疟原虫检验技术

null疟原虫镜检技术疟原虫镜检技术 西双版纳州疾控中心 李鸿斌 null●分子生物学、血清学技术发展迅猛,但是确诊疟疾的“金标准” 仍然是血液显微镜检查 ●显微镜检查是唯一可鉴别4种疟原虫的方法 ●厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代的疟疾诊断的金标准 实验室技术厚薄血膜的制作 厚薄血膜的制作 镜检技术—血片制作制作血片前，首先要核对患者的姓名和年龄取血部位和血量取血部位和血量 取血方法 采血部位：耳垂或无名指，通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒米大小。 null厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转2~4圈，涂成直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜。 薄血膜再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血膜适 当远的地方.将采血玻片(推片)的边缘紧贴载玻片使 血液沿边缘散开(如图示). null正确的推片姿势标准的疟疾厚薄血膜片位置标准的疟疾厚薄血膜片位置null各种不同的疟疾血片涂制法：标准血片门诊发热病人血片居民普查血片厚薄血膜的标准 厚薄血膜的标准 ●厚血膜血量适宜，不宜过多或过少 ●薄血膜平整,无皱折和空泡.红细胞单层排列血片染色 血片染色 两种染色方法: ●吉氏染色法 ●瑞氏染色法 常用吉氏染色法 吉氏染液(原液)的配置吉氏染液(原液)的配置 吉氏染粉 (Azure B type) 5g 甘油 (纯) 250ml 甲醇 (纯) 250ml ●吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨, 然后边加边磨，直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保存时间越长染色效果越好。 ●整个染色液配制时间不能少于5个小时稀释吉氏原液稀释吉氏原液●原液需经缓冲液或净水稀释后，方可用于厚薄血片染色。 ●吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果.null操作1 （快染） 量筒内量2ml缓冲液或净水，直接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾干镜检。 操作2 (慢染) 在量筒内量2ml蒸馏水或净水， 再滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，染色30~40min。清水细缓冲洗，晾干镜检。 吉氏染液浓度门诊染色null将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染 液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97毫升， 混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min （如染液不合标准时，得酌情增减染色时间和浓 度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标 本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。 成批血片染色null质量好的染色 : 显微镜下核呈红色,胞浆呈蓝色 如果血片偏红,说明染液偏酸性 如果血片偏蓝,说明染液偏硷性外观吉氏染色血片偏 酸偏 碱标 准染色过程染色过程血片平置于染色板上 用吸管吸取已稀释的吉氏液约2ml于厚薄血 膜上，染色10 min 清水细缓轻轻冲去染液 置玻片于插板上，自然晾干血片干燥后, 用甲醇固定薄血膜血片制作注意事项 血片制作注意事项 ● 载玻片必须清洁无油污，不然会影响血片制作和镜检结果． ● 用甲醇固定薄血膜时，甲醇不要接触到厚血膜 ● 血片充分干燥后染色，清水细缓冲洗。防止厚血膜脱落. ● 配置吉氏母液必须过滤除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量．疟原虫密度计算疟原虫密度计算计算疟原虫密度的三种方法： ● 白细胞原虫密度计数法　(厚血膜 WHO) ● 半定量计数法 (厚血膜) ● 红细胞感染密度计算法　(薄血膜)null● 在厚血膜按视野顺序，从看到第一个疟原虫开始计数，记录200个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和无性体），如果原虫密度较低，可增加白细胞计数500~ 1 000 个。 ● 白细胞疟原虫计算： 疟原虫数 ÷ 计数的白细胞数 × 患者每微升血白细胞数 = 疟原虫数/μl血。 ● 如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8 000个白细胞计数(国际标准) 。白细胞疟原虫密度计数法白细胞疟原虫计数法举例白细胞疟原虫计数法举例●假数200 WBC中有35个疟原虫，在不知患 者白细胞数的情况下，以每微升血8000个白细 胞计数, 由此计算出每微升血液疟原虫密度为：35（疟原虫数）÷200（计数的白细胞）x 8000（每微升血白细胞数） =1400 / μl答：该患者的疟原虫密度为1400 / μl。null用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量。 国内常用。此方法将密度分为6级： 1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字 2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野不到1个虫，记录“少” 3.平均每个视野1~5个虫，记录“＋” 4.平均每个视野6~10个虫，记录“++” 5. 平均每个视野11~100个虫，记录“+++ ” 6. 平均每个视野100个虫以上，记录“++++ ”。半定量计数法null薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较大差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检查一个角落，应顺玻片的横轴检查。选择红细胞排列整齐密集，无重迭的视野 镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫虫期，不要笼统地记录为Pv或Pf。红细胞疟原虫感染密度计算（薄血膜）null显微镜下（10目镜Χ100油镜）选择红细胞排列整齐密集，无重迭的视野（ 约300红细胞/视野） 红细胞疟原虫密度按以下公式计算： 1.