胶体金标记血小板膜糖蛋白的免疫电镜研究

中国血液流变学杂志.2008;18(2) 179 免疫电镜技术中的标记物之——胶体金具有灵 敏度高、特异性强、易于辨认、定位准确，可多重标 记等优点，从1971年开始使用，经过30多年的发 展，已成为目前最常用的标记物，可对组织细胞表面 和内部的抗原进行定性、定量、定位分析与观察[1]。 血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)在血小板的 胶体金标记血小板膜糖蛋白的免疫电镜研究 吴淑燕 1，黄 瑞 1，王响英2，李苏安2，毛棣华2 （1.苏州大学医学院基础医学系微生物学教研室，江苏苏州 215123；2.苏州大学分析测试中心，江苏苏州 215006） 摘要：目的 建立胶体金标记血小板膜糖蛋白的稳定的免疫电镜技术，为开展血小板功能研究奠定基础。方法 采集 正常人外周静脉血，分离富血小板血浆，采用微波固定、常规固定两种方法，一抗为抗血小板GPⅢa单抗SZ21，分别 选用直径10nm胶体金标记的羊抗鼠IgG（GAM-G）、直径15nm胶体金标记的葡萄球菌A蛋白（SPA-G）为探针。结 果 微波固定组血小板表面和开放管道系统可见到大量金颗粒的分布，而常规固定组的血小板未观察到金颗粒。结论 以 微波固定的方法，用大小合适的胶体金探针可特异性定位血小板表面和内部膜糖蛋白。 关键词：血小板；胶体金；免疫电镜；微波 中图法分类号：R329-33 文献标识码：A 文章编号：1009-881X(2008)02-0179-02 The Analysis of Platelets Glycoprotein Using Immuno-electron Microscopy Labeled with Colloidal Gold Probe WU Shu-yan,HUANG Rui,WANG Xiang-ying,LI Su-an,MAO Di-hua (Darpartment of Microbiology,Medical School of Soochow University,Suzhou 215123) Abstract:Objective To illustrate the fine structural localization of glycoprotein in human platelets surface, and outline our preferred methods for processing immuno-electron microscopy.Methods Platelet-rich plasma was separated from whole blood using the method of static precipitating treatment, and the samples were centrifuged to pellets, then fixation was accomplished by 1.25% glutaraldehyde using usual methods and microwave irradiation, respectively.0.05% Triton X-100 was used to permeate the platelets membrane.The primary antibody SZ21 was the monoclonal anti-human platelets glycoprotein Ⅲa.Gold-labeled secondary antibody was goat anti-mouse (GAM) conjugated with 10nm gold particles.Staphylococcus protein A-15nm colloid gold particles (SPA-G) was also used. Results Large masses detected by SZ21 antibody were seen on the platelets surface of the microwave irradiation fixation group. Immuno-gold was seen also inside the platelet open canalicular system in the SPA-G group.colloidal gold probe was not detected both in the platelet of usual fixation group and in the negative