先天性非结合性高胆红素血症的分子诊断_治疗进展_栾翔凌

生 物 技 术 通 讯 LETTERSINBIOTECHNOLOGY Vol.19No.3May,2008 文章编号：1009-0002(2008)03-0440-03 综 述 先天性非结合性高胆红素血症的分子诊断、治疗进展 栾翔凌 1,辛绍杰 2 1.解放军军医进修学院,北京 100853;2.解放军302医院 感染3科,北京 100039 [摘要] 先天性非结合性高胆红素血症是临床常见的胆红素代谢异常,由于缺乏特异性的体征和病理改变,很难得到临床 明确诊断。基因水平的检测可以为因葡萄糖醛酸转移酶基因缺陷造成该酶活性下降或缺失而导致的先天性非结合性高胆 红素血症提供确诊依据,而在基因水平治疗先天性非结合性高胆红素血症也已取得很大进展。对目前先天性胆红素代谢异 常的分子遗传学基础、分子生物学检测、常用治疗手段以及基因治疗进展进行了综述。 [关键词] 非结合性高胆红素血症;分子诊断;基因治疗 [中图分类号] R394 [文献标识码] A Developmenton MolecularDiagnosisand TherapyofHereditaryNon Conjugate Bilirubinemia LUANXiang-Ling1,XINShao-Jie2 1.PLAPostgraduateSchoolofMedicine,Beijing100853T 2.ThirdDepartmentofInfectiousDisease,The302HospitalofChinesePLA,Beijing100039T China [Abstract]Hereditarynonconjugatebilirubinemiaisacommonabnormalityofbilirubinemetabolism.Becausethelackof characteristicsymptomandpathologicalchanges,it'shardtodiagnosethedisease.Detectionofthedefectiononglucuronyl transferasegeneonamolecularlevelprovidestheevidencetoascertainthediagnosis, andgenetherapyofthedisease hadachievedgreateffect.Theprogressonhereditaryfoundation,moleculardiagnosis,therapyavailableandgenetictherapy ofhereditarynonconjugatebilirubinemiawerereviewed. [Keywords] nonconjugatebilirubinemiaT moleculardiagnosisT genetherapy 胆红素代谢是肝脏的重要生理功能之一。胆红素是血红素 的终末产物,每日约有 5g血红蛋白在单核吞噬细胞中裂解,产 生约0.25g非结合胆红素。非结合胆红素是非极性、脂溶性的, 不能经尿液排泄,可透过血脑屏障。非结合胆红素升高可将神经 细胞染色,引起核黄疸,造成神经系统损害。非结合型胆红素在 血浆中以白蛋白为载体输送入肝,在肝内与谷胱甘肽 S转移酶 结合,经葡萄糖醛酸转移酶(glucuronyltransferase,UGT)催化,转 变为葡萄糖醛酸糖苷,即水溶性的结合型胆红素。结合型胆红素 由肝细胞向毛细胆管排泄[1]。 血清中非结合胆红素增多主要缘于产生过量 (如溶血)、摄 取障碍和结合障碍,排除溶血和肝脏疾病这两个原因出现的非 结合性胆红素增高症多由先天性胆红素代谢异常导致。引起非 结合性胆红素增高的先天性疾病主要有 Gilbert综合征、Crigler- Najjar(CN)综合征Ⅰ型和Ⅱ型、原发性旁路型高胆红素血症和 Lucey-Driscoll综合征。原发性旁路型高胆红素血症主要是因早 期来源于骨髓和肝脏的胆红素生成过多而引起的罕见的家族性 良性疾病。Lucey-Driscoll综合征即家族性暂时性新生儿黄疸,是 由于妊娠后期孕妇血清中存在一种孕激素抑制代谢胆红素过程 中的 UGT活性所致,有家族史,新生儿早期黄疸重,2～3周自然 消退。Gilbert综合征、CN综合征Ⅰ型和Ⅱ型是由于基因缺陷造 成UGT的活性异常或达量降低引起的终生疾病[2]。 我们对UGT基因及其缺陷的诊断,以及相关疾病的基因治 疗进展综述如下。 1 葡萄糖醛酸转移酶 目前已有24种人类UGT基因被确认,并按其序列的相似性 被分成UGT1和UGT2亚家族。