中药五白散对308nm准分子激光诱导色素沉着动物模型的影响_查伟锋

收稿日期:2011 － 11 － 11 作者简介:查伟锋(1985 －) ，男，浙江临安人，硕士研究生，研究方 向:中西医结合防治皮肤病及激光美容。 通讯作者:宋为民(1968 －) ，男，浙江宁海人，副主任医师，硕士研 究生导师，研究方向:中西医结合防治皮肤病及激光美 容。 经和神经分泌组织的活性水平居中，最低值见于非神经组 织、血清和脊髓液。它被发现在与神经内分泌组织起源有 关的肿瘤中，特别是 SCLC中有过量的 NSE表达，导致血清 中 NSE明显升高。 本项目结果显示，tPNS 能诱导 MSCs 转变为类似于神 经元样的形态，经免疫组织化学鉴定，大多数细胞表现为 NF － M、NSE、nestin、MAP － 2 和 GAP － 43 染色阳性，并在胞 质和突起中有棕黄色的物质。SABC法显示 NSE和 MAP － 2阳性细胞数分别为(72． 64 ± 2． 04)%和(73． 5 ± 2． 17)%。 提示三七总皂苷在体外能使 MSCs 向神经元样细胞转化， 且具有神经元样细胞的特性，这为 MSCs 治疗相关疾病提 供了理论基础。 参考文献 ［1］ Martin DR，Cox NR，Hathcock TL，et al． Isolation and charac- terization of multipotential mesenchymal stem cells from feline bone marrow［J］． Exp Hematol，2002，30:879 － 886． ［2］ 撒亚莲，李海标．三七总皂苷诱导骨髓间质干细胞分化为神 经元样细胞［J］．中山医科大学学报，2002，23(6) :409 － 410， 437． ［3］ Woodbury D，Schwarz EJ，Prockop DJ，et al． Adult rat and hu- man bone marrow stromal cells differentiate into neurons［J］． J Neurosci Res，2000，61 (4) :364 － 370． ［4］ Yuehua Jiang，Balkrishna N，Jahagirdar R，et al． Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow． Nature， 2002 (6893) ，418:41 － 49． ［5］ 项平，李海标．黄连素诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样 细胞［J］．中国病理生理杂志，2004，20(1) :51 － 53． ［6］ 国家药典委员会． 中华人民共和国药典:1 部［S］． 北京:化 学工业出版社，2000:10． ［7］ 施雪英，陈先文，胡慧敏，等．三七总皂苷和维甲酸联合诱导 大鼠 MSCs分化为神经元样细胞［J］． 中国病理生理杂志， 2007，23(3) :612 － 613． ［8］ Makino S，Fukuda K，Miyoshi S，et al． Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro［J］． Clin Invest， 1999，103(5) :697 － 705． ［9］ 项鹏，夏文杰，王连英，等．丹参注射液诱导间质干细胞分化 为神经元样细胞［J］．中山医科大学学报，2001，22(5) :321． ［10］ 项平，撒亚莲，黄锦桃，等．三七总皂苷诱导 MSCs分化为神 经元样细胞时胞内钙离子浓度变化的研究［J］．中国组织化 学与细胞化学杂志，2005，14(3) :241 － 244． 第 30 卷 第 4 期 2 0 1 2 年 4 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 4 Apr． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 893 学 刊 中药五白散对 308nm准分子激光诱导 色素沉着动物模型的影响 查伟锋1，宋为民2，艾俊俊3，郑俊惠2，胡玲玲2 (1．浙江中医药大学，浙江 杭州 310053;2．杭州市第三人民医院，浙江 杭州 310009; 3．安徽医科大学杭州临床学院，浙江 杭州 310009) 摘 要:目的:探讨中药五白散对 308nm准分子激光诱导的色素沉着豚鼠模型的影响。方法:308nm 准分子 激光诱导色素沉着豚鼠模型。造模成功后，色素沉着区分为单纯基质乳膏组、2%氢醌组和中药五白散组，分别对 应外涂于皮损区。外用治疗 30 天后，对各组的黑色素指数、黑素细胞、黑素颗粒及皮肤组织病理学检查观察药物 的疗效和安全性。