影响血凝抑制试验因素的研究进展

　[收稿日期 ] 　2008209206 ; 2009202214 修回 　[基金项目 ] 　河南科技学院青年科学基金 (20040912) 　[作者简介 ] 　杭柏林 (1978 - ) ,男 ,硕士 ,讲师 ,从事动物微生物学与兽医卫生检验学的教学与科研工作。E2mail :yzhbl001 @yahoo . com. cn [文章编号 ]100123601 (2009) 032016520111203 影响血凝抑制试验因素的研究进展 杭柏林1 , 胡建和1 , 刘丽艳1 , 李 杰2 (1. 河南科技学院 动物科学学院 , 河南 新乡 453003 ; 2. 河南省新乡市畜产品质量监测检验中心 , 河南 新乡 453003) 　　[摘 　要 ] 血凝抑制试验 ( HI)在畜牧业生产中应用非常广泛 ,但是影响其试验结果的因素较多。对红细胞、抗原、血清、稀 释液、温度、作用时间及判定时间、试验器材、试验方法、判定方法和操作等因素对 HI 试验的影响进行了概述 ,以期能对生产 应用提供参考。 [关键词 ] 血凝抑制试验 ; 影响因素 [中图分类号 ] S852. 5 + 2 [文献标识码 ] A Re search Progre ss on Influencing Factors of Hemagglutination Inhibition Te st HAN G Bo2lin1 , HU Jian2he1 , L IU Li2yan1 , L I J ie2 (1 . College of Animal Science , Henan I nstitute of Science and Technology , Xinxiang , Henan 453003 ; 2 . Xinxiang Monitor and I ns pection Center f or Qualit y of Livestock Products , Xinxiang , Henan 453003 , China) 　　Abstract : Hemagglutination inhibition test , used generally in animal husbandry practice , are effected by many factors. This paper mainly discussed the influencing factors such as erythrocyte , antigen , serum , dilution , temperature , time , test equipments , test methods , assessment methods and operation in order to provide reference for clinical application. Key words : hemagglutination inhibition test ; influencing factors 　　血凝抑制试验 ( H I) 是新城疫和禽流感等疾病 的诊断和研究工作中普遍应用的一种方法[1 ] ,主要 用于检测血清中抗体效价、病毒鉴定、监测病毒抗原 的变异、流行病学调查、动物群体疫情的监测等[2 ] 。 做好 H I 试验 ,确保它的准确性是相当重要的一项 工作。然而 ,影响 HI 试验结果的因素较多 ,现从红 细胞、抗原、血清、稀释液、温度、时间、试验器材、操 作、试验方法和判定方法等因素对 HI 试验的影响 进行了概述 ,以期为同类研究和生产应用提供参考。 1 红细胞 1 . 1 红细胞的来源及浓度 1. 1. 1 红细胞的来源 如果红细胞来源于同一只 禽 ,则可能产生自凝现象[ 3 ] 。因此 ,应选择 3～4 只 健康禽的血液混合后制成红细胞悬液 ,以减少自凝 现象的干扰[1 ,4 ] 。这些健康禽最好是 SPF (无特定 病原)级 ,但生产中很难做到 ,可以选择健康非免疫 禽 ,迫不得已使用免疫禽时 ,要经多次洗涤 ,充分洗 去血清[3 ] 。