UGT基因均可在其编码或非编码 区展示其多态性,但目前只有 UGT1A1、UGT1A6、UGT1A7、 UGT2B4、UGT2B7和 UGT2B15等 6种 UGT基因的多态性被证 实[3]。随着人类对基因序列的认识,更多UGT基因的多态性将被 发现,但仅有部分会影响酶的功能或者酶数量的表达[4]。UGT1家 族包括多个基因型,于 1991年被克隆[5]。UGT1基因位于染色体 2q37[6],基因全长大于50kb,其启动序列包含 1个 TATAA盒;不 同的UGT1具有不同的第1外显子,各自拥有启动区和增强区, 同时与第2～5这4个共同外显子拼接,产生独特 mRNA的产物, 即UGT同工酶;每个第 1外显子编码一种 UGT1同工酶独特的 N端区,它决定同工酶的底物特异性;第 2～5外显子编码所有 UGT1同工酶相同的C端区,是不同的同工酶与葡萄糖醛酸结合 的共同位点。UGT1A1参与胆红素的结合[7],此基因编码序列的突 变可导致UGT结构的异常,从而发生结合功能的丧失或缺陷。而 [收稿日期]2007-09-12 [作者简介]栾翔凌(1980-),女,博士研究生 [通讯作者]辛绍杰,(E-mail)Xsj302@yahoo.com.cn 440 启动序列(非编码序列)核苷酸的多态性表现,虽可产生正常结 构的酶分子,但因其表达能力的下降可导致酶活性降低。 2 Gilbert综合征与UGT1A1基因变异 Gilbert综合征为常染色体隐性遗传疾病,在人群中约有 6% 的发病率,其特征表现为在无肝实质病变和溶血前提下的慢性、 轻度非结合型胆红素增高。患者无明显症状,血清胆红素和黄疸 呈波动性,常因疲劳、应激、饮酒、感染、高热和妊娠而增加。 Gilbert综合征患者UGT1A1基因启动子 TATAA盒中 TA重复序 列发生突变,其编码的酶分子结构虽正常但活性下降,可降至正 常的30%左右[8]。TA重复序列(TA)5-8参与调节 UGT1A1转录活 性,TA重复序列的增加降低了 TATAA结合蛋白与 TATAA盒的 亲合力。常见纯合子(TA)7TAA替代正常的(TA)6TAA;部分患者 表现为(TA)5或(TA)8。Gilbert综合征 UGT1A1基因的多态性也 可表现在编码区。亚洲人群中罕见 TATAA启动子变异,突变常 发生在编码区。最常见核苷酸211位G→A点突变(G71R),使相 应编码的甘氨酸变成精氨酸。此位点突变在日本人、韩国人及中 国人中最常见[9]。另外 Arg367Gly、Arg209Trp、Tyr486Asp[10-12]等突 变也可导致Gilbert综合征。 3 CN综合征与UGT1A1基因变异 CN综合征是比较罕见的常染色体隐形遗传疾病,其Ⅰ型患 者的UGT活性完全丧失,是惟一一种必须进行治疗的非结合型 高胆红素血症。CN综合征是因 UGT1A1基因在编码区发生突 变,引起该基因指导合成的 UGT活性完全(Ⅰ型)或部分(Ⅱ型) 丧失所致。基因突变可发生在 UGT1A1基因 5个外显子中的任 意一个,可引起翻译提前终止或移码突变,导致氨基酸序列改变 或缺失,酶活性丧失。目前报道的 UGT1A1外显子突变已有 70 余种[13],但尚未发现热点突变位点。除了外显子变异导致酶活性 丧失之外,内含子及剪切位点的基因发生变异也可以导致移码 突变,引起酶活性丧失[14-15]。另外,如编码区变异同时复合Gilbert 型启动子变异,也可以改变整个突变的表现型[13]。2005年报道了 中国大陆第一例 CN综合征Ⅰ型病例,患者 UGT1A1基因第 715 位发生 C→T突变,导致翻译提前终止,UGT完全没有活性,患 者的父母为同一突变的杂合子[16]。 4 UGT1A1基因变异的基因诊断 对于临床上出现的非结合型胆红素增高,在排除肝实质病 变和溶血以后,应该考虑先天性非结合型胆红素代谢异常。目 前,对疑似先天性非结合型胆红素代谢异常的患者,在基因水平 有以下几种检测方法。最常用的是直接测序,提取其基因组,根 据 GenBank公布的基因序列引物,进行 PCR扩增后直接测 序[17]。此方法耗费较大,不适于大规模病例调查。可用于大量标本 处理的方法主要有变性梯度凝胶电泳 (denaturinggradientgel electrophoresis,DGGE)、单链构像多态性(single-strandconforma- tionpolymorphism,SSCP)和变性高效液相色谱(denaturinghigh performanceliguldchromatography,DHPLC)等,进行初步筛选 后,对阳性标本进行测序。DGGE的原理是:双链 DNA分子在一 定变性剂浓度的凝胶上电泳时,会在一定的时间发生部分解链, 导致电泳迁移率下降,当正常的 DNA分子和发生突变的 DNA 分子之间即使只有 1个碱基对的差异时,也会在不同时间发生 部分解链,从而被分离成2条。