天麻素与葛根素配伍对DPPH自由基清除作用及溶解度的影响_姜丽

• 2397 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2013年 8 月第28卷第8期 CJTCMP , August 2013, Vol .28, No. 8 天麻素与葛根素配伍对DPPH自由基清除作用及 溶解度的影响 姜丽，王玉蓉，林珈好，曹唯仪，黄镇林 （北京中医药大学中药学院，北京 100102） 摘要：目的：研究天麻素与葛根素配伍后在二苯代苦味肼基自由基（DPPH自由基）清除率、溶解度方面 的相互影响，探讨其配伍应用的合理性。方法：采用紫外分光光度法测定体外DPPH自由基清除率及平衡溶解 度。结果：天麻素浓度为200g/L时，未显示DPPH自由基清除能力，而葛根素5g/L时显示了一定的作用，其IC50为 17.56g/L；天麻素在水中溶解度为303.81g/L，葛根素为1.62g/L，天麻素150g/L时使葛根素的溶解度增加了4.1倍。 结论：天麻素与葛根素配伍后，可增加葛根素溶解度，但在一定浓度范围内对其自由基清除作用无显著性影响。 关键词：天麻素；葛根素；DPPH自由基；清除率；溶解度 基金资助：北京中医药大学复方中药制药研究创新团队（No.2011-CXTD-13） Pilot study on DPPH free radical-scavenging activity and solubility of combining gastrodin with puerarin JIANG Li, WANG Yu-rong, LIN Jia-hao, CAO Wei-yi, HUANG Zhen-lin ( School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China ) Abstract: Objective: Study the influence on DPPH free radical-scavenging activity and solubility of gastrodin and puerarin, to explore the compatibility rationality of the two components. Methods: The ultraviolet spectrophotometry was used to determine the scavenging rate and solubility of gastrodin and puerarin in vitro. Results: Gastrodin had little effect while puerarin had certain (the IC50 was 17.56g/L) on DPPH free radical-scavenging activity when the concentration of the two were 200g/L and 5g/L, respectively. The solubility of gastrodin in water was 303.81g/L and that of puerarin was 1.62g/L, which could be increased by 4.1 times when adding gastrodin. Conclusion: Gastrodin could increase the solubility of puerarin but had no significant influence on puerarin with DPPH free radical-scavenging activity in certain concentration range. Key words: Gastrodin; Puerarin; DPPH free radical; Scavenging rate; Solubility Fund assistance: Research Innovation Team on Compound TCM Pharmacy of Beijing University of Chinese Medicine (No.2011-CXTD-13) 通讯作者：王玉蓉，北京市朝阳区望京中环南路6号北京中医药大学中药学院中药制药系，邮编：100102，电话：010-84738611 E-mail：yurong.wang@163.com 天麻（Gastrodia elata BL .）与葛根[Pueraria lobata （Willd）Ohwi.]为中医治疗心脑血管疾病（如高血压急性脑出 血、头晕头痛等）的常用方药[1-3]，其主要活性成分分别为天麻 素（gastrodin）和葛根素（puerarin）。天麻素具有改善微循环、 降血压、抗氧化等[4]多种药理作用，葛根素同样具有改善微循 环、扩张冠状动脉、降血压、抗氧化等[5]药理活性。据报道联合应 用葛根素与天麻素可改善脑循环及使微循环的作用加强[6-8]；二 者合用后，其抗氧化作用是否也能加强？故本研究拟以二苯代 苦味肼基自由基（DPPH自由基）清除率为指标，评价天麻素、 葛根素和二者不同浓度配比后对自由基的清除活性。 