最好饲养成年公禽以提供优质红细胞 , 每半年进行 1 次更替[5 ] 。做 HI 实验时 ,用禽类红 细胞检测同种禽类血清抗体效价时 ,基本上不出现 非特异性血凝现象[526 ] 。若用鸡红细胞悬液检测水 禽禽流感血清抗体时 ,常存在非特异性凝集现象 ,有 时严重影响结果判定[7 ] 。 1. 1. 2 红细胞的浓度 在生产中常用 0. 5 %～1 % 的红细胞[8 ] 。但不同浓度的红细胞对 HI 效价有一 定的影响[1 ] 。相对来讲 ,浓度大时 , H I 值相对较小 , 而浓度小时 , HI 值相对较高[3 ,829 ] 。当浓度为 1 % 时 ,沉降的血点过大 ;浓度为 0. 5 %时 ,沉降的血点 太小 ,不易判断 ,且沉降速度较慢[4 ] 。 1 . 2 红细胞的制备及醛化 1. 2. 1 制备 为保证悬液中红细胞的稳定性和浓 度的准确性 , 离心时要掌握好离心速度和时 间[1 ,8 ,10 ] ,同时固定洗涤液 ,洗涤时要尽量除去面 的白细胞膜[10 ] ,洗涤次数不宜过多 ,肉眼观察上清 液澄清透明即可 ,若次数过多 ,红细胞破裂导致上清 液呈红色[5 ] ,读取离心管时以下凹线刻度为准[11 ] 。 有的鸡红细胞沉降慢 ,静置 30 min 仍不能沉淀下 来。因此 ,制备好的红细胞 ,一定要先观察血沉 ,不 合格的不用[4 ] 。使用前必须混匀红细胞 ,并不时摇 动[8 ,12 ] 。不用的红细胞悬液应保存于 4 ℃,且不超 过 2 d[9 ,12 ] ,保存时间过长或受细菌污染均可发生自 凝 ,从而影响检测结果[9 ] 。 1. 2. 2 醛化 新鲜红细胞质脆易碎 ,不易保存 ,应 随配随用。而醛化红细胞性质稳定 ,在蒸馏水中不 溶血 ,不易腐败 ,可在 4 ℃条件下保存数月至 1 年。 使用方便 ,反应均一、稳定 ,图像清晰 ,结果均一和易 于判定等优点[ 12 ] 。但用醛化红细胞的检测结果比 新鲜红细胞低 1～2 个效价[13 ] 。 2 抗原与血清 2 . 1 抗原 2. 1. 1 抗原性[8 ] 一般采用凝集价高、凝集时间 长的抗原。当抗原性较差或抗原比较陈旧时 ,抗原 对红细胞的凝集能力下降 ,凝集后解凝时间变短。 因此 ,一般使用新的抗原。 　贵州农业科学 　2009 ,37 (3) :111～113 　Guizhou Agricultural Sciences 2. 1. 2 浓度 抗原浓度降低 , HI 值增大 ;抗原浓 度升高 , H I 值减小 ,每增加 1 倍浓度 ,下降 0. 9～ 1. 1 log 2 [3 ] 。抗原浓度太高或太低都不能准确反映 所检测抗体的效价[ 9 ] 。做 H I 试验前 ,对配好的 4 单位抗原液进行滴定检验[1 ] 。若 2 单位抗原、1 单 位抗原完全凝集 ,1/ 2 单位抗原完全抑制 ,则抗原配 制准确 ,如果不合要求 ,则对所配溶液进行校正至合 格为止[4 ] 。如果用冻干抗原 ,监测前用红细胞凝集 ( HA) 试验滴定抗原效价 ;如果用稳定抗原 ,启用时 每瓶都应重新滴定效价 ,若测得效价与瓶签标明效 价不符 ,应按实测效价稀释使用[ 10 ] 。如果用指定单 位的抗原 ,试验前也应做抗原效价测定 ,若效价很 高 ,可适当稀释后重新测定[5 ] 。抗原效价每 3～4 周 测定 1 次 ;4 单位和 8 单位抗原应现配现用 ,剩余丢 弃报废 ;抗原尽量避免反复冻溶 ,否则引起效价下 降[11 ] 。 2. 1. 3 纯化[ 9 ] 未纯化抗原在使用过程中效价下 降很快 ,且可能含有与红细胞发生凝集的物质 ,导致 4 单位抗原不准 ,从而影响试验结果。试验前对抗 原采用已知效价的阳性血清进行标定 ,以确保 抗原的纯度。 2. 1. 4 亲和力[9 ] 主要针对禽流感病毒而言 ,因 禽流感病毒变异性高 ,在 H I 试验中经常会出现不 同厂家相同亚型禽流感抗原检测的同一血清血凝抑 制效价不同。因此 ,应挑选高亲和力毒株来制备检 测抗原 ,提高诊断的准确性。 2 . 2 血清 2. 2. 1 样本 随机抽样时 ,样本要能代表整个鸡 群 ,分布要均匀 ,且数量要足够[1 ] 。