红细胞疟原虫感染率（%）计算　　　　　　　　　 红细胞原虫感染率（%）= 疟原虫数 ÷计数的红细胞数X 100 2.红细胞疟原虫感染密度计算 红细胞疟原虫密度=红细胞原虫感染率X红细胞数/每微升血 （男性500万个/μl；女性450万个/μl）3. 如果能见到疟原虫，但是记数10000个红细胞时却 没有感染红细胞，那么设定感染率为＜１％ 红细胞感染率计算法（薄血膜）null如何确定疟原虫血片为阴性● 检查全部厚血膜未查见疟原虫 ● 最少检查100个厚血膜油镜视野未查见 疟原虫人类四种疟原虫的 基 本特征人类四种疟原虫的 基 本特征感染人的疟原虫有四种: 感染人的疟原虫有四种: 恶性疟原虫 P. falciparum 间日疟原虫 P. vivax 三日疟原虫 P. malariae 卵形疟原虫 P. ovale 恶性疟 P.falciparum 恶性疟 P.falciparum ● 分布热带、亚热带，是非洲的重要疾病 ● 我国流行区域为云南省和海南省 ● 四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者 感染后出现急性症状,不及时治疗可危及生命间日疟 P.vivax 间日疟 P.vivax ● 间日疟原虫分布于我国大部分地区,主要是中部地区 ● 病程良性, 有复发 ● 遍布全球温带地区及大片热带地区。在热 带非洲，特别是西非则很少见三日疟 P.malariae 三日疟 P.malariae 遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，圭亚那及印度部分地区，呈片状、块状分布 三日疟在我国非常少见，只在南方广西有过散在 无复发 卵形疟 P.ovale 又称蛋形疟原虫,主要分布非洲。太平洋地区、缅甸、东南亚有散在报告 在我国已基本消灭 症状与间日疟相似, 有复发 四种疟原虫的 形态特征 四种疟原虫的 形态特征 null红细胞不涨大 环状体钎细, 一个红细胞内可有几个环状体,环状体内可有2个核 环状体可贴在红细胞边缘 血片中没有其他发育期滋养体 配子体呈新月形或腊肠形 成熟裂殖体约含6-32个裂殖子 可出现茂氏点恶性疟（P.falciparum）鉴定 要点null 红细胞通常涨大 薛氏点明显 成熟环状体粗大 滋养体胞浆有阿米巴样伪足 血片中可见各期的原虫形态 成熟裂殖体约含12-24个裂殖子 间日疟（P. vivax ）鉴定要点null红细胞不涨大或略小 环状体可呈方形 胞浆不活跃呈带状形 成熟滋养体呈菊花状,内含6-12个裂殖子 核可能出现在环状体边缘 三日疟（P.malariae）诊断要点null卵形疟（P. ovale）诊断要点红细胞涨大 常见慧星状 (也称齿轮状) 环粗大 薛氏点明显 成熟滋养体类似三日疟原虫但更粗大 成熟裂殖体约含4-12个裂殖子 null镜检示教镜检示教以下血片采自现症病例nullA typical Plasmodium falciparum presentation.●Numerous fine ring forms ●Double chromatin dots ●Marginal forms ●Red cells are not enlargednullA typical Plasmodium vivax presentation●Salient features are: ●Developing and thick (signet) ring forms ●Enlarged red cells nullA typical Plasmodium ovale presentationDeveloping form of plasmodium Comet-like" red cells Enlarged red cell nullA typical Plasmodium malariae presentationBroad band form of plasmodium Red cells not enlargednullNumerous ring form of Plasmodium can be seen (as indicated by the arrows). Note size of neutrophils (for comparison).The only definitive diagnosis that can be made from this film is that Malaria is present. Thin films would have to be examined for species identification.null读片练习null2. Intermittent fever; arrived from India 2 months ago. null3. History of round the world safari including S. America, Asia and Africa. General malaise. null4. Unspecified overseas travel. Presented with temperature 38.4C null5. Male recently returned to Australia after backpacking through Asia. History of flu like symptoms. null6. "New Australian" previously from Malaysia. Intermittent temperatures and headaches. null7. Aches and pains, with fever. ? Glandular Fever, ?malaria. null12. Businessman; history of extensive overseas travel. Has had frequent bouts of "virus infections". null14. 50 year old male patient presented with fever after holidaying in Viet Nam. null18. Recent trip to Southern India- headaches and vaguely unwell. null19. Patient has been holidaying in the Dominican Republic, now feverish. null20. Unwell and feverish. null21. A member of the UN forces in East Timor. Presented with high temperature. nullnullnullnullnullnullnullnull