结构生物学在医学研究中的应用

云彩红 北京大学基础医学院生物物理学系 2013年12月 结构生物学在基础医学和药学 研究中的应用 作为医学生，你是否思考过以下两个问—— 疾病是怎么发生的？ 如癌症，常常因为某些基因突变导致所编码蛋白的功能 或调控发生异常而引发的，那么这些突变为什么(why)/怎 么样(how)导致蛋白的功能或调控发生异常？ ——这是有关疾病发生的分子机理的问题。  如何研制出新药来治疗疾病？ 知道疾病发生的分子机理后往往就可能确定治疗疾病的 靶点，那么我们怎样才能针对靶点出治疗疾病的药物来？ ——这是有关如何设计药物的问题。 结构生物学——研究生物大分子三维结构的科学 是解决这两类问题最有力的武器之一！ surface model (蛋白分子总体外观) 达生物大分子（如蛋白质）三维结构的常用方式 sphere model (原子) sphere model (原子核) line model (化学键) + sphere model (原子核) line model (化学键) a-C trace(蛋白主链) cartoon model(蛋白主链)：也称飘带图 cartoon model（蛋白主链）+ stick model（侧链） surface model（蛋白）+ stick model（药物分子） 结构生物学研究如何解释疾病发生 的分子机理？ ——mechanism与pathway的区别 ——以EGFR突变型肺癌为例 Jemal et al., CA Cancer J Clin, 59 (2009): 225-249 Lung & bronchus Lung & bronchus Annual cancer death rates (men) Annual cancer death rates (women) Estimated new cases and deaths of major cancer types (2009) 肺癌是发病率很高并导致最大死亡数的癌症类型 表皮生长因子(EGFR)激酶结构域发生体细胞突变是 导致非小细胞肺癌(NSCLC)的常见病因 Histological type Frequency (%) Non-small cell lung carcinoma (NSCLC) 80.4 Small cell lung carcinoma (SCLC) 16.8 Other types 2.8 肺癌的分型1 EGFR激酶突变导致的NSCLC • 是体细胞突变，即只在肿瘤细胞中存在，正常细胞中没有 • 发生率: 10-15 % 的白种人NSCLC病人， 30-40% 亚州NSCLC病人2 • 在女性、非吸烟或者较少吸烟的病人中更常见3 • 经验证这些突变在NIH3T3细胞和小鼠中均能导致细胞癌变4,5 1Travis et al., Cancer, 75 (1995):191-202 2Shigematsu et al., Int J Cancer, 118 (2006):257-62 3Pham et al., J Clin Oncol, 24 (2006): 1700-4 4Greulich et al., PLoS Med, 2 (2005): e313 5Ji et al., Cancer Cell, 9(2006): 485-95 2 发现于NSCLC癌细胞中的EGFR突变类型及其对药物的敏感性 Paez et al., Science, 304 (5676): 1497-500; Shigematsu et al., Int J Cancer, 118 (2006):257-62. ok • L858R: 突变以碱性大侧链残基取代小侧链疏水残基，破坏了抑制状 态下分子的输水内核使EGFR不能停留在这种状态下，从而持久激活 突变为什么导致激酶被持续激活从而致癌? WT/Lapatinib (Wood, 2004) L858R/Iressa 活性抑制状态的EGFR 激活状态的EGFR L858R突变导致EGFR激活的分子机理 结构生物学研究如何理性设计靶向 性新药？ ——肺癌耐药性突变 Iressa/tarceva疗效不错，但绝大多数病人肿瘤细胞在1-2年内 对药物产生抗性：约50%的情况下耐药性是由于EGFR发生第 二个突变T790M所导致的 Kosaka, T. et al. Analysis of epidermal growth factor receptor gene mutation in patients with non-small cell lung cancer and acquired resistance to gefitinib. Clin. Cancer Res. 12, 5764-9 (2006). Balak, M. N. et al. Novel D761Y and common secondary T790M mutations in epidermal growth factor receptor-mutant lung adenocarcinomas with acquired resistance to kinase inhibitors. Clin. Cancer Res. 12, 6494-501 (2006). 如何才能研发出一种新药，这种药能:  强烈抑制EGFR T790M耐药性突变，从而能治疗 耐药性肺癌;  对野生型EGFR和其他相似的正常激酶不具有明 显抑制能力，从而不会杀伤正常细胞。 这个问题好比找一把钥匙(药物)开锁(药物靶点)—— 传统方法：筛选小分子库+构效关系分析 新兴方法：基于三维结构的理性设计和改进 Structural information was used to design a focused library of irreversible inhibitors that could bind EGFR and react with the thiol group of Cys797 to form a covalent linkage. Zhou, Ercan, Chen, and Yun et al., Nature, 462 (2009): 1070-4 基于三维结构设计新药 N N N H N N H NH N O N O Cl N N N H N N H NH N O N O Cl N N N H N N H N O N NH O N N N H N N H NH N O N O N N N H N N H N N O N O N N N H N N H NH N O N O N N N N H NH N O N O NH N NN H NH N O N O NH Cl N N N H N N H NH N N O N N N N H N N H NH N N O O N N N Cl O N H N N NH O N N Cl O N H N N O H N O N N Cl O N H N N H N O N N O N H N N NH O N N O N H N N NH O N H N N N N N H N N NH O N N NH N H N N H N O N N N N H N N H N O N N NH N H N N NH O Cl and more…. 