DNA的复制

nullnull中心法则 （the central dogma)DNARNAProtein1958 F.Crick 1970 H.Temin (逆转录)第三章 DNA的复制 （ DNA replication）第三章 DNA的复制 （ DNA replication）P131null复 制 概 念 遗传信息从亲代DNA传递到子代DNA分子上，称为复制，这是生物体内高分 子的聚合过程，即DNA的生物合成。 null第一节 DNA复制的基本方式一、半保留复制 （semiconservative replication) 一、半保留复制 （semiconservative replication) 复制时母链的双链DNA解开成各自作为模板指导子代合成互补链； 子代的两条链：亲代链＋新合成链； 由于碱基互补，子代DNA双链和亲代DNA碱基序列一致。null通过半保留复制，子代DNA和亲代的DNA是一致的重新合成的子代链母链null意 义 子代保留了亲代DNA的全部信息； DNA通过复制和基因表达决定生物特性； 体现了遗传过程的相对保守性； 保守性是相对的，不能忽视其变异性。null复制叉移动方向前导链冈崎片段后随链二、半不连续性 （semidiscontimity）不连续复制 连续复制null半不连续复制：在生物中普遍存在的这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制方式，称为DNA合成的半不连续性。概念复制叉、前导链、后随链、冈崎片段nullnull第二节 DNA复制的酶学nullImportant enzyme for DNA replication in Bacteria SSB(单链结合蛋白) for ssDNA DnaA DNA helicase DnaB DnaC DnaG DNA polymerase III DNA polymerase I DNA gyrase DNA ligase null 复制是在酶催化下的核苷酸聚合过程，需要多种高分子物质共同参与。dNTPDNA-pol单链的DNA母链RNA引物其它辅助因子nulldTTP dATP dCTP复制过程中的脱氧核苷酸聚合 代表引物Cnull DNA聚合酶（DNA polymerase） DNA螺旋酶 拓扑酶 引物酶 连接酶 其它相关酶和蛋白质 null一、DNA聚合酶（DNApolymerase）原核生物：DNA-pol I II III 真核生物：DNA-pol αβγδε null原核生物DNA聚合酶nullDNA聚合酶 活性DNA-pol I（ 103kDa）结构特点 1、由18个-螺旋区组成； 2、蛋白酶水解产生2个片段： 小片段：有5`3`外切酶活性 大片段：有DNA聚合酶活性及3` 5`外切酶活性。1956年由Arthur Kornberg首先发现的DNA聚合酶，又称Kornber酶。null主要作用：null一条分子量120kDa的多肽链 活性很低 能促进DNA合成 有3’→5’的外切核酸酶活性，无5’→3’外切酶活性 在DNA的修复中起一定作用 DNA-pol IIKornberg,Gefter, 1970~1971null真正负责大肠杆菌细胞内合成DNA的复制酶（Replicase）； 10种亚基组成的不对称二聚体； 核心酶(core enzyme)：具有核苷酸聚合的作用； 3’→5’外切酶活性。DNA-pol IIIKornberg,Gefter, 1970~1971null E.coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体核心酶(, ε, )nullnullnull    酶活性 5  3 聚合酶活性      3  5 外切酶活性      分子大小（kd） >250 36-38 163-300 170 256 细胞内定位 核 核 线粒体 核 核 功能 后续链 修复 复制 前导链 校读、修 复制 （无其它 复制 复、填补 DNA-pol时）真核生物的DNA聚合酶nullDNA解旋酶/DNA解旋蛋白（DNA unwinding protein）：催化双螺旋DNA的解旋和解链，该过程需水解ATP提供能量。二、DNA解旋酶（DNA helicase）null解旋酶ⅠⅡⅢ和rep蛋白； 解旋酶ⅡⅢ：沿着后随链的模板，从5‘3’方向移动，促使复制叉向前延伸； rep蛋白：沿着前导链的模板，以3‘5’方向向前移动，从而促进双链不断解开。