食物过敏原免疫学检测技术进展综述

食物过敏原免疫学检测技术研究进展 浅谈食物过敏原免疫学检测技术研究进展 专业：食品科学 班级：21 学号：2013111121 姓名：齐路路 浅谈食物过敏原免疫学检测技术研究进展 摘要：食物过敏已经成为全球性的食品安全问题，而由其引起的疾病严重影响了人们的正常生活，因此开展食物中过敏原的检测研究显得尤为重要。本文综述当前用于食物中过敏原检测的常见方法和新兴检测技术，并探讨食物中过敏原检测方法的发展前景。 关键词：食物过敏；过敏原；检测技术 Abstract: Food allergy has become a global food safety issues arising out diseases seriously affect people's normal life, so to carry out the food allergen detection is particularly important. This article reviews the common methods and new detection techniques for food allergen detection, and to explore the prospects for the development of food allergen detection methods. Keywords: food allergies; allergens; detection technology 引言：食物过敏是一个世界性公共卫生问题。调查显示世界上约4％的人口对食物过敏。目前，已确定的过敏性食物多达180种以上，联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization，FAO)了90％以上食物过敏原存在于牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类水产品、花生、大豆、坚果类及小麦8大类食物中。为保护易感者健康，部分国家和地区对食物过敏原的标签标注进行了严格规定(如表1所示) ，并列入立法范围，因此食物过敏原的检测越来越重要。食物过敏原(Food allergen)检测技术根据检测目标物的不同，以全蛋白或酶解后肽段氨基酸序列的质谱技术、检测编码过敏原DNA片段的聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术及分析过敏原性的免疫学检测技术为代表 。J。而质谱存在操作费时、仪器昂贵、检测费用相对较高等缺点 ；PCR方法检测易因操作不当受到污染而产生假阳性结果，存在操作要求技术性强、费时等缺陷。由于质谱技术和PCR方法在便捷程度、检测速度等方面的局限使其难以满足市场应用的需求，因此，建立快速、高效、精确的食物过敏原检测方法显得尤为重要。以酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫层析技术(Lateral flow immunoassay，LFIA)、生物传感器技术为代表的免疫学检测(Immunoassay)方法因其特异性强、灵敏度高及操作简便而备受青睐 ，目前在众多过敏原检测方法中应用最为广泛。 1 食品过敏 1.1食品过敏的定义 食品过敏是指食物进入人体后机体对之产生异常免疫反应导致机体生理功能的紊乱和/或组织损伤, 进而引发一系列临床症状食物变态反应具有特异性,各种免疫病生理机制均可涉及。一般来说，食品过敏原为分子量介于10000一70000之间的蛋白或糖蛋白占食品总蛋白的极小一部分分别属于不同的蛋白家族。但是微量的食品过敏原蛋白即可引起严重的过敏反应。