合位点上，双链DNA 中的一条单链逐步降解，同时另一条链逐步进入受体细胞。 ④ 入胞、重组：进入受体细胞的DNA 单链与受体菌染色体组上同源区段配对，而受体菌染色体组的相应单链片段被切除，并被进入受体细胞的DNA 单链所取代，于是形成了杂种DNA 区段； ⑤ 复制：受体菌染色体进行复制，其中杂种区段被分离成两个，一个恢复，一个形成一个转化子。 null转染(transfection)：把噬菌体或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒的后代。 与转化的区别： 病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌 中间不发生任何遗传因子的交换或整合 最后不产生具有杂种性质的转化子 null 在微生物的有性繁殖过程中，不同的性细胞间的接合，并随之发生染色体的重组，从而产生新遗传型后代的现象，称有性杂交。 凡是能产生有性孢子的酵母菌和霉菌，都能进行有性杂交。 有性杂交在生产实践中被广泛用于优良品种的培育。 例如用于酒精发酵的酵母菌和用于面包发酵的酵母菌同属一种啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的两个不同菌株，面包酵母的特点是对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生CO2多，生长快；而酒精酵母的特点是产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的发酵力弱，所以酿酒厂生产酒精后的酵母，不能供面包厂作引子用。通过两者的杂交，就得到了既能生产酒精，又能将其残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。（一）有性杂交 第三节 真核微生物的基因重组（二）准性生殖（二）准性生殖是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。它是类似于有性生殖，但比之更为原始的一种生殖方式，它可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。在半知菌类中最为常见。 准性生殖过程： 1．菌丝联结 发生在一些形态上没有区别的，但在遗传性状上可以有差别的两个同种亲本的体细胞（单倍体）间。 null2．形成异核体 两个单倍体细胞经联结后，使原有的两个单倍体核集中到同一个细胞中，形成双相的异核体。异核体能够独立生活。 异核体：同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长。 同核体：同一菌丝中只有一种核。 异核体的特点： 1）具有感受性的两种菌丝间才可形成异核体； 2）具有野生型性状，可在基本培养基上生长 ； （基因互补功能） 3）大多数异核体的分生孢子不能在基本培养基上生长；如能生长，则为异核体、或为杂合二倍体（重组子）。 null3．核融合 在异核体中的双核融合，产生双倍体杂合子核。核融合后产生杂合子核的频率也是极低的，如构巢曲霉和米曲霉为 10-5～10 -7 。 4．体细胞重组和单倍体化 双倍体的杂合子极不稳定，在进行有丝分裂时，极少数核中的染色体会发生染色体交换和单倍体化，从而形成极个别具有新遗传性状的单倍体杂合子。杂合二倍体只有相对的稳定性，在其繁殖过程中虽不进行减数分裂，但在有丝分裂中可以发生染色体交换和染色体单倍化，从而形成各种分离子。 ABA+BABABABABAB（同核体）（异核体）（杂合二倍体）单倍体杂合子nullnull准性生殖与有性生殖的比较null第四节 重组DNA技术即基因工程技术（gene engineering） 是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。 null获得目的基因 选择基因载体 体外重组 外源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪） 筛选和鉴定 应用（转基因植物、动物）一、基因工程的基本操作： null1、获取null2、重组null3、转化null4、筛选null5、克隆null6、表达null1997年英国I. Wilmut等，用绵羊乳腺细胞的细胞核移植到去细胞核的卵细胞中，成功得到了克隆羊“多莉”。动物克隆技术 nullnull二、PCR扩增技术 1984，穆利斯（Mullis）发明了聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)——在体外快速扩增特定DNA序列的新技术。null 1、PCR扩增原理 如果DNA片段两端的序列是已知的，采用PCR就可将此DNA片段扩增出来。 PCR过程需要合成两个寡聚核苷酸作引物，并各自与所要扩增的靶DNA片段的末端互补。 引物与模板DNA相结合并沿模板DNA延伸，以扩增靶DNA序列。 DNA 片段以 2 的指数增长，重复 25~30 次循环，扩增的 DNA 片段拷贝数可增至 10 6 -10 7 倍。null2、PCR扩增过程 (1)变性(denaturation) 加热，模板DNA经热变性，双链被解开，成为两条单链。92~96℃ (2)退火(annealing) 温度下降，寡核苷酸引物与模板DNA中所要扩增序列两端的碱基配对。 40~60℃ (3)延伸(extension) 在适宜条件下，引物3‘端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。65~72℃nullnull三、基因定位诱变 使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。 1、寡核苷酸指导的定位诱变 应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一个部分。 nullnull2、盒式诱变(cassette mutagenesis)利用人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段（即盒），取代野生型基因的相应序列。 由于将盒插入到基因某一位置，也会产生基因的插入突变，插入一般使用抗药性基因的盒，以使宿主产生相应的表型。nullnull3、PCR定点诱变采用重叠延伸法。将特定突变直接导入克隆在原载体上的目的基因。 设计含有突变的两个引物A和A’，且是相互重叠，经PCR反应后，得到的两个片段可以互为引物再次PCR，得到的含有突变碱基的双链DNA，再加入引物B和C扩增，使突变产物进一步增加。nullnull思考题1、证明DNA为遗传物质的三个经典实验是什么？ 2、原核生物基因重组有哪几种形式？ 3、中断杂交原理是什么？ 4、普遍转导和局限转导的异同？ 5、细菌的转导和转化的异同？ 6、真菌的准性生殖过程是什么？ 7、DNA重组技术原理？ 8、什么是基因定位诱变？PCR定点诱变机理？