nullnull三、DNA拓扑异构酶（DNA Topisomerase ） 原核和真核生物中都发现二类拓扑异构酶： TopoⅠ和TopoⅡ 原核生物：TopoⅡ与复制有关 TopoⅠ与转录有关 真核生物：TopoⅠ和Ⅱ均与复制有关。 作用：通过切断、旋转和再连接作用，理顺DNA链。 nullDNA拓扑异构酶有两类： 拓扑异构酶Ⅰ：大肠杆菌的ε蛋白 (MW-110000)，作用是暂时切断一条DNA链，形成酶-DNA共价中间物而使超螺旋DNA松弛化，然后再将切断的单链DNA连接起来，不需任何辅助因子。 拓扑异构酶Ⅱ：大肠杆菌中的DNA旋转酶 (DNAgyrase)，能将负超螺旋引入DNA分子，该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，同时需要ATP水解为ADP以供能。nullnullnull DNA结合蛋白对单链DNA有高亲和力，能特异地结合到分开的单链DNA上。对DNA复制区形成的单链DNA有稳定作用。 在真核生物中，一种单链DNA结合蛋白称之复制蛋白A（replication protein A, RPA）结合到暴露的单链上。三、单链DNA结合蛋白 (single- strand DNA binding protein,SSB)null解开、理顺DNA链、维持DNA单链状态null四、DNA引物酶(Primase)引物酶：复制是在一段RNA引物上加入脱氧核苷酸，而催化引物合成的RNA聚合酶。目的：尽量减少DNA复制起始处的突变。null五、DNA连接酶(DNA ligase )DNA连接酶：催化冈崎片段间磷酸二酯键的形成； 注意：连接碱基互补基础上双链中的单链缺口，不能连接单独存在的DNA或RNA单链。null连接酶连接模板链上相邻两个片段的切口 null解螺旋酶：解开DNA双螺旋 DNA拓朴异构酶：理顺DNA链 单链DNA结合蛋白：稳定维持DNA单链状态 前导链的合成：在聚合酶III与滑动夹子结合下连续合成。 尾随链的合成：解旋酶（DnaB）和引物酶（DnaG）沿着模板移动。每1000-2000bp合成一个引物。聚合酶III延伸引物，一直达到前一个冈崎片段为止。聚合酶I去除RNA引物，并填补留下的空隙。连接酶封闭最后缺口。 各种酶与蛋白质的作用小结nullnull 第三节 DNA生物合成过程nullDNA复制的基本过程起始 延长 终止null（一）复制的起始(initiation)一、原核生物的 DNA 生物合成引发体生成引物合成DNA 解链null复制起点和复制子DNA复制要从DNA分子上特定位置开始。这个特定的位置就称为复制起点 (Origin of replication)，用ori表示。 DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止，每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元 (replicon)。 在原核生物中，每个DNA分子上就有一个复制子;而在真核生物中，每个DNA分子有许多个复制子，每个复制子长约50-200kb。因此，真核细胞DNA的复制是由许多个复制子共同完成的。 用分子克隆技术，分离出大肠杆菌染色体DNA复制起点oriC。它由422bp的DNA片段组成，其结构特点为 ： (1)在oriC区域内有一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构 (palindrome)，这表明区域与复制酶系统的识别有关 (2)在oriC区中还有两个转录启动区 (启动子)的核苷酸序列，这暗示了转录可能在大肠杆菌染色体DNA复制起始着双重的作用。 nullnull原核生物复制的相关酶和蛋白质酶及蛋白质（基因） 通用名 功 能 DNA聚合酶 延伸DNA链等 Dna A ( dna A) 辨认起始点 Dna B ( dna B) 解螺旋酶 解开 DNA 双链 Dna C ( dna C) 运送和协同 Dna B Dna G ( dna G) 引物酶 催化 RNA 引物生成 SSB 单链DNA结合蛋白 稳定已解开的单链 DNA 拓扑异构酶（gyr A，B） 理顺 DNA 链 连接酶nullDnaA、B、C、SSB 和 拓扑酶共同参与。 每一个DNA分子只有一个复制起点（真核生物含有多个）. 复制起点位于天冬酰胺合成酶和ATP合成酶操纵子之间，共有254bp，称为oriC。 