此外，葛根素因水溶性及口服生物利用度低，许多学者研 究了不同辅料或剂型对葛根素的增溶作用[9-14]。本课题组前期 体内研究结果也明，天麻素和葛根素合用后，可增加葛根素 大鼠血浆中的曲线下面积（AUC），提高其相对生物利用度。天 麻素是否通过增加葛根素的溶解度而提高其生物利用度呢？ 基于以上想法，本研究以DPPH自由基清除率和溶解度为 指标，研究天麻素和葛根素配伍前后的变化，为二者制剂配伍 研究提供科学依据。 材料与方法 1. 仪器　BSl10S型万分之一电子分析天平（北京赛多利斯 仪器系统有限公司）；KQ-3200DE型数控超声仪（昆山市超声 仪器有限公司）；752型分光光度计（上海现科分光仪器有限 公司）；SHA-CA型恒温水浴摇床（金坛市荣华仪器制造有限公 司）；G16型医用高速离心机（白洋离心机厂）。 2. 试药与试剂　天麻素、葛根素对照品（中国药品生物制 品检定所，批号分别为110807-200205、752-9002）；天麻素、 ·研究报告· 拼版2.indd 2397 2013-7-29 18:07:28 • 2398 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2013年 8 月第28卷第8期 CJTCMP , August 2013, Vol .28, No. 8 葛根素原料药（四川省维克奇生物科技有限公司，批号分别为 100819、101025，纯度﹥98%）； DPPH自由基（美国Sigma公司， 批号STBB0719）；Vitamin C（北京环亚泰克生物医学技术有限 公司，批号A7611），其余试剂均为分析纯。 3. 方法 3.1 体外DPPH自由基清除作用 参照文献[15]，以DPPH自 由基清除率为指标，考察样品体外抗氧化能力。方法：0.5mL样 品及2.5mL DPPH自由基的混合溶液作为样品组，加入5mL离心 管中，摇匀，室温下密闭静置30min，于517nm波长下测定吸光度 值，记为As；以0.5mL空白溶剂和2.5mL DPPH自由基的混合溶 液为对照组，测得吸光度值为Ac；以0.5mL样品和2.5mL 95%乙 醇混合溶液作空白组，测得吸光度值为Ab；以等体积95%乙醇 和空白溶剂调零，以抗坏血酸（Vc）为阳性对照。 样品清除DPPH自由基能力按公式（1）计算清除率（SR）： ( )C S b C A - A -A SR(%)= 100% A   ×    （1） 式中：As：样品溶液+DPPH自由基溶液的吸光度；Ac：DPPH 自由基溶液+空白溶剂的吸光度；Ab：样品溶液+95%乙醇溶液 的吸光度。 3.2 DPPH自由基清除实验方法 3.2.1 DPPH自由基溶液线性范围考察：精密称定DPPH自 由基粉末3.6mg置100mL量瓶中，用95%乙醇定容，得浓度为 1.0×10-4mol/L DPPH自由基母液，分别取母液0.5、1.0、1.5、2.0、 2.5、3.0mL，用去离子水稀释至3mL，即得0.17×10-4、0.33×10-4、 0.50×10-4、0.67×10-4、0.83×10-4、1.00×10-4mol/L系列浓度DPPH自 由基溶液，于517nm处测定其吸光度（平行操作2份），以浓度（C） 对吸光度（A）进行线性回归，计算回归方程。 3.2.2 DPPH自由基溶液稳定性的考察：取2.5mL浓度为 1.0×10-4mol/L DPPH自由基溶液，加入0.5mL去离子水，即得浓 度为0.83mol/L DPPH自由基溶液，于0、5、10、15、20、25、30、 35、40、50、60、70、80和90min测定其517nm处的吸光度值，考 察DPPH自由基90min内稳定性。 3.2.3 样品清除DPPH自由基反应时间的考察：当样品中含自 由基清除剂时，会与DPPH自由基单电子配对，使其吸光度随时 间逐渐减小，直至平衡，故测定DPPH自由基清除率，需将样品 避光静置反应一段时间。本实验选取Vc与DPPH自由基反应，记 录不同时间点的吸光度值（A），以吸光度（A）为纵坐标，以时间 （min）为横坐标，绘制变化曲线，考察样品静置反应时间。 3.3 各成分IC 50测定　分别配制浓度为20 0g / L天麻素 （Gas）水溶液、100g/L葛根素（Pur）甲醇溶液及1g/L抗坏血酸 （Vc）母液。将各成分母液稀释为一系列浓度，测定各浓度样 品DPPH自由基清除率，并计算IC50。 IC50计算方法：将各样品浓度和相应清除率均转化为对 数，以浓度对数为横坐标，以清除率对数为纵坐标，得线性方 程，将1.699（即50%的对数）代入方程中求算IC50（DPPH自由基 清除率为50%时的浓度）。 3.4 不同浓度Gas和Pur DPPH自由基清除率相互影响 分别 用蒸馏水配制浓度为50、100、200g/L Gas溶液，用50%甲醇配 制5、10、20g/L Pur溶液及二者不同浓度配比的溶液，测定各浓 度样品DPPH自由基清除率，考察天麻素和葛根素自由基清除率 相互影响。 3.5 溶解度测定 3.5.1 Gas及Pur曲线的绘制：分别配制浓度为5、10、 15、20、30μg/mL的Gas溶液，浓度为2、4、6、8、10、12μg/mL 的Pur溶液，以蒸馏水为空白调零，于221nm处测定Gas吸光度 A221nm，250nm处测定Pur吸光度A250nm，以样品浓度C为横 坐标，以吸光度A为纵坐标，绘制Gas和Pur标准曲线并计算回 归方程。 