大鼠在体肠循环吸收实验大黄（改）

实验一 大鼠在体肠循环吸收实验 [实验目的] 1.掌握大鼠在体肠循环吸收的实验方法； 2.掌握药物肠吸收的机理；   3.掌握计算吸收速度常数（ka）和吸收半衰期（t1/2）的方法； [实验原理] 被动扩散是消化吸收的最重要途径，它是药物分子通过胃肠屏障从浓度高的区域（吸收部位）向浓度转低的区域（血液）扩散，电动势高的向电动势低的区域移动，不消耗生物体的能量，只与浓度有关。其扩散速率与膜两侧的浓度差成正比，Fick方程式定量的描述了这一过程：   式中dQ/dt为分子型药物的渗过速度；S为膜的面积；D为膜内的扩散速率常数；Ko为油/水分配系数，C 为消化液中药物浓度； Cb在血液中药物浓度；h为膜的厚度。P=D Ko为透过常数。 一般药物进入循环系统后，立即转运至全身，故药物在吸收部为循环液中的浓度相当低，可忽略不计。因此透过速度与消化液浓度成正比。若设PS/h=ka式则可以简化为： 由上式可看出药物的渗过速度属于观一级速度过程。若以消化液药物量的变化dx/dt表示透过速度，则：   经积分和对数变化后得： 以时间t对小肠内残存的LnX作图应为一直线，其直线斜率即为药物在小肠中的吸收速度常数ka.。 在研究药物的肠吸收机制时,由于小肠不仅吸收药物也吸收水分,使灌流液的体积减小,故不能用直接计算药物浓度的方法来计算剩余药量。目前,国内常用校正水分的方法主要有重量法和酚红法。本实验采用酚红法。 [仪器]   蠕动泵、分光光度计、红外灯 [材料] 大鼠、大黄、70%乙醇、酚红、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、乌拉坦、乙醚、N,N-二甲基甲酰胺、芦荟大黄素对照品，大黄酸对照品，大黄素对照品，大黄素甲醚对照品及大黄酚对照品等。 [实验] 1.试液的配制 （1）0.2 mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液：称取氢氧化钠0.8 g置100 ml量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀备用。 （2）生理盐水：称取氯化钠0.9 g置100 ml量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀备用。 （3）Krebs-Ringer试剂（K-R液，pH7.4）：称取氯化钠7.8 g，氯化钾0.35 g，氯化钙0.37 g，碳酸氢钠1.37 g，磷酸二氢钠0.32 g，氯化镁0.02 g，葡萄糖1.4 g，加蒸馏水溶解使成1000ml。 （4）20%乌拉坦溶液：称取乌拉坦20 g置100 ml量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀备用。 （5）供试液：将大黄饮片粉碎成粗粉,称取40g药粉置于圆底烧瓶中,加入320mL体积分数为70%乙醇回流提取3次,每次1.5 h。将3次回流提取液合并,过滤,减压回收至无醇味。将回收后溶液溶于Krebs-Ringer试剂（K-R液，pH7.4），作为进入大鼠肠内的供试液。 （6）酚红溶液：精密称取酚红20 mg置1000 ml量瓶中，加Krebs-Ringer试剂定容，摇匀备用。 2.装置         大鼠在体肠循环吸收实验装置图（1.温度计 2.恒温水浴 3.药液 4.蠕动泵 5.大鼠小肠） 3、​ 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.1%磷酸溶液（85:15）为流动相，检测波长为254n。理论塔板数按大黄素峰计算应不低于3000. 4、​ 溶液的制备 精密称取芦荟大黄素对照品，大黄酸对照品，大黄素对照品，大黄素甲醚对照品及大黄酚对照品适量，加色谱纯甲醇分别制成每1ml含芦荟大黄素，大黄酸，大黄素，大黄酚各80μg，大黄素甲醚40μg的溶液，分别精密量取上述对照品各2ml，混匀，既得（每1ml含芦荟大黄素，大黄酸，大黄素，大黄酚各16μg，大黄素甲醚8μg） 5、操作 将100 ml供试液（100ml Krobs-Ringer试液含大黄生药量20mg、酚红2mg）加入循环装置的烧瓶中。