oriC 与膜相连 3个13bp重复序列, 被 DnaB and DnaC蛋白识别. 5个9bp重复序列,被 5个 DnaA蛋白(起始因子) 识别, 这5个 DnaA (R1, R5, R2, R3, R4) 叫 DnaA 框. 1、DNA 解链null复制的起始(initiation)nullDNA 解链的基本过程nullDna BDna CDna ASSBDNA大肠杆菌起始点: DNA-蛋白质复合物的类核小体结构null在解链基础上，引物酶进入形成引发体。 引发体 —— 为含解螺旋酶（DnaA、DnaC 蛋白）、引物酶和DNA复制起始区的复合物。2、引发体形成：3、引物的生成：引发体移动过程中，在适当位置引物酶催化引物生成。null复制的起始(initiation)nullnull复制方向（5` 3`） 半不连续复制 冈崎片段 前导链 滞后链（二）复制的延长(elongation)nullnullnullnullnull引物水解（RNA酶） 补缺（DNA-pol I ） 连接（连接酶）（三）复制的终止(termination)终止点（Ter）：基本过程有6个复制终止位点。3个终止顺时针方向延伸的复制叉，3个终止反时针方向延伸的复制叉。Ter序列为22-23bp, 共有序列为 AA AA A NN G TGTTGTAACTA NNN TT TG C null二、真核生物的DNA生物合成 （一）复制的起始（比较原核生物） 1、过程同原核生物： 解链  引发体形成  生成引物 2、特点： 起始点结构较 ori C 短（ 酵母为11bp，富含AT，称为自主复制序列 —— autonomouse replication sequence，ARS） 多起点（多复制子） 时序性（分组激活，非同步进行）nullnull3、参与酶和蛋白因子： DNA-pol  （引物酶活性） DNA-pol （解螺旋酶活性） 拓扑异构酶 复制因子（RF，如：RFA、RFC） 增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA） 4、通过细胞周期实现其调节： 细胞周期与DNA复制 细胞周期蛋白、周期蛋白依赖激酶与细胞周期 CDK抑制物 —— 锚蛋白（ankynin）、P21蛋白null1、 DNA-pol  催化合成引物。 2、 DNA-pol  在增殖细胞核抗原（PCNA）协同下，催化领头链或随从链合成（ DNA-pol  与 发生转换）。 3、引物除有RNA外，还有DNA片段参与构成（去除引物不仅需要RNA酶，还需要核酸外切酶）。 4、引物和冈崎片段都较原核短（引物长度大致与核小体所含DNA长度（135 bp）或其若干倍） 。 5、合成速度较慢，但总速度不慢。（二）复制延长null3` 5`3` 5`5` 3`真核生物复制叉的延长注：当随从链延长了一个或若干个核小体的长度后， 要重新合成引物Model of the nuclear DNA replication Model of the nuclear DNA replication SV40 DNA 1 Large T antigen bounding to the replication initiation area 2 Double strands unhelix with Large T antigen and helixase, the RFA (replication factor A) bounding to the unhelix model DNA. 3 Primase-Pol α complex combine ssDNA (leader strand) with the RFA, and the primase synthesis primers, Polα synthesis a short fragment of DNA strand with RFC. null4PCNA (proliferating cell nuclear antigen, 增殖细胞核抗原, 相当于大肠杆菌DNA聚合酶III的亚基β) repress the elongation and replace primase Polα, and stop the leader strand synthesis. 