3.5.2 天麻素及葛根素平衡溶解度的测定：分别精密称取 Gas、Pur原料适量，置于聚四氟乙烯离心管中，加入适量蒸馏 水，配成二者的饱和溶液，在室温下振荡48h，吸取上清液，经 0.45μm微孔滤膜过滤，用水稀释至适量体积，测定221nm和 250nm处吸光度，分别代入Gas和Pur标准曲线，计算Gas和Pur 平衡时的溶解度。 3.5.3 天麻素对葛根素平衡溶解度影响：分别精密称取过 量Pur 9份，每份中分别加入同等体积1、1.5、3、5、15、45、75、 150g/L的Gas溶液（平行操作2份），其余操作同“3.2.2项”，测 定250nm处吸光度，代入Pur标曲中计算不同浓度Gas下Pur的溶 解度。 4. 统计学方法　应用SPSS statistic 17.0软件（SPSS公司， 美国）对数据进行统计分析，多组间对比采用单因素方差分析 （one-way ANOVA），两组间比较采用独立样本t检验，显著性 水平α=0.05。 结果 1. DPPH自由基清除实验方法 1.1 DPPH自由基溶液线性范围考察　DPPH自由基溶液 回归方程为Y=0.9902X－0.0381（R2=0.9998），其在0.17×10-4 -1.00×10-4 mol/L范围内线性良好。 1.2 DPPH自由基溶液稳定性考察　结果见图1。可知， DPPH自由基溶液在90min内吸光度值较稳定，其RSD<1.0%。 图1　DPPH自由基溶液在90min内吸光度值变化曲线 时间（min） 吸光度A 0.800 0.700 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 0.0 20.0 60.040.0 80.0 100.0 拼版2.indd 2398 2013-7-29 18:07:29 • 2399 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2013年 8 月第28卷第8期 CJTCMP , August 2013, Vol .28, No. 8 1.3 样品清除DPPH自由基反应时间　一定量Vc与DPPH自 由基反应后，吸光度值随时间的变化曲线见图2。由图2可知，样 品溶液在4min内吸光度变化较大，10-30min内基本不变，故样 品加入DPPH自由基溶液的反应时间宜选择在10-30min，本实 验选择30min，以便有足够的时间处理大量的样品。 表1　天麻素、葛根素及二者配比后DPPH自由基清除率（ x-±s，n=3 ） 类别 分组 样品浓度（g/L） 清除率（%） Gas 低 50 1.58±0.24 中 100 1.55±0.18 高 200 1.86±0.14 Pur* 低 5 17.60±0.12 中 10 31.25±0.14 高 20 53.70±0.24 Gas+Pur 低+低 50+5 16.25±0.31 低+中 50+10 27.80±0.47 低+高 50+20 48.30±0.47 中+低 100+5 16.74±0.24 中+中 100+10 25.55±0.53 中+高 100+20 48.75±0.65 高+低 200+5 16.31±0.12 高+中 200+10 25.98±0.76 高+高 200+20 47.22±1.42 注：Pur低、中、高浓度间比较，*P<0.01。 时间（min） 图2 样品溶液吸光度值随时间的变化曲线 2. Gas、Pur IC50测定结果 Gas在浓度为0.5-200g/L浓度范 围内DPPH自由基清除率为0-1.86%，未超过50%，故无法计算 IC50，可推断其IC50值大于200g/L。Vc的 IC50值为0.024g/L，Pur IC50值为17.56g/L，虽不及Vc，但显示有一定的抗氧化能力。 3. Gas、Pur DPPH自由基清除率相互影响 不同浓度配比的 Gas、Pur与二者单独使用时的DPPH自由基清除率结果见表1。 Gas各浓度组间清除率均无显著性差异，Pur清除率随浓度 增加而增大。加入Gas后，Pur的清除率与单独Pur组比较无统计 学差异，即Gas并无清除DPPH自由基能力，也不能增加Pur的清 除能力；推测各合用组的清除率基本系由Pur产生的作用。 4. Gas、Pur平衡溶解度及相互影响考察　结果见表2和图3。 表2　样品平衡溶解度测定结果（x-±s, n=6） 样品 加入Gas浓度（g/L） 平衡溶解度（g/L） Gas - 303.81±3.27 Pur - 1.62±0.02 Pur+Gas 1.0 1.59±0.03 1.5 1.60±0.23 3.0 1.67±0.02** 5.0 1.67±0.03** 15.0 2.09±0.14** 45.0 3.09±0.03** 75.0 4.63±0.01** 150.0 8.24±0.56** 注：与Pur比较，**P<0.01。 P ur 溶 解 度 增 加 量 （ g/ L） 加入Gas浓度（g/L） 图3 Pur溶解度增加量与加入Gas浓度关系 室温下，Gas在水中的平衡溶解度为303.81g/L，与文献[16]报 道的312g/L基本一致；Pur平衡溶解度为1.62g/L，而文献[9-14]报 道在2.87-6g/L范围内，本实验值与文献报道有较大差别。