有研究者[18]利用双变性梯度凝胶 电泳(doublegratientDGGE,DG-DGGE)检测 98份 Gilbert综合 征患者的血样,不仅可以快速检测出 TA插入异常,并且还可以 区分(TA)6/(TA)7杂合子和(TA)7/(TA)7纯合子。SSCP的原理 是:单链 DNA在中性条件下会形成二级结构,这种二级结构依 赖于其碱基组成,即使是 1个碱基的不同,也会形成不同的二级 结构并引起在非变性电泳条件下不同的电泳迁移率,因此可以 用来检测微小到1个基因突变的差异。Francoual[19]的实验结果显 示,对羊膜细胞或绒毛膜区的胎儿基因组进行 SSCP检测,是一 种快速有效的产前诊断方法。DHPLC技术是一项在 SSCP和 DGGE基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术,其原理与 DGGE类似,即通过HPLC在部分变性的条件下可将发生错配的 异源杂合双链 DNA和完全匹配的同源双链 DNA分离开来。与 传统的杂合双链技术相比,该技术耗时短,分析一个样品一 般仅需几分钟,不使用放射性同位素,自动化程度高,但需要置 备一台 HPLC仪器。目前该技术主要用来检测 200～300bp的 DNA片段,对长的 DNA片段的检测尚未见报道,已经应用于 UGT1A1基因异常的检测[20]。 5 先天性非结合型高胆红素血症的临床治疗进展 5.1 一般治疗现状 除了 CN综合征Ⅰ型以外,Gilbert综合征和 CN综合征Ⅱ型 患者的UGT仍有一定活性,不会或极少发生核黄疸。Gilbert综合 征无须特殊治疗,而CN综合征Ⅱ型口服苯巴比妥可以降低血清 胆红素水平,通过蓝光照射使非结合胆红素内侧氢键断开,形成 可溶于水的异构体,不须结合即可从胆汁排泄。随着年龄增长, 皮肤厚度增加,相对面积减少,此种方法的疗效减退。CN综合征 Ⅰ型患者体内UGT活性完全丧失,如不加以治疗,患者在婴儿期 即可能死亡,幸存者有神经系统后遗症,多在儿童期和青春期死 亡。目前治疗CN综合征Ⅰ型最有效的方法是肝移植,但成本高、 并发症多。 5.2 基因治疗研究进展 肝细胞移植可以治疗 CN综合征Ⅰ型[21],但未经选择的肝细 胞生物活性差,再生能力低,单纯移植肝细胞效果不显著。将编 码UGT的基因克隆入永生化的肝细胞,所得重组肝细胞植入 CN 综合征Ⅰ型模型 Gunn大鼠脾脏后,大鼠体内非结合型胆红素水 平持续、稳定下降,时间可持续达 120d[22]。但是,目前细胞永生 化的技术还不成熟,缺乏安全的永生化方法,细胞培养量也难以 满足临床治疗需要,没有建立合适的培养系统,这些问使得该 方法距离真正用于人体治疗还很遥远。 目前替代肝移植的另一个研究热点是治疗性疫苗。将携带 UGT1A1基因的质粒肌肉注射 Gunn大鼠模型,在肌肉组织中可 以检测到 UGT表达,在随后的 2～4周内大鼠体内胆红素水平下 降,而每月经静脉注射一次重组质粒可将胆红素水平维持在正 常范围长达5个月[23];而使用具有肝脏特异性启动子所构建的重 组质粒蛋白,则可持续表达长达 8个月,并且引起的免疫反应比 普通真核表达质粒轻[24]。病毒来源的基因治疗载体可以形成假病 栾翔凌等:先天性非结合性高胆红素血症的分子诊断、治疗进展 441 生 物 技 术 通 讯 LETTERSINBIOTECHNOLOGY Vol.19No.3May,2008 毒颗粒模拟病毒感染的过程,持续表达目的蛋白,因而受到人们 重视。 vanderWegen[25]等利用肝脏特异性慢病毒载体表达 UGT, 经静脉注射一次,一年后 Gunn大鼠体内的胆红素仍维持在正常 水平,并且在大鼠 30%的肝实质细胞内都可以检测到 UGT表 达。Seppen[26]等报道,接种慢病毒载体表达 UGT1A1的胎鼠在出 生一年后体内胆红素水平仍正常,而出生当日接种的 Gunn大鼠 体内胆红素水平可以维持 18周,表明对于先天性代谢性疾病来 说,开始治疗的时间越早,治疗效果也越好。 6 结语 目前,临床不明原因非结合性胆红素增高主要依靠肝脏穿 刺病理检查确诊,其结果受到人员和技术水平限制,很多患者最 终难以确诊。分子水平诊断非结合性高胆红素血症具有客观、精 确、敏感度高的特点,为明确诊断提供了新的方向,可以减少患 者不必要的痛苦和经济负担,具有广泛的推广价值。而对于需要 治疗的非结合型胆红素增高血症,基因治疗因其经济、高效、安 全的特点而具有极高的研究和应用价值。 参考文献 [1] 骆抗先.乙型肝炎基础与临床[M]. 北京:人民卫生出版社,2006: 301-302. 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