control group.Conclusions The platelet glycoprotein Ⅲa antigen could be fine located by microwave irradiation fixation using 10nm colloidal gold probe. Key words:Platelet;Colloidal gold;Immuno-electron microscopy;Microwave irradiation 粘附、聚集功能中起重要作用，其中GPⅡb与GP Ⅲa两种糖蛋白在膜上以1:1构成复合物，该复合物 是粘附蛋白受体超家族中的一员，能表达血小板多 种受体功能，所连接的配体包括纤维蛋白原、纤维 连接蛋白、vWF等粘附蛋白分子。GPⅢa是结合 这些配体的主要受体，参与生理和病理性血小板聚 基金项目：苏州大学医学发展基金(课编号EE134619) 收稿日期：2007-06-07 作者简介：吴淑燕(1972-),女,山东潍坊人,讲师,医学博士,从事分子微生物学和出血性疾病的发病机理 研究。 Chin J Hemorh.2008;18(2)180 集过程[2]。由于试剂昂贵、操作程序烦琐等原因， 血小板GP免疫电镜的资料不多。本研究中，我们 对血小板表面和细胞质开放管道系统膜GP Ⅲa的胶 体金免疫电镜包埋前技术进行了探索。 1 材料和方法 1.1 材料 ZD-Ⅲb型医用微波炉（上海中达医学应 用研究所产品），输出功率为540W，9档。鼠抗 人血小板GPⅢa 单克隆抗体SZ21由江苏省血液研 究所惠赠。直径10nm胶体金标记的羊抗鼠IgG （GAM-10nm gold）购自荷兰Aurion公司，直径 15nm胶体金标记的葡萄球菌A蛋白（SPA-15nm gold）购自深圳康百得生物科技有限公司。 1.2 血小板免疫电镜标本的制作 用一次性塑料注射 器抽取10名健康人外周静脉血5mL，以3.8%枸橼 酸钠按9:1抗凝，轻轻混匀后室温静置1h，分离上 层富血小板血浆（PRP），800rpm/min离心10min， 弃上清，沉淀的血小板内加入1.25%戊二醛，混 匀，一组采用微波固定法[3]，另一组用1.25%戊二 醛4℃固定2h。微波固定时，用冰水将温度控制在 15℃以下，输出功率540W作用5s后，室温放置 10min。两组血小板吸去戊二醛后均用0.1mol/L PBS 洗涤5次, 每次混匀后停留30min。洗涤完成后加入 0.05% 氚核（Triton）X-100，混匀，立即离心5min， 用相同洗液洗3次后加入1:10稀释的SZ21，35℃孵 育2h，放入4℃冰箱过夜，再用PBS洗3次，离心后 一组加入15nm胶体金标记的SPA原液，另一组加入 1:10的10nm胶体金标记的羊抗鼠IgG，35℃ 2h后， 4℃过夜，PBS洗涤后用2%戊二醛作用2h，以下 按常规电镜标本制备步骤进行。阴性对照组除不与 一抗孵育外，其余步骤与实验组相同。 2 结果 各组血小板的超微结构均保存良好；1.25%戊 二醛固定2h的血小板以两种胶体金探针标记后均 无阳性结果；1.25%戊二醛微波固定的血小板表面 可见到大量金颗粒，其中GAM-10nm gold组还可 见到血小板开放管道系统金颗粒的分布；阴性对照 组血小板表面及开放管道系统无胶体金颗粒(图1~ 图3)。 3 讨论 包埋前免疫电镜技术的免疫反应在包埋前进 行，然后再制备成超薄切片，由于在固定前后未经 其它化学试剂和高温聚合过程就完成了免疫染色，所 以能更好地保存抗原性，标记的阳性率高且非特异 性反应少[4]。有报道称包埋前免疫电镜技术不利于 组织细胞形态结构的保存，我们的体会是只要把握 好细胞的固定，本技术不但能提高标记的敏感性， 而且能将细胞的超微结构固定在理想状态。 免疫电镜技术中超微结构和抗原活性的保存是 一对矛盾，固定弱会造成超微结构的保存不良，固 定强则会破坏抗原的活性，一般认为免疫电镜标本 固定的最佳是使用多聚甲醛加低浓度的戊二醛 [5]，但颜永碧等报道游离细胞特别是血细胞不适宜 使用多聚甲醛固定，而使用1.25%的戊二醛加微波 照射固定效果会更好。在本实验中我们分别以1.25% 戊二醛常规固定和微波固定的方法，发现前者以两 种胶体金探针标记后均无阳性结果，说明戊二醛作 用时间偏长破坏了血小板膜GPⅢa抗原的活性，提 醒我们在不破坏细胞超微结构的前提下，应尽可能 缩短固定剂作用的时间。微波技术可以大大缩短固 定的时间，因此对抗原活性的破坏较小，在后种方 法中，血小板表面不但能见到大量金颗粒，而且其 图1 阴性对照组 图2 微波固定SPA-15nm gold金探针组 图3 微波固定GAM-10nm gold金探针组 （下转第216页） Chin J Hemorh.2008;18(2)216 本组32例均在翼点或扩大翼点入路显微镜下经侧裂清 除血肿。