5 Pol δ bounding to PCNA/RFC complex, PCNA 授予Pol δ continue to synthesis leader strand; 6 Pol α (ε) and RFC bounding to lagging strand to replace Pol α, and discontinuous synthesis lagging strand. Both Pol δ and Pol α (ε) have the function of checking (校对)。 7 当复制子的复制过程完成以后，两个相邻的复制子上新形成的DNA链再连接起来。 nullnull（三）复制终止和端粒酶 —— 复制与核小体装配同步进行引物水解（RNA酶） 补缺（DNA-pol  ） 连接（连接酶）1、基本过程null核小体的复制nullnull1978年Blanckburn E.B.(Univ. of California) 研究四膜虫的rDNA时发现染色体末端有6个nt的串联重复 (5ˊ— G4T2—3 ˊ)n 重复几十次，总长度为： 370－520bp端粒的复制 一、端粒发现null端粒酶的发现端粒酶的发现1983年人们发现纤毛虫在有性生殖过程中大核由小核发育而来，其中小核rRNA基因为单拷贝，它被切下来成为游离基因，经扩增达到一万个拷贝，有趣的是这些rDNA小分子末端都有端粒，即（GGGGTT）n重复片段，但小核rDNA基因的两侧原来是没有这段重复顺序的，显然这些末端重复是在切下以后加上去的，如何来证实这个推论呢？证实推论证实推论1984年J.Shampg等构建了线性质粒，进行了有名的加尾实验，结果表明端粒复制的模板并不在端粒上。那么模板在何处呢？ null Pvu Bg1 Bam H1 Bam H1 pBR322 TEL TEL 四膜虫rDNA ARS Pvu Bg1 Bam H 1 连接 Pvu 转化酵母 Pvu 传几代 酵母DNA Pvu Pvu 连接 转化酵母 传几代 图 11-56 四膜虫与酵母TEL的拼接以及酵母细胞将其特有的TEL加到四膜虫 的TEL上(参考Shampg,J and Blackburn et al: 《Nature》1984,310:154-157) 加尾和末端结构到底 有什么内在的联系呢加尾和末端结构到底 有什么内在的联系呢人们以酵母的末端重复顺序为引物时，用四膜虫抽提物加上的仍是四膜虫的端粒；当以pBR322的片段为引物时，则不能延长末端，当以四膜虫的另一条互补链(C4A2)4为引物时也不能延长；当加热到90℃或用蛋白酶处理也不再能延长末端。这表明：这表明：（1）端粒的加尾方向是按富含G链5′→3′延伸，每次以（T2G4）为单位加上去的； （2）端粒本身不作为模板，而是作为引物从头合成； （3）酶系能识别拟被“加尾”的末端顺序； （4）酶是蛋白质性质的。人们称其为端粒转移酶，现称端粒酶。 端粒酶的结构和功能端粒酶的结构和功能1987年Greider 和Blackburn就分离纯化了端粒酶，其分子量在200～500kDa。进一步弄清了端粒酶是一种含RNA的蛋白质，RNA长159nt，其中第46、47、48位nt被修饰过，核酸酶对这三个位点不能剪切，而这一位点恰是CAACCCCAA的序列区。 null 159nt RNA 5′ 3′ 51 43 AACCCCAAC159nt的RNA中有无功能区？159nt的RNA中有无功能区？人们采用了点突变、缺失和反义技术来加以研究。首先是用159Nt的不同片段的反义寡核苷酸来处理端粒酶，结果发现反义顺序5′GCACTGATTTTGGGGTTG 3′ 可强烈地抑制此酶的加尾活性。 因此提出端粒酶RNA中的5′CAACCCCAA3′顺序是此酶的活性部位，并为(T2G4)的末端重复提供模板。 证实端粒酶RNA的核心顺序 是复制端粒DNA的模板。证实端粒酶RNA的核心顺序 是复制端粒DNA的模板。1990年余国良等对四膜虫端粒酶中的RNA基因的核心序列5′CAACCCCAA3′ 进行了定点突变，再转化四膜虫，结果受体细胞后代的染色体两端出现相应突变的端粒顺序，从而有力地证实了端粒酶RNA的核心顺序是复制端粒DNA的模板。 对不同生物端粒酶测序对不同生物端粒酶测序1990年Remero & Blackburn分析了不同生物的端粒酶，它们的 nt 数和摸板区的位置都不同。摸板区内一些位点的点突变不影响其功能，但另一些位点的突变却能引起酶的失活，说明RNA可能有一定的二级结构。 null四膜虫 3′ UCUAAAAACCCCAACUUACUGUCAAG 5′ 3′GCCAAAACCCCAAAACAAACUGUCUAA 5′ 游仆虫 摸板区 同源区 端粒的复制模型端粒的复制模型1989年Greider和Blackburn提出了端粒的复制模型。