结果:五白散可降低黑色素指数水平，抑制黑素细胞活性，减少黑素生成，减轻 UVB 所致皮肤 色素沉着的程度。结论:中药五白散对 308nm准分子激光诱导豚鼠色素沉着有明显的改善作用，其机制可能是 一定程度上抑制酪氨酸酶活性，减少黑素生成。 关键词:色素沉着;308nm准分子激光;中药;动物模型 中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1673 － 7717(2012)04 － 0893 － 03 Influence of Wubai Powder on Pigmentation Animal Model induced by 308nm Excimer Laser ZHA Wei-feng1，SONG Wei-min2，AI Jun-jun3，ZHENG Jun-hui2，HU Ling-ling2 (1． Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，Zhejiang，China; 2． Hangzhou No． 3 People＇s Hospital，Hangzhou 310009，Zhejiang，China; 3． Hangzhou Clinical College Affiliated to Anhui Medical University，Hangzhou 310009，Zhejiang，China) 398 第 30 卷 第 4 期 2 0 1 2 年 4 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 4 Apr． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 894 学 刊 Abstract:Objective:To observe the influence of Wubai Powder on pigmentation animal model induced by 308nm ex- cimer laser． Methods:308nm excimer laser induced pigmentation animal model． After establishing the model，the areas of pigmentation were divided into 3 group:single matrix cream group，2% hydroquinone group and Wubai Powder group，and daubed them on corresponding lesions． After treamting for 30 days，the efficacy of the tested drug was evaluated compre- hensively by measurements of melanin index，melanocyte，melanin as well as the histopathology of skin． Result:It was shown that the tested drug can decrease the level of melanin index，restrain the activity of melanocyte，reduce the genera- tion of melanin and relieve pigmentation caused by UVB． Conclusion:Wubai Powder had obvious treatment function on 308nm excimer laser － induced pigmentation，its mechanism was to inhibit the activity of tyrosinase，which decreased mel- anin generation． Key words:pigmentation;308nm excimer laser;traditional Chinese herb;animal model 近年来中药对皮肤色素沉着的改善作用被广泛关注， 临床上外用中药美白制剂治疗黄褐斑等皮肤色素沉着有 效。本研究选择对酪氨酸酶活性有显著抑制作用的 5 味中 药，制成外用乳剂五白散，应用于 308nm 准分子激光诱导 的皮肤色素沉着动物模型，通过观察黑色素指数、黑素细胞 及黑素颗粒变化，可确定本实验模型是否建立成功，并通过 以上各观察指标客观评价药物作用。 1 与方法 1． 1 材料 1． 1． 1 实验动物 采用普通级健康雄性棕黄色豚鼠 20 只，8 周龄，体质量 220 ～ 240g，由浙江中医药大学实验动物 中心提供，委托该中心饲养。