食品过敏反应的一个共同特点是必须有致敏原的预先接触，使机体处于致敏状态,当再次接触该致敏原时才诱发变态反应。 1.2食品过敏原 食品过敏原(food allergens) 是指能够选择性地激活CD4+Th2细胞及B细胞，诱导产生特异性IgE 抗体应答，引起变态反应的抗原性物质。过敏原种类繁多，且对人群的危害越来越严重。实际上，过敏原就是会造成过敏反应的某些特定的蛋白物质。目前大约有160 多种食品含有可以导致过敏反应的过敏原，常见的食品过敏原有牛乳、鸡蛋、鱼、甲壳类水产动物、花生、大豆、坚果、小麦等八大类食品。 1.2.1食品过敏原种类[3] 1)​ 吸入性过敏原 如花粉、柳絮、粉尘、虫螨、油烟、各种香料、汽车尾气、煤气、香烟等通过呼吸引起过敏的抗原性物质。 2)​ 接触性过敏原 如化妆品、染发剂、油漆、肥皂、化纤用品、塑料、金属饰品（项链、手链、耳环）、寄生虫等通过触摸引起过敏的抗原性物质。 3)​ 食入性过敏原 如海鲜、鱼虾、奶制品、豆制品、鸡鸭、牛羊肉、大米、面粉，以及桃子、梨等通过饮食引起过敏的抗原性物质。 1.2.2食品过敏原的特点[4] 1)​ 任何食物都可引起过敏，但90％的过敏则是少数食物引起的。另外，一般来说除了鸡蛋和牛奶，动物性食物过敏反应较少见，而引起过敏反应的植物性食物种类则较多。 2)​ 致敏食品中仅部分成分具致敏原性。食物过敏原大多数都是具有酸性等电点的蛋白质，一般来说，食品过敏原为分子量介于10 000--70 000 的蛋白或糖蛋白。 3)​ 食物过敏原通常能耐受食品加工、加热和烹调，并能抵抗肠道消化酶，一般认为这些特性会促进这些过敏原分子的过敏性。 4)​ 食品间存在交叉反应，如对牛奶过敏的50%患者也对山羊奶过敏，植物的交叉反应明显高于动物的。 5)​ 对食品的中间代谢产物过敏 2 食物过敏原免疫学检测技术 2.1 酶联免疫吸附法 ELISA技术于20世纪70年代出现，是一种将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合的免疫分析方法，其检测特异性源于抗原与抗体之间的特异性反应。目前其检测灵敏度一般可达到纳克级，若再加以全自动酶标仪的应用，ELISA方法的特异性和灵敏度还可进一步提高。ELISA方法是目前在食物过敏原的常规检测与筛选领域应用最广的免疫分析技术。ELISA的分类方法众多，主要技术类型有双抗体夹心法、间接法、捕获法和竞争法，其中，双抗夹心ELISA法和竞争ELISA法应用最为广泛。 Faeste等通过免疫兔子制备抗鳕鱼过敏原小清蛋白的多克隆抗体，利用该抗体包被酶标板，并用生物素标记该多抗建立了双抗夹心ELISA法，食物中小清蛋白的检出限为0.0l mg／kg，约每kg食物中可检测5 mg鱼肉成分，灵敏度较高。另外，该研究组应用建立的双抗夹心ELISA法对32种鱼类及其它物种含有的小清蛋白进行了检测，结果显示该方法特异性强，与其它物种中小清蛋白不存在交叉反应。此外，该方法稳定性好，应用此方法分析食物基质中的鳕鱼小清蛋白回收率达68％～138％ ，其区内和批问差分别小于12％和19％ ，具有较好的应用价值。Kaw等 应用相同的原理，建立了针对羽扇豆中总过敏原的双抗夹心ELISA，应用该方法检测食物中残留的羽扇豆，其定量检测限为1 mg／kg，但该方法存在与大豆及黑豆发生交叉反应的缺点。 Mariager等_1 应用竞争ELISA法，用兔多克隆抗体检测了普通和抗过敏婴儿奶粉中的主要过敏原之一 一乳球蛋白，其检出限为0.08 L。张在军等¨ 依据斑点一ELISA原理，将3种含过敏原成分的花生、鸡蛋清、虾过敏蛋白以适当浓度点状吸附于硝酸纤维素膜，使其与3种过敏原特异性IgE血清和生物素化羊抗鼠IgG分别反应后，通过肉眼观察硝化纤维膜上斑点的显色确定待检血清中是否含有相应的过敏原成分。该方法操作简便，特异性强，3种过敏原之间无交叉反应。