三维结构指导下构建的专类定向小分子库 Zhou, Ercan, Chen, and Yun et al., Nature, 462 (2009): 1070-4 筛选小分子库——检验小分子对于 以下细胞株的抑制能力: 1) PC9GR (delE746_A750/T790M) 2) PC9 (delE746_A750) 3) A549 (KRAS mutant) 4) H3122 (EML4-ALK) 获得能强烈抑制耐药性细胞株 (PC9GR) 生长，而对EGFR为野生 型的细胞株 (A549 and H3122)不 具有显著抑制能力的小分子: WZ3146, WZ4002, and WZ8040… 筛选得到的新一代抑制剂强烈抑制耐药性癌细胞生长 携带初级致癌性突变 携带次级耐药性突变 Cell Growth Inhibition Zhou, Ercan, Chen, and Yun et al., Nature, 462 (2009): 1070-4 新一代抑制剂WZ4002选择性地抑制耐药性突变 而不是野生型EGFR EGFR Autophosphorylation Inhibition in NIH-3T3 Cells (EGFR wild type) - + + + + - + + + + - + + + + - + + + + EGFR pEGFR Tubulin Conc. (mM) WZ4002 CL-387, 785 gefitinib HKI-272 EGF 抑制剂对NIH-3T3细胞中EGFR自磷酸化的抑制 （该细胞携带野生型EGFR） 体外激酶活力抑制实验 Zhou, Ercan, Chen, and Yun et al., Nature, 462 (2009): 1070-4 结构生物学阐释WZ4002的设计细节 Zhou, Ercan, Chen, and Yun et al., Nature, 462 (2009): 1070-4 Other Kinases with Attackable Cys 结构生物学是什么？ 亚细胞结构 细胞 组织 器官 结构生物学（Structural Biology） 系统动态研究范畴 MESDAMESETMESSRSMYN AMEISWALTERYALLKINCA LLMEWALLYIPREFERDREV ILMYSELFIMACENTERDIRA TVANDYINTENNESSEEILIK ENMRANDDYNAMICSRPAD NAPRIMASERADCALCYCLI NNDRKINASEMRPCALTRA CTINKARKICIPCDPKIQDEN VSDETAVSWILLWINITALL 一级结构 个体 结构生物学研究范畴 大分子运动 高分辨率结构 中、低分辨率结构 高级结构  研究对象是生物大分子及其复合物（蛋白质、核酸、蛋 白-小分子复合物、蛋白-蛋白复合物、蛋白-核酸复合 物），小到小肽分子，大到整个核糖体或病毒粒子；  以生物大分子的三维结构、运动（即构象变化）和相互 作用（如分子机器的结构与功能）为研究内容；  研究目的是: (1)阐明生物大分子发挥功能、自我调控和相互作用的 结构基础/分子机制，回答生命科学基本问题； (2)利用三维结构信息来改造生物大分子（如对酶的改 造）或者小分子（如药物设计）。  是当前生物物理学乃至整个生物学研究的前沿领域 结构生物学（Structural Biology） 结构生物学的分支学科 结 构 生 物 学 预 测 结 构 实 验 测 定 结 构 二级结构预测 三维结构预测 X-射线大分子晶体学 多维核磁共振 电子显微镜学 单分子结构生物学 1997年诺贝尔化学奖工作：ATP合 成酶的工作机理 1997年诺贝尔化学奖工作：ATP合成酶的工作机理 x-射线晶体学&单分子技术 Crick F和Watson D在DNA分子的结构研究（X-射线晶体学）上的贡献而获得了 1962年诺贝尔生理学和医学奖； Perutz M和Kendrew J因为利用X-射线晶体学研究了肌红蛋白的三维结构而获得 了1962年诺贝尔化学奖； Hodgkin DC因为通过X-射线晶体学确定了一些重要生化物质的结构而获得了 1964年诺贝尔化学奖； Klug A因为在利用电子晶体学（电子显微镜学）测定生物物质的结构方面的贡 献而获得了1982年诺贝尔化学奖； Deisenhofer J、Huber R和Michel H因为在解析光合作用中心的三维结构（X-射 线晶体学）上的贡献而获得了1988年诺贝尔化学奖； Boyer PD和Walker JE因ATP生物合成的分子机制研究（X-射线晶体学、单分子） 获1997年诺贝尔化学奖; Wüthrich K因为发明了利用多维核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构 的方法而获得了2002年诺贝尔化学奖； MacKinnon R由于在细胞膜离子通道的结构和机理研究方面的贡献（X-射线晶 体学、电子显微镜学）而获得了2003年诺贝尔化学奖； Kornberg RD因为在真核转录的分子基础研究（X-射线晶体学）上的贡献而获 得了2006年诺贝尔化学奖； Ramakrishnan V、Steitz TA和Yonath AE因为对核糖体的结构（X-射线晶体 学）、功能和机理研究获得2009年诺贝尔化学奖； Lefkowitz RJ、Kobilka BK 因为对G蛋白偶联受体的研究（X-射线晶体学）获得 2012年度诺贝尔化学奖。 结构生物学研究中的诺贝尔奖（部分） Robert J. Lefkowitz Brian K. Kobilka 2012年度诺贝尔化学奖： G蛋白偶联受体研究(Lefkowitz RJ, Kobilka BK) 预 告 下一次课我们将初步了解一下X-射线晶 体学如何研究生物大分子三维结构。 预备知识： 光的衍射和干涉现象 向量（矢量）的表示方法，向量的点乘 蛋白质晶体生长实验 生化楼224房间，爱惜设备、严禁乱动 科研仪器