在鸡舍内不同位 置随机抓取 ,使抽样结果能反映整群鸡的情况 ;幼雏 可用心脏采血 ,以保证足够的待检血量[10 ] 。 2. 2. 2 质量 被检血清要求新鲜、无杂质、无红细 胞、不腐败 ,盛装容器要清洁无菌[425 ,11212 ] 。正常鸡 血清为清亮透明或微黄色。当血清被细菌严重污染 或长时间置于高温环境中时 ,血清变成浑浊的黄色 ; 变质的血清会发生凝集反应 ,使含较高抗体的血清 在 H I 试验中出现前几孔凝集而后几孔凝集被抑制 的现象[9 ] 。在采血时 ,如果快速推动血样到离心管 , 则易使红细胞发生溶解 ,溶解的红细胞稀释了血清 , 进而影响 HI 的结果[9 ] 。血清在加温或保存过程中 一旦出现沉淀 ,也容易引起非特异性凝集 ,这可用红 细胞吸收或通过离心除去[2 ,14 ] 。 2. 2. 3 非特异性因子 大多数动物体内都含有非 特异性凝集因子 ,如血清中的唾液酸残基会模拟红 细胞受体 ,同红细胞受体竞争与血凝素的结合 ,从而 导致非特异性抑制和假阳性结果[7 ] 。被检动物血清 自然凝集素也会影响红细胞被抑制凝集 ,出现假阴 性或降低血清抗体效价 ,造成阳性动物漏检或误 检[15 ] 。不同动物血清与不同动物红细胞之间也有 非特异凝集作用 ,有时会掩盖特异性抗体的血凝抑 制作用 ,以致出现假阴性[6 ] 。对于鸡血清来说 ,常用 鸡红细胞来检测 ,对结果的影响不大 ;而用鸡红细胞 来检测其他动物的血清抗体时 ,常存在非特异性凝 集现象 ,严重时影响结果判定 ,如果用鸡红细胞检测 水禽禽流感血清抗体时即有这种情况。而鸭禽流感 血清用鸭红细胞悬液 ,鹅禽流感血清用鹅红细胞悬 液 ,则几乎可完全消除非特异性凝集因子对检测结 果的影响[7 ] 。 3 稀释液 3 . 1 类型 用生理盐水作稀释液时要注意盐浓度不能太 高 ,在一定浓度时会发生盐类凝集现象[9 ] 。生理盐 水应无菌、新鲜、无杂质 ,如果采用自制盐水 ,应采用 活性炭吸附、滤纸过滤、高压灭菌后测定 p H 值 ,如 有偏差 ,加入磷酸二氢钾调至 p H 值 7. 0 时即不会 发生溶血现象[11212 ] 。用磷酸盐缓冲液 ( PBS) 作稀释 液比生理盐水测定的抗体效价要高 ,可提高检出 率[16 ] 。所有稀释液都要高压灭菌 ,避免细菌污染而 影响试验结果[9 ] 。 3 . 2 p H 值 采用 PBS 作稀释液 ,p H < 5. 8 时红细胞易自 凝 ,p H > 7. 8 时凝集的红细胞解凝加快 ,p H 为 7. 0 时红细胞沉淀最充分 ,图形最清晰[1 ,3 ] 。采用生理 盐水作稀释液 ,p H < 6. 5 或 p H > 7. 4 ,红细胞发生 溶血现象 ,p H 为 7. 0 时不发生溶血[ 12 ] 。因此 ,最佳 p H 值为 6. 5～7. 4 ,通常用 p H 值为 7. 0 左右的稀 释液 ,最适宜于鸡红细胞 ,效价高且图像清晰[12 ] 。 4 时间与温度 4 . 1 时间 4. 1. 1 作用时间 HI 效价随作用时间延长而升 高 ,37 ℃下作用 30 min 已接近最高值 ,再延长时间 , HI 值上升甚微[3 ,12 ] 。温度低 ,递增慢 ,达最高值所 需时间长 ;温度高时则相反。作用时间一般为 25～ 30 min。时间太短 ,抗原和血清反应不完全 ,加入红 细胞后红细胞与抗体争夺抗原 ;时间太长 ,因病毒抗 原神经氨酸酶的作用使已凝集的红细胞缓慢释放出 来 ,从而影响试验结果[9 ] 。 4. 1. 2 判定时间 用浓缩抗原作 HI 试验 ,室温在 15～37 ℃时 ,判定时间对 H I 效价的影响很小 ,以 LaSota 浓缩抗原最好。用疫苗作为抗原 ,则影响较 大 ,时间长短都不行[ 3 ] 。判定时间以 30～40 min 为 宜。红细胞对照孔达到完全凝集时 ,开始判定[11 ] 。 观察要及时 ,最好每 5 min 观察 1 次[425 ] 。 4 . 2 温度 试验要求感作室温在 20 ℃,若室温高时 , HA、 HI 试验反应加快 ,红细胞解凝时间变短 ;当室温低 时则相反[4 ,8 ] 。