推 测纯度对葛根素溶解度影响较大，本批葛根素原料的纯度较高 （99%），导致溶解度偏低。 与不同浓度Gas配伍后，Pur溶解度有所变化，加入1.0、 1.5g/L Gas后，Pur平衡溶解度与单独Pur组无显著性差异，而 其余浓度组均能显著提高Pur平衡浓度，最高者可增加4.1倍 （P<0.01），见表2，且Pur溶解度的增加与Gas浓度呈线性关 系，见图3，表明一定浓度的Gas可改善Pur溶解度。 讨论 由于许多疾病的发生和发展与自由基对组织细胞的损伤 密切相关[17]，因此，DPPH自由其清除率往往作为抗氧化的指标 之一[18]。实验表明，该法简便易行，灵敏可靠，不失为筛选中药 抗氧化剂的好方法。结果表明，天麻素并无清除DPPH自由基作 用，与廖全斌等[19]研究结果一致。天麻素体内呈现的抗氧化作 用，是否通过其他途径有待进一步证实；而葛根素显示了一定 的抗氧化作用，其IC50值为17.56 g/L。 据文献报道[17]，天麻素在水中平衡溶解度为312g/L，葛根素 平衡溶解度不超过6g/L[9-14]，本实验测定结果为1.62g/L，而且显 R Y X 拼版2.indd 2399 2013-7-29 18:07:30 • 2400 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2013年 8 月第28卷第8期 CJTCMP , August 2013, Vol .28, No. 8 示天麻素150g/L时使葛根素的溶解度增加了4.1倍，由此可推测天 麻素可能通过提高葛根素的溶解度，而增加葛根素在大鼠血浆 的AUC值，提高其相对生物利用度，验证了前期研究结果。 参 考 文 献 [1] 于秋红.葛根天麻钩藤饮改善高血压病症状临床研究.光明 中医,2007,22(7):50-52 YU Qiu-hong.Clinical research of improvement on hypertension symptoms with Gegen Tianma Gouteng decoction.Guangming Journal of Chinese Medicine,2007,22(7):50-52 [2] 饶和平.天麻葛根二陈汤治疗急性脑出血52例.中国中医急症, 2007,16(2):230-231 RAO He-ping.Tianma Gegen Erchen decoction for treatment of 52 cases with acute cerebral hemorrhage.Journal of Emergency in TCM,2007,16(2):230-231 [3] 王俊文.通络化瘀镇眩汤治疗治疗椎-基底动脉供血不足致 眩晕疗效观察.辽宁中医杂志,2010,37(S1):144-145 WANG Jun-wen.Efficacy observation of Tongluohuayuzhenxuan decoction for treatment of patients with vertebra-basilar artery insufficiency vertigo.Liaoning Journal of TCM,2010,37(S1):144-145 [4] 吴思凤.浅谈天麻素药理作用及临床应用分析.中医临床研究, 2011,3(22):93 WU Si-feng.Pharmacological effects and clinical application of gastrodin.Clinical Journal of Chinese Medicine,2011,3(22):93 [5] 赵莹莲.葛根素的药理作用及临床应用进展.安徽医药,2010, 14(12):1377-1379 ZHAO Ying-lian.Development in pharmacological application of puerarin.Anhui Medical and Pharmaceutical Journal,2010, 14(12):1377-1379 [6] 李维香.天眩清联合葛根素治疗眩晕临床疗效观察.吉林 医学,2010,31(21):3489-3490 LI Wei-xiang.Efficacy observation of gastrodin injedtion combined with puerarin injection for treatment of vertigo.Jilin Medical Journal,2010,31(21):3489-3490 [7] 任剑锋,马耒,刘宏,等.联合应用葛根素与天麻素治疗眩晕75 例.中国民族民间医药,2010,19(5):151-152 REN Jian-feng,MA Lei,LIU Hong,et al.Combined application of gastrodin and puerarin for treatment of 75 cases with vertigo. 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