该方法的优点在于： (1)经侧裂入路，最大限度减 少脑组织的损伤，特别是在分离侧裂的过程中，由于脑脊 液的释放，充分松弛脑组织，避免了脑组织的牵拉性损伤， 从而达到微创的目的；而小骨窗有时因脑的膨出而无法分离 侧裂难以达到微创的目的。(2)比之经颞中回入路，具有路径 短、脑损伤小的特点。(3)经翼点或扩大翼点开颅 虽然时程 稍长，但微侵袭体现的是对脑组织而言， 经此开颅暴露侧裂 充分，给显微手术提供了良好的操作空间，避免了对脑组 织的过度牵拉。(4)对较严重的脑水肿，经此开颅可以有效的 减压，还可根据术中情况可将骨瓣去除，以度过脑水肿期。 血肿的清除程度：对脑内血肿所产生代谢产物危害认 识的不足和对脑内血肿壁的处理困难导致日前对脑内血肿采 取部分清除术的手术方式。 较多学者认为，高血压脑出血无 须将血肿全部清除， 理由是脑出血的主要危害是颅内压增高 及脑组织的直接受压，因而只要清除总出血量的60％~70％ 就可以了[2]。由于残留血肿较多；血肿的降解产物如5-羟色 胺、组织胺、血管内皮素及出血后所产生的自由基的影响 导致了脑梗死等严重并发症[3 ]；残留血肿的长时间吸收导致 病人出现更多的心、肺、消化系统的并发症。脑内血肿占 位效应的危害性已经为大家所公认，但血肿是否对周围脑组 织产生毒性作用，还缺乏更多的了解[4]。实验证明，凝血 过程中可以产生各种毒性代谢产物，故血凝块产生的危害比 在数小时内注入同样体积的无活性占位物质产生的危害更大 [5~7]。对凝血过程的研究发现，出血前24h内，在血块形成 的过程中凝血酶的释放，会引起邻近脑组织水肿、血脑屏 障破坏和细胞毒作用使红细胞溶解是脑水肿的另一种原因[7]， 所有这一切均严重影响了治疗效果。本组32例病人采用显 微镜下彻底清除血肿，较理想地解决了继发性脑损伤和残留 血肿这一对矛盾，手术后复查CT未见再出血发生，充分说 明了显微镜下止血的可靠性。而且，由于对脑深部血管更 好的保护，给脑出血病人肢体功能的恢复带来了希望。 参考文献 [1] 王忠诚.神经外科学[M].第1版.武汉:湖北科学技术出版社, 1998.704. 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[7] Xi G,Keep RF,Hof JT.Erythrocytes and delayed brain edema formation following intracerebralhemorrhage in rats[J].J Neurosurg,1998,89(6):991. （上接第180页） 超微结构亦得到良好的保存，证实1.25%的戊二醛 加微波固定的方法可兼顾抗原活性和超微结构两个 方面，是免疫反应之前的较为理想的固定方法。需 要指出的是血小板用戊二醛固定后残留有自由醛基, 可能导致难以清除的非特异性染色，因此血小板需 彻底漂洗，为防止免疫标记阳性反应物在反复、多 次、长时间的洗涤过程中脱落，血小板与胶体金探 针作用之后，还应再以2%戊二醛常规固定。 血小板GPⅢa分布在血小板表面和血小板内部 的开放管道系统(open canalicular system, OCS)，因 为戊二醛是通过与蛋白质的交联作用来达到固定效 果的，所以与细胞作用后，抗体等大分子物质穿透 细胞的难度增大，通常对细胞内部抗原进行免疫标 记时，须使用某些具有表面活性作用的物质作为穿 透剂，使细胞通透性得到改善。但穿透剂对细胞超 微结构和抗原有一定的破坏性。我们证实用0.05% 的TritonX-100作用5~10min，可以兼顾到通透性与 超微结构的保存，实验组可清楚看到血小板内部 OCS的GPⅢa抗原定位。 胶体金免疫电镜技术步骤繁多，结果易受到多 因素的影响，除以上几点外，还要注意为在背景清 晰的前提下得到较强的阳性信号，血小板与SZ21单 抗和胶体金探针的剂量关系需经过预实验的系列摸 索；血小板与SZ21单抗和胶体金探针孵育的温度 不宜超过37℃；血小板内OCS抗原的标记需选用 10nm以下的金探针。 参考文献 [1] 吕 伸,王 杉,常文保.胶体金免疫分析方法的进展[J].武汉 大学学报(自然科学版),2000,46(4):393~399. [2] 张之男,杨天楹,郝玉,主编.血液病学()[M].第1版. 北京:人民卫生出版社,2003.1530~1533. [3] 颜永碧,王 英,陆月良.游离细胞内抗原的免疫电镜胶金标 记方法[J].第二军医大学学报,2003,24(1):10. 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