从 4～37 ℃,随温度升高 , HI 效价会 上升 ,每提高约 5 ℃,平均上升 0. 35 log2 [3 ] 。如果室 温低于 4 ℃,红细胞发生自凝 ,在 37 ℃时 ,凝集的红 细胞易洗脱[9 ] 。常把 18～22 ℃作为试验最适宜温 度范围[ 1 ] 。温度对 H I 的影响主要发生在加红细胞 前 ,在最初 30 min 内使 HI 效价递增显著 ,随作用时 ·211· 　　　　　　　　　　　 　　　　　贵 州 农 业 科 学 2009 ,37 卷 间延长而变缓[ 1 ] 。当室温过高时 ,会蒸发部分液体 反应物 ,且影响抗原活性[9 ] ,同时因反应速度加快 , 因此 ,判定时间要相应提前 ,不可在接近解凝时才判 定 ,否则测出的 HI 抗体水平会升高[8 ] 。夏天最好 在 4 ℃观察试验结果[ 14 ] 。环境温度太低 ,反应速度 减慢 ,红细胞凝集时间延长。当温度低时延长 HA 和 H I 的反应时间 ,或把反应板置 37 ℃培养箱中 ,可 解决此类问题[8 ] 。 5 试验器材 5 . 1 微量血凝板及移液器 5. 1. 1 微量血凝板 使用的微量板有 U 和 V 型 , V 型板测得的 HA 效价略高于 U 型板 ,且图像清 晰、典型 ,易于判定 ;新 V 型板底部光滑、图像清晰 , 而旧 V 型板底部因长期接触滴头 ,且每次稀释数次 以上 ,磨损大 ,造成图像不清 ,判断失误 ,进而影响 H I 试验结果[11 ] 。反应板用时间过长 ,因洗刷不及 时或洗刷不彻底 ,有时会使反应前后跳孔 ,无法正确 判定试验结果[8 ] 。 5. 1. 2 移液器 移液器常常产生移液量不准确、 吸取量不够或排液量不充分 ,这些因素均会影响检 测结果。排液时 ,若吸头内有液体滞留 ,则移液器不 准。若吸头没排空就使用移液器移稀释血清 ,所测 H I 效价变高[8 ] ;使用多头微量移液器时 ,要把每个 吸头安装牢固密封 ,手压力度均匀 ,否则由于移液量 偏差造成试验结果不准确[10 ] 。 5 . 2 吸头、振荡器与恒温箱 5. 2. 1 吸头 操作时 ,吸头接触微量反应板底部 , 且每次稀释数次以上 ,对吸头和反应板底部磨损较 大 ,致使反应时图像不清 ,判断失误[4 ] 。 5. 2. 2 振荡器与恒温箱 振荡器工作平稳匀速、 无异常抖动、振颤。恒温箱温度能精确保持设定温 度[11 ] 。 6 操作、试验方法及判定方法 6 . 1 操作 血清稀释后加红细胞 ,应从最后 1 个孔加起 ,吸 头避免接触孔内的液体 ,以免影响结果 ,造成人为干 扰[11 ] 。稀释血清时 ,如果混合不均匀 ,会使结果出 现差异 ,如果用微量移液器吹打时 ,孔内和吸头内都 易产生气泡 ,稀释不充分 ,而且稍不小心 ,孔内的液 体就会溅出 ,影响试验结果的准确性[4 ] 。 6 . 2 试验方法 全量法和β2微量法的原理是一致的。全量法误 差小 ,但操作慢、耗抗原及器材多 ;微量法节省抗原、 测样多。如果用多头移液器可同时检测 4～8 个血 样 ,但要求操作者认真、熟练 , 否则即会产生误 差[10 ] 。在全量法和微量法中以生理盐水为稀释液 , 以 1 %红细胞悬液作反应指示剂和完全凝集抑制为 判定终点的方法效果较好 ;全量法测得的 HI 效价 较微量法约高 0. 5～1 个效价 ,其灵敏度和准确性较 高[17 ] 。 6 . 3 判定方法 不同的人在判断 75 %、50 %、25 %的凝集或凝 集抑制时 ,判断结果差异较大 ,而对 100 %的凝集或 凝集抑制基本上无差异。实际应用时一般以 100 % 抑制为判断终点[10 ] 。 7 结语 影响 HI 试验的因素有很多 ,在进行试验前应 综合考虑各方面的影响因素 ,选定一个适合自身实 验室条件的试验标准 ,及时清洗、更换反应板和吸 头 ,并固定试验条件和判定标准 ,可降低试验误差。 [参 考 文 献 ] [ 1 ] 杨 文 ,孙文梅 ,江燕萍. 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