反应为四步进行： （1）首先是端粒酶与端粒DNA结合，端粒酶 中的RNA与凸出的3′引物配对； （2）以RNA为模板，在DNA3′端上从头合成 DNA； （3）延伸六个nt； （4）合成一个重复单位后，端粒酶向DNA模板 新合成的3′移动，引物再和模板配对，就这样循环 往复，周而复始。最后延伸的3′端再回折，以G·G 配对的方式形成发夹结构，产生端粒。 nullTelomere sequencesCentromere sequencesTelomere sequencesReplication origins (ARS)二．端粒（telomere） 二．端粒（telomere） 表10－3 几种生物端粒的重复单位 共同特点：共同特点：每一个端粒都含有一系列的短的正向重复顺序。Cn(A/T)m ，其中n>1，而m=1～4。 用限制性酶酶切rDNA，电泳时发现末端长度不一，表明 重复次数不均一。    1986年D.E.Gottschling和K.A.Zakian在尖毛虫(Dxytricha)中发现两种端粒蛋白，分子量分别为55Kd，26Kd。它们与端粒DNA紧密结合，能抗高盐提取和核酸酶的处理。他们推测这种DNA与蛋白的结合是非共价结合。 引物和模板引物和模板1985年Blackburn进行了体外实验来寻找端粒复制酶的线索。他用四膜虫无细胞抽提物在体外进行了端粒的“加尾”实验，即以四膜虫末端重复顺序（G4T2）4为引物，以同位素标记的dGTP和dTTP为底物进行“加尾”，结果抽提物可以使引物延伸几百个nt，且以六个nt顺序（G4T2）为单位往返重复，既然末端顺序不作为模板，但延伸的顺序又和它相同，那么加尾和末端结构到底有什么内在的联系呢？这种复制酶是否需要识别呢？ null端粒酶为反转录酶，含有一个大约150bp的RNA分子，其部分序列与TTAGGG互补，该RNA分子作为模板，通过反复延伸（聚合作用）与移位，反复将重复片段加到突出的3‘末端上，而互补链（C链）像后随链那样复制，最终G链留下3’突出端（超出12-16bp）。 G--------------------GGGTTG-OH C--------------AACCCCAAC ------ telomere G______________GGGTTG-GGGTTG-OH C---------------- AACCCCAAC-------telomere  端粒酶结构nullnullnullnullnullnull癌症与端粒酶癌症与端粒酶此前人们已经发现，癌细胞往往会产生格外多的端粒酶，使它们能不断分裂繁殖。 认为80%的癌症与端粒酶过多密切相关。 英国《自然细胞生物学》杂志最近在网上提前发表了美国加利福尼亚大学伯克利分校的科学家的。科学家用会发出荧光的蛋白质给端粒酶“染色”，观察它们在细胞里的活动。结果发现，正常细胞是将端粒酶限制在细胞核里的一个特定区域，只有在细胞分裂、DNA端粒需要修补时才把它释放出来。与之相反，在癌细胞里，端粒酶有很大的自由度。 科学家认为，端粒酶在癌细胞里能够自由活动，可能与癌细胞的强大生命力有关。如果找到方法把这些端粒酶重新“关起来”，就有可能抑制癌细胞的繁殖。 null 第四节 其他复制方式null一、逆转录: RNA DNAnull二、滚动复制和 D环复制 滚动复制 —— 某些低等生物的复制方式；复制不需要引物。 D环复制 —— 线粒体 DNA 复制方式。nullOH 3` P 5` X174 （单链DNA）病毒 感染型蛋白A（具核酸内切酶活性）5` 3`5` 3`滚动复制示意图双链DNAnullDNA-pol  dNTPD 环复制在进行中第一个复制起始点 引物以内环为模板A 延伸至第二个复制起始点时，合成反向引物，以外环为模板Anull真核与原核生物复制的主要区别nullDNA replication: semiconservative, semidiscontimity Enzymes and proteins of DNA replication: DNApolymerase, DNA helicase, DNA Topisomerase, SSB, Primase, DNA ligase, et al. Replication of prokaryote and eukaryoteSummary:null Please detail the replication process of eukaryote. Question: