流式表面抗原染色方案

北京 电话：010-52016220/52016221 传真：010-84920941 上海 电话 ：021-62292399/62347249 传真：021-62292399-604 网址：www.laizee.com 邮箱：info@laizee.com 流式面抗原染色 方案 A：组织或培养的细胞表面抗原染色。 方案 B：人类外周血细胞表面抗原染色。 小贴士： 1. 流式抗体要储存于避光 4 度，严格避免冻融。 2. 流式抗体使用前要离心 3min，避免贴壁盖的损失，请勿斡旋混匀。 3. 避免细胞成团，以免堵塞流式细胞仪。 4. eFluor 纳米晶体抗体参照该品说明进行改善。 方案 A: 组织或培养的细胞表面抗原染色 实验材料： 15×75mm 圆底流式管或 96 孔板 直标一抗或纯化抗体 二抗（可选） 抗小鼠 CD32/16 抗体（eBioscience Cat. No. 14-0161） 人 FCR 结合抑制剂（eBioscience Cat. No. 14-9161） 流式染色液（eBioscience Cat. No. 00-4222）可自行配制 eFluor 纳米晶体抗体染色液（eBioscience Cat. No. 00-3222；可选） 7-AAD 活度染色液（eBioscience Cat. No. 00-6993）或 PI 染色液（eBioscience Cat. No. 00-6990） 实验流程： 1. 按照样品细胞制备方案制备悬浮细胞，调整浓度为 2×107/ml。 2. （可选）封闭 FCR 介导的非特异性反应： 小鼠：染色之前加 0.5ug-1ug/100ul CD16/32 抗体，孵育 20min。 人类：染色之前加 20ul 人 FCR 结合抑制剂孵育 20min。 3. 等分细胞悬液，每管 50ul，再补加 50ul 染色液。 4. 按照抗体说明书加入适量抗体，轻弹混匀。 例如直标抗体：CD4-FITC 1ul; CD25-PE 1ul。 5. 直标抗体：四度避光孵育 30min, 纯化抗体：四度避光孵育 60min。（注意：不同的抗体 可能需要的孵育条件不同，按照说明书建议操作。） 6. 加 2ml 流式染色液，洗涤，300g 离心弃上清，重复一次（eFluorNC 抗体使用对应的流 式染色液）。 7. 加 100~200ul 流式染色液，上机（注意：以上为直标抗体染色方案，间标抗体在一 北京 电话：010-52016220/52016221 传真：010-84920941 上海 电话 ：021-62292399/62347249 传真：021-62292399-604 网址：www.laizee.com 邮箱：info@laizee.com 抗洗涤后再加入二抗，孵育，洗涤一次即可）。 方案 B：人类外周血细胞表面抗原染色。 实验材料： 细胞过滤器（尼龙网过滤） eBioscience® 流式染色缓冲液 (eBioscience Cat. No. 00-4222) 15ml 或 50ml 的离心管。 eBioscience® 1X RBC Lysis Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4333) or 1-Step Fix/Lyse Solution (eBioscience Cat. No. 00-5333) 12x75 mm 圆底流式管 Primary antibodies (directly conjugated or purified) Secondary reagents, if necessary (for indirect staining) Affinity Purified Human FcγR-Binding Inhibitor (eBioscience Cat. No. 14-9161) eBioscience® Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222) eFluor® NC Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-3222) 实验方案： 1. 把全血按每管 100ul 等分。 2. （可选）加入 20ul Affinity Purified Human FcγR-Binding Inhibitor (eBioscience Cat. No. 14-9161),冰上孵育 20min。 3. 按照说明书剂量加入适量一抗，斡旋混匀，4°C 或冰上孵育 20min。 4. 不用洗涤，直接加入样本 10 倍以上的室温 1×RBC Lysis Buffer 或者 1-Step Fix/Lyse Solution，斡旋混匀，室温避光孵育 10min 左右，直至液体透亮。 5. 加 2ml 流式染色液，洗涤，300g 离心弃上清，重复一次（eFluorNC 抗体使用对应的流式 染色液）。 6. 加 100~200ul 流式染色液，上机检测。（注意：以上为直标抗体染色方案，间标抗体在 一抗洗涤后再加入二抗，孵育，洗涤一次即可。）