每只实验动物背部取 3 块相 离区域，308nm准分子激光造模后外涂药物。 1． 1． 2 实验药物 中药五白散由白芨、白芷、白蔹、白附子 和白僵蚕组成，经杭州市第三人民医院制剂室制成乳膏制 剂;2%氢醌乳膏购自广东人人康药业有限公司生产，国药 准字 H20040088，生产批号 20100802;单基质乳膏由杭州市 第三人民医院制剂室提供。 1． 1． 3 主要仪器 XTRAC巅峰 308nm准分子激光治疗系 统(PhotoMedex，USA) ;MPA9 型皮肤多功能生理测试仪 (CK，GERMANY) ;共聚焦激光扫描显微镜(vivascope l500， USA) 1． 2 方法 1． 2． 1 动物模型制作 使用 XTRAC 巅峰 308nm 准分子 激光治疗系统造模。电动剃刀将豚鼠背部棕色粗毛剃除， 再以脱毛膏脱去短毛使背部皮肤充分暴露。308nm准分子 激光治疗头直接与豚鼠背部皮肤接触，照射能量 400mJ / cm2，每周 1 次，共 3 次。每次照射前均需脱毛暴露皮肤。 1． 2． 2 动物分组和给药 每只实验动物背部取 3 块相离 区域，分别给予单纯基质乳膏，2%氢醌乳膏和中药五白散 外涂。于造模成功后开始外用药物，每日 1 次，持续 30 天， 间隔 3 天脱毛 1 次。 2 检查指标 2． 1 黑色素指数测定 使用 MPA9 型皮肤多功能生理测试仪，于造模前后及 用药 30 天后测定豚鼠背部实验区的皮肤黑色素指数。 2． 2 活体下黑色素及黑素细胞观察 采用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM) ，动态观察造模 前后和用药 30 天后豚鼠背部试验区皮肤的黑色素和黑素 细胞的变化情况。 2． 3 组织病理观察 豚鼠皮肤常规石蜡切片，硫酸亚铁染色，光镜下观察黑 色素变化。 3 统计学方法 所有数据采用 SPSS 16． 0 软件进行统计。各组间 采用 t检验进行比较，数据用均数 ±标准差(珋x ± s)表示，P ＜ 0． 05 为有统计学差异。 4 结 果 4． 1 皮肤颜色变化 豚鼠背部皮肤 308nm 准分子激光照射(总能量 1200mJ /cm2)。照射后 1 天，照射部位出现红斑，4 ～ 5 天肉 眼红斑消退，6 天后开始出现色素沉着，3 次照射后色素沉 着稳定，开始用药。单纯基质乳膏组，30 天后未见明显色 素减退;2%氢醌组，用药 4 ～ 6 天左右出现发红、脱屑，30 天后色素沉着不明显;中药五白散组未见明显发红、脱屑， 用药 30 天后色素沉着减退。 4． 2 造模前后及用药后各组间黑色素指数比较 308nm准分子激光照射后皮肤黑色素指数较照射前显 著升高(P ＜0． 01)见表 1。单纯基质乳膏外用后 30 天，黑色 素指数稍下降甚至未下降;2%氢醌连用 30 天后，黑色素指 数较单基质乳膏组明显下降(P ＜ 0． 01) ;中药五白散组与单 纯基质乳膏组相比黑色素指数明显下降(P ＜ 0． 01) ，但与 2%氢醌组比较，差别没有统计学意义(P ＞0． 05)见表 2。 表 1 造模前后豚鼠皮肤黑色素指数比较(珋x ± s) 组别 n 黑色素指数 照光前 60 164． 80 ± 55． 99 照光后 60 340． 70 ± 99． 52* 注:与照光前比较，* P ＜ 0． 05。 表 2 各组 30 天后黑色素指数比较(珋x ± s) 组别 n 黑色素指数 单纯基质组 20 315． 50 ± 92． 33 2%氢醌组 20 217． 20 ± 78． 24* 中药组 20 242． 55 ± 74． 42* 注:与单纯基质组比较，* P ＜ 0． 01。 4． 3 CLSM下治疗前后各组黑素细胞及色素颗粒观察 CLSM能非创伤性实时动态观察活体表皮和真皮浅层 498 第 30 卷 第 4 期 2 0 1 2 年 4 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 4 Apr． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 895 学 刊 的多种生理病理变化，尤其在色素性疾病的检查上有独特 优势。308nm准分子激光照射后，CLSM下豚鼠表皮基底层 可见大量树枝状黑素细胞及色素颗粒，黑素细胞功能活跃; 与治疗前相比，单纯基质乳膏外用后 30 天，黑素细胞和色 素颗粒未见明显变化，而 2%氢醌组与中药五白散组树枝 状黑素细胞数量及色素颗粒明显减少。见图 1。 ①造模前:基底层色素颗粒均匀散在②造模后:基底层见大量色素颗粒和树枝状黑素细胞，高折光性，似黄褐斑样 改变③2%氢醌:色素颗粒减少，残留少许树枝状黑素细胞④中药五白散:色素颗粒减少，局部可见数量不定树枝状黑素 细胞⑤单纯基质乳膏:可见大量折光性强的色素颗粒和黑素细胞。 图 1 CLSM下黑素细胞和色素颗粒改变 4． 4 组织病理学观察 308nm准分子激光照射后黑素颗粒显著增加;单纯基 质乳膏组使用 30 天后未见明显黑素颗粒减少迹象;2%氢 醌组连续应用 30 天，黑素颗粒较外用单纯基质乳膏组明显 减少;中药五白散组外用 30 天后黑素颗粒较单纯基质乳膏 组明显减少。见插页Ⅷ图 2。 5 讨 论 UVB照射豚鼠作为色素沉着实验动物模型已被成功 应用［1 － 3］。本实验采用局部双倍最小红斑量的紫外线多次 照射棕色豚鼠的方法制作动物模型。根据文献资料，豚鼠 UVB的最小红斑量为 200 ～ 300mJ /cm2［4］，实验选择单次 400mJ /cm2剂量，3 次照射的方法所形成的色素沉着稳定、 均匀。 酪氨酸酶是皮肤黑素生物合成的关键酶［5］。抑制酪 氨酸酶活性可阻止皮肤黑素生成。理想的皮肤脱色剂是能 作用于该酶，脱色快速有效且无明显不良反应的制剂。氢 醌是经典的皮肤脱色剂，外用可引起皮肤红斑、脱屑瘙痒和 刺痛，刺激性与浓度及接触时间有关［6］。实验中发现每日 外用 1 次 2%氢醌，4 ～ 6 天左右局部出现发红、脱屑等刺激 性反应。中药五白散由白芨、白蔹、白芷、白附子和白僵蚕 五味中药组成，各药均能有效抑制酪氨酸酶活性。雷铁 池［7］等观察了 82 味中药乙醇提取液对酪氨酸酶活性和黑 素生成量的影响，仅有 11 味在高、中、低 3 个浓度均对酪氨 酸酶活性和黑色素生成量呈剂量依赖性抑制，其中白僵蚕、 白芨和白附子乙醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制率与熊果 苷无统计学差异(P ＞ 0． 05)。张美华［8］等通过观察 48 味 中药水提物对黑素形成的影响，发现 10 味中药对黑素形成 有抑制作用，其中白芷、白蔹和猪苓的作用最强，且与空白 组比较差别有显著性。本实验中，五白散在抑制黑素生成， 降低皮肤色素沉着上效果满意，同时没有出现氢醌常见的 刺激性反应。 综上所述，中药五白散在降低皮肤色素沉着上与氢醌 有类似的功效，能抑制黑素细胞活性和减少黑素颗粒的产 生，并且在用药过程中，对皮肤的刺激性小或无刺激，对色 素增加性皮肤病如黄褐斑的防治有很大指导意义。 参考文献 ［1］ Yokota T，Nishio H，Kubota Y，et al． The inhibitory effect of gla- bridin from licorice extracts on melanogenesis and inflammation ［J］． Pigment Cell Res，1998，11:355 － 361． ［2］ Maeda K，Naganuma M． Topical trans － 4 － aminomethylcyclohex- anecarboxylic acid prevent ultraviolet radiation － induced pigmen- tation［J］． J Photochem Photobiol B，1998，47(2 － 3) :136 － 141． ［3］ Imokawa G，Kawai M，Mishima Y，et al． Differential analysis of experimental hypermelanosis induced by UVB，PUVA，and al- lergic contact dermatitis using a brownish guinea pig model［J］． Arch Dermatol Res，1986，278(5) :352 － 362． ［4］ Tobiishi M，Haratake A，Kaminaga H，et al． Pigmentation in in- trinsically aged skin of A1 guinea pigs［J］． Pigment Cell Res， 2004，17(6) :651 － 658． ［5］ Kubo I，Yokokawa Y，Kinst － Hori I． Tyrosinase inhibitors from Bolivian medicinal plants［J］． J Nat Prod，1995，58(5) :739 － 743． ［6］ 方晶，朱文元，张美华．橙皮苷对中波紫外线诱导豚鼠色素沉 着抑制作用的研究［J］．临床皮肤科杂志，2007，36(3) :141 － 144． ［7］ 雷铁池，朱文元，夏明玉，等． 82 味中药乙醇提取物对酪氨酸 酶活性的抑制作用［J］．中草药，1999，30:336 － 339． ［8］ 张美华，朱文元． 48 种中药水煎剂对体外培养鼠黑素瘤细胞 黑素形成影响的研究［J］．江苏中医，1999，20:44 － 45． 598