包被过敏原的硝酸纤维膜可在4℃稳定保存4个月，重复性较好。Blais等。利用蛋黄中提取的抗体建立了斑点一ELISA法，可同时检测花生、榛子及巴西坚果中的过敏原，其定性检测限分别为0.O1、0.03、0.03 mg／L，检测时间约为30 min。 近十年来，市场上关于杏仁、大豆、花生、甲壳类、芝麻、芥末、羽扇豆、牛奶等食物过敏原的ELISA检测试剂盒均有销售，这些试剂盒可在30～60 rain内实现定性或半定量检测 。目前，特异性强、快速和高通量式检测的新型ELISA试剂盒已成为食物过敏原快速检测方法的研究热点之一。 2.2 免疫层析技术 免疫层析技术始于1990年Beggs等 的人绒毛促性腺激素免疫胶体金层析系统，是ELISA技术原理的扩展应用，一般使用乳胶颗粒、胶体硒、胶体金以及脂质体等作为着色标记物。层析时，标记物与待测物之问形成的复合物被相应的配体捕获而聚集于硝化纤维膜上的检测线并呈现出标记物所带有的颜色，因此可通过纤维膜上显色条的有无、颜色的深浅和反射光线强弱等实现定性或定量检测 。 1997年，Mills等 首次将免疫层析技术应用于花生过敏原(伴花生球蛋白)的检出，其中杏仁软糖中花生成分的检出限为0.01％(质量分数)，巧克力中的检出限为0.1％(质量分数)。2003年，两种检测食物过敏原的免疫层析试纸条获得工业化生产，从而引发了免疫层析技术用于食物过敏原检测的研发热潮 。如2005年，Wen等以可目测的脂质体为标记物标记花生主要过敏原之一Arah 1的兔多克隆抗体，建立了以竞争ELISA法为原理的免疫层析检测方法，其在Ara h1质量浓度范围0.1～10g／L的缓冲液中检出限为0.45 mg／L，定性检测范围1～10 mg／L，检测时问小于30 rain且不需精密仪器。2006年，吉坤美等 依据双抗夹心ELISA法，把可目测的胶体金标记的花生总蛋白多克隆抗体固定于样品垫上，待测花生过敏原与胶体金一花生总蛋白抗体形成复合物，被包被在硝化纤维膜检测线上的花生总蛋白抗体捕获浓集成红色，可检测花生的主要过敏原组分Ara h 1与Ara h 2，灵敏度达50g／L。另外，该研究组还应用建立的免疫层析法对食物标签标注的含有花生成分、未含花生成分以及标注不详的l9种食品进行了检测。结果发现17种食品的检测结果与食物标签的内容相符合，2种标示不详的食品检测结果均为阳性，说明该方法特异性强，对于是否含有花生过敏原成分的食物检测具有实际应用价值。目前，市场上至少有14种商业免疫层析检测试剂盒，检测物质包括牛奶、花生、榛子、甲壳类水产品等，如麸质谷物中的醇溶朊定性检测限为2.5 mg／kg，检测时问为5 min，贝、甲壳类水产动物的定性检测限为5 mg／kg，检测时问为10 min 。 近二十年来，免疫层析技术在食物过敏原检测中得到了快速发展，但多集中在花生、榛子等坚果类过敏原的研究，商业化免疫层析检测试纸条多为定性或半定量检测。随着纳米材料学的发展，一些带有功能基团的纳米材料如胶体金、胶体银、荧光素、超顺磁性纳米微球可作为标记物与抗体偶联达到定性或定量检测的目的。因此，应用免疫层析检测技术结合新型纳米材料作为标记物，优化层析体系将是食物过敏原检测技术的研究热点之一。 2.3 生物传感器技术 自1 967年科学家研制出第一个生物传感器葡萄糖传感器以来，生物传感器在食品安全方面如致病菌检测、抗生素残留检测、农兽药残留检测、毒素检测方面得到了广泛应用 ，但在食物过敏原检测方面的应用研究较少。生物传感器根据待测物质和分子识别元件特异性结合，发生生物化学反应，产生的生物学信息通过信号转换器转化为可以定量处理的电、光等信息，再经仪表放大和输出，从而达到分析和检测的目的，如靶分子(抗体或单链DNA分子等)固定在传感器芯片表面，可实时定量检测一一种或多种分子问的反应。 