将实验前禁食一夜、体重约200 g 的大白鼠麻醉并加以固定。沿腹中线打开腹腔，从十二指肠上部及回肠下部各插入直径为0.5 cm的玻璃管，用线扎紧，并用37 ℃ 的生理盐水将小肠内容物冲洗干净，然后将两玻璃管同装置连接。开动蠕动泵，以4 ml/min的流速循环10 min 后流速调节至2ml/min，自烧瓶中取样2 ml（1.5 ml、0.5 ml 各一份）作为药物和酚红零时间的样品，并补加2 ml 酚红溶液，其后每15 min取样2ml（1.5 ml、0.5 ml 各一份），同时补加2 ml 酚红溶液。     实验结束后取出小肠，冲洗后剖开，摊于坐标纸上，沿小肠边剪下坐标纸，冲洗后晾干，烘干称重，剪取10格（10 cm2）坐标纸称重后，即求得小肠的面积（cm2） 所得灌流液样本按照上述 色谱条件进样,分别测定5种游离蒽醌的浓度。 6、测定方法    （1）大黄提取物的测定 将取出的1ml样品中加入N,N-二甲基甲酰胺1 ml，摇匀，放置3 min，，放置20 min，在3项下色谱条件下进样得色谱图。（空白液为1 ml供试液按上述方法处理，但不加N,N-二甲基甲酰胺溶液。）    （2）大黄提取物标准曲线的制备 精密吸取游离蒽醌混合对照品溶液100, 200, 400, 600, 800μl分别移入5个100 ml容量瓶中,各加500μlN,N-二甲基甲酰胺混匀后,加入K-R液定容,即为所需浓度的标准含药灌流液。经处理后在3项下色谱条件下进样得色谱图,芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚色谱峰面积。    （3）酚红的测定 将取出的0.5 ml样品中加入0.2 mol/L NaOH溶液5 ml，在555 nm 测定吸收度。（空白液为0.2 mol/L NaOH溶液）    （4）酚红标准曲线的制备 精密称取酚红100 mg，置1000 ml 容量瓶内，加1%Na2CO3 溶液至刻度成100 μg/mL的标准溶液，分别吸取1、2、3、4、5、6 ml的标准溶液，加水至10 ml，按酚红的定量方法测定吸收度并绘制标准曲线。 五、[实验数据与处理] 1. 以剩余药量的对数和时间作图，求出吸收速度常数，吸收半衰期和每小时药物吸收率（%）。 每小时吸收率（%）= 根据小肠面积，计算每小时 cm2（或每小时 100cm2）的吸收率 大鼠在体小肠吸收量的计算公式 取样时间（hr） 吸收度 法莫替 丁浓度 酚红吸 收度 酚红浓度 供试液体积（ml） 剩余药量（微克） 循环前 △A0 C0 A0’ C0’ V0=100ml P0=100＊C0 0 △A1 C1 A1’ C1’ P1=C1V1 0.5 △A2 C2 A2’ C2’ P2=C2V2+2C1 1.0 △A3 C3 A3’ C3’ P3=C3V3+2(C1+C2) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · tn An Cn An’ Cn’ 六、[思考] 1.做好本实验的关键是什么？在操作中应该注意哪些问题？ 2.本实验装置能否进一步改进？ 七、[注意事项] 1.麻醉时注射乌拉坦不得过多，一半大鼠称重后注射1,2ml/200g，可以先注射1ml，看麻醉效果在决定是否继续注射。否则实验大鼠容易死亡。 2.麻醉后将大鼠仔细固定在固定板上，防止大鼠在实验过程中苏醒挣扎。 3.沿着腹腔中线打开腹腔时，剪开3cm左右即可，不可以过长，否则实验大鼠容易失血过多或者无法保持体温而死亡。 4.将肠与肠系膜分离时要小心用小剪刀分离，否则容易将小肠弄破，造成后续试验的漏液。 5.插入管后要用线系紧，否则容易造成漏液或者肠段与管脱离。 6.实验前要将小肠内容物冲洗干净，否则会造成后续试验测定的吸光度不准确。 7.实验时插入小肠的两根胶管的管径要相同，否则会造成一端的肠段撑爆或一端的肠段紧缩，造成液体无法顺利流通循环。