过敏原的检测是通过不同的物理化学技术实现的，如表面等离子体共振(Surface plasmon reso.nance，SPR)、共振增强吸收(Resonance—enhanced absorption，REA) 。“等。Lu等 副采用SPR生物传感器定量检测了鲤鱼过敏原小清蛋白，检测时间为5 min，且仅需少量样品(低至3.55 mg／L)，对样品纯化程度要求较低。微型SPR生物检测器已应用于食品生产过程中花生过敏原的检测，该检测器可实现在线定量检测。基于REA生物传感器检测牛奶过敏原 .乳球蛋白的研究显示，REA生物传感器在检测时需使用标记探针，纳米金颗粒标记的抗体可得到更强的REA信号 ]。沈丽燕¨纠以抗原抗体免疫反应和压电型传感技术为基础，选择1，6一己二硫醇一纳米金自组装方式，建立了食物过敏原的压电型免疫传感器快速检测方法。该传感器对河虾过敏原原肌球蛋白的检出限为0.03 mg／L，花生蛋白的检出限为0.2 mg／L，检测时间约6 rain。其交叉试验结果与ELISA一致，且免疫传感器可再生1次之多，具有较好的应用前景。最近，Bremer等 研究出一种快速灵敏的免疫检测生物传感器，可在橄榄油中检出高于0.08 mg／kg的榛子蛋白，检测时间少于4.5 rain，同时可用于鉴别橄榄油中掺杂的榛子油，保护对榛子过敏者的健康。目前，已开发的商业化生物传感器可用于牛奶、鸡蛋、坚果、花生、鱼、芝麻等食物中致敏蛋白成分的检测 。 生物传感器技术兼具免疫检测技术和光电学技术的优点，在食物过敏原检测方面，选用最佳生物传感器、扩大应用范围将是生物传感技术的研究热点之一，另外高灵敏度、集成化、微型化、多功能化及商业化也是生物传感技术的发展趋势和重点研究方向。 2.4 组胺释放实验[11] 组胺释放实验主要是通过食品过敏原激发致敏的靶细胞，引起细胞释放组胺，组胺含量可应用荧光测定法、放射免疫法等方法测定，与适宜参照进行比较，确定组胺释放率阳性，从而进行过敏原活性测定及鉴定的一类方法。通常用抗IgE 抗体作阳性参照，以样品介质(如PBS)为阴性参照，以排除实验过程中组胺的非特异性释放。NORGAARD 等[10]将HRT 用于鸡蛋和牛奶过敏原的检测和诊断时发现该方法具有较好的灵敏度，结果的重现性很好，但是食品的状态(是否新鲜)对其影响较为显著。在鳕鱼过敏原的检测试验中发现与双盲对照试验相比HRT 具有较高的特异性和较低的灵敏度，但新鲜鳕鱼的过敏原提取物可以显著增强HRT 检测的灵敏度。此外，HRT还成功的用于花生、榛子过敏原的检测及致敏作用机理的研究。 2.5 过敏原指纹图谱快速检测方法[7] 中药指纹图谱是在制定中药质量评价的过程中针对中药成分的复杂性以及缺乏用以鉴定成分所需的化学对照品这一症结而产生的一种方法。吴海强等首次提出将指纹图谱应用到食品安全相关的研究中去，特别是应用到食品过敏原的快速检测分析上来，首先提取其过敏原总蛋白，初步研究了食品过敏原总蛋白2-DE 指纹图谱在食品过敏原快速检测中应用的可行性，肯定了该方法在不同检测仪器和试验耗材之间良好的重现性和稳定性[13]，并在此基础上进一步研究了以2-DE指纹图谱为基础进行特异性过敏原蛋白点MALDI-TOFMS 指纹图谱研究的可行性，为指纹图谱技术在食品过敏原快速检测、分析中的应用提供了坚实的理论基础和实验基础。 3 讨论及展望 近年来，随着人们对食物过敏意识的增强，部分国家和地区已建立严格的食品过敏原标签，并立法强制要求对食物过敏原进行标示，推动了食物过敏原检测技术的不断发展， 表2对食物过敏原的几种主要检测技术进行了比较。 表2列出的几种主要检测方法中，质谱技术能精确测定全蛋白或酶解后肽段的氨基酸序列，再根据相应数据库确定致敏蛋白。液相／Z重串联四极杆质谱仪、高精度四极杆一飞行时问串联质谱仪、飞克级气相色谱／三重串联四极杆质谱联用仪、全新的代谢物谱库和软件平台使质谱技术的灵敏度有了新突破，但质谱技术鉴定过敏原多是结合高性能的分离纯化手段如双向电泳、液相色谱、毛细管电泳、场流分级等技术，存在操作费时、仪器昂贵、检测费用相对较高等缺点。PCR主要通过引物的特异性选择从而使具有一定同源性的DNA分子之间的交叉反应降低到最低 ，其灵敏度和特异性均较高，但经系列加工处理后食物样本中的DNA受损较大因而较难提取，且DNA需经转录、翻译等过程才能表达为具有一定生物功能的蛋白质，而此过程又受诸多因素的影响。因此PCR检测的阳性结果只能说明食物中含有致敏因素，但不能反映食物的真正过敏性即人们摄入该食物后会产生过敏反应。传统PCR多是定性分析，随着PCR技术的发展，实时荧光PCR、PCR—ELISA法可实现定量检测，但即使商业PCR试剂盒也需7～8 h，较为费时。质谱技术和PCR方法因在便捷程度、检测速度等方面的局限性而难以满足市场的应用需求，食物过敏原的免疫学检测技术因较好的特异性、操作简便性和低成本等优点受到食品工业界的青睐。其中ELISA技术较为成熟，可实现多样本同时检测，目前应用也最为广泛，较适合于过敏原的常规筛选和检测；基于生物传感器的检测方法克服了以往酶法分析成本高和化学分析步骤繁琐的缺点，其检测结果不受颜色、浊度的影响，操作系统比较简单，容易实现自动分析和现场检测，因而较适合于大规模样本的实时高通量检测。免疫层析技术将免疫反应转移到玻璃纤维和硝化纤维膜上进行，从而省略了标记物的结合与分离过程及加样、洗涤步骤，因而操作简便、检测快速(一般少于30 rain)，通过肉眼观察即可实现定性或半定量检测，较适合于现场的实时检测和监管。目前国内尚无自主研发的食物过敏原免疫层析试剂盒产品，开发免疫层析的定性与定量检测将是今后食物过敏原检测技术的研究热点之一。 随着生物技术的发展，各种多学科交叉的新型检测技术也将日益增多。纳米技术在食品安全快速检测中表现出的快速、简便、高效、灵敏等优点，使其在今后的应用中具有较大的发展潜力。近年来，基于新型纳米材料的免疫层析技术、生物传感器技术的研究也将推动食物过敏原检测方法朝着更加快速、高效、简便和经济的方向发展，并逐步应用于现场快速过敏原检测中，为我国食物过敏原快速检测技术的发展和食物过敏原标签标示制度的实施提供重要的技术支撑。 参考文献： 【1】​ 张迎俊，常见过敏原的种类和检测，国临床医生2008年第36卷第12期(895-897)； 【2】​ 曾江龙，过敏性皮肤病患者过敏原检测分析研究，吉林医学2010年5月第31卷第14期（1966-1967）； 【3】​ 王成玉，过敏原、过敏性疾病及其治疗进展，中国医学创新2009年6月 第6卷第l8期（119-121）； 【4】​ 陈文彬，过敏原检测系统临床应用价值探讨，医学信息 2010年9月 第23卷 第9期（1111-1112）； 【5】​ Rudolf Valenta* and Dietrich Kraft，From allergen structure to new forms of allergen-specific immunotherapy，Current Opinion in Immunology 2002, 14 :718–727. 【6】​ 刘静,陈庆森.食品过敏原研究进展及其在食品安全重要性方面的探讨.食品科技.2006,04:1-3. 【7】​ 吴海强,刘志刚.食品过敏原的检测与分析.热带医学杂志.2006,6(5): 【8】​ 孟伟帅,关荣发.食品过敏原检测技术的研究. 广东化工.2010,4(37):167-168. 【9】​ 李振华．达氟沙星间接竞争ELISA 检测方法的建立[J]．中国畜牧兽医.2007，34(6)：79-81． 【10】​ 孙佳益,王锡昌.食物过敏原的低过敏性处理方法及其评价体系研究进展. 分析测试学报.2012,3(14):495-499.