磁性壳聚糖微球对牛血清白蛋白的吸附性能

[Article] www.whxb.pku.edu.cn 物理化学学报(Wuli Huaxue Xuebao) Acta Phys. 鄄Chim. Sin., 2007, 23(10)：1583-1588October Received: May 21, 2007; Revised: June 28, 2007; Published on Web: August 29, 2007. 鄢Corresponding author. Email: shenhb@shnu.edu.cn; Tel: +8621鄄64321045. 上海联合利华研究与发展基金和上海市科委(05DZ19327和 0552nm0377)资助项目 鬁 Editorial office of Acta Physico鄄Chimica Sinica 磁性壳聚糖微球对牛血清白蛋白的吸附性能 朱晨华 1 沈鹤柏 1,鄢 徐瑞云 2 王皓月 1 韩继美 1 (1上海师范大学生命与环境科学学院,上海 200234; 2上海应用技术学院化学系,上海 200235 ) 摘要： 在微乳液体系中,以戊二醛为交联剂制备了磁性壳聚糖纳米粒子(Fe2O3鄄CS).采用透射电子显微镜(TEM)、红 外光谱(IR)、振动样品磁强计(VSM)等手段对纳米粒子进行征.结果表明,纳米粒子的粒径在 40 nm左右,分散 性良好,具有较好的磁响应性能.以碳二亚胺(EDC)为活化剂,研究了 Fe2O3鄄CS纳米粒子对牛血清白蛋白(BSA) 分子的吸附性能,并使用原子力显微镜(AFM)、紫外分光光度计(UV)进行表征.结果表明, Fe2O3鄄CS粒子对 BSA 的吸附大致符合 Langmuir吸附模型, 298 K时饱和吸附量约为 250 mg·g-1,吸附常数为 0.007 L·mg-1.将 BSA鄄粒 子分散在不同 pH的缓冲溶液中,研究 BSA鄄粒子复合物的稳定性.用聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS鄄PAGE)对结果 进行表征,发现在碱性条件下, BSA分子能从磁性粒子表面脱附下来. 关键词： 壳聚糖; 磁性; 微乳液; 牛血清白蛋白; 吸附 中图分类号： O647 Adsorption of Bovine Serum Albumin onto Magnetic Chitosan Microspheres ZHU Chen鄄Hua1 SHEN He鄄Bai1,鄢 XU Rui鄄Yun2 WANG Hao鄄Yue1 HAN Ji鄄Mei1 (1Life and Environment Science College, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, P. R. China; 2Department of Chemical Engineering, Shanghai Instiute of Technology, Shanghai 200235, P. R. China) Abstract： Magnetic chitosan nanoparticles(Fe2O3鄄CS) were prepared in microemulsion by crosslinking method. The transmission electron microscopy (TEM), Fourier transform infrared spectrophotometry (FT鄄IR) and vibrating specimen magnetometer (VSM) were used to characterize the nanoparticles. The mean diameter of the particles was about 40 nm with good dispersibility and magnetic response. The bovine serum albumin (BSA) was connected onto the surface of the magnetic nanoparticles with carbodiimide hydrochloride (EDC) as the activator. The products were then characterized by atomic force microscope (AFM) and ultraviolet spectrometer (UV). The results showed that the nanoparticles had a good adsorbability of the BSA. The adsorption isotherm of the BSA on the magnetic chitosan microspheres basicly obeyed the Langmuir model, with a maximum adsorption capacity of 250 mg·g -1 and an adsorption equilibrium constant of 0.007 L·mg-1. The stability of the particles鄄BSA complex in phosphate buffer solution (PBS) with different pH was also studied. Sodium dodecyl sulfate鄄polyacrylamide gel electrophoresis (SDS鄄PAGE) showed that BSA was desorbed from magnetic particles under alkaline condition. Key Words： Chitosan; Magnetic; Microemulsion; Bovine serum albumin; Adsorption 蛋白质作为生命的物质基础之一,在催化生命 体内的各种反应、调节代谢、抵御外来物质入侵及控 制遗传信息等方面都起着至关重要的作用,是生命 科学中极为重要的研究对象.对蛋白质的回收率、纯 度、活性及稳定性等方面的随着研究的深入也 越来越高,而传统的蛋白质分离方法如盐析、有机溶 1583 Acta Phys. 鄄Chim. Sin., 2007 Vol.23 剂沉淀法、离子交换等技术,过程繁杂,目标蛋白质 的损失很大,甚至可能会导致蛋白质变性、降解、失 活.磁性分离技术在生物学方面的应用已经取得一 些令人瞩目的研究成果[1,2],主要用于作为药物的载体 进行靶向给药、临床磁共振成像、细胞及 DNA的分 离等.蛋白质的磁分离是指,首先对磁性微球表面进 行改性,连接—COOH、—COH、—NH2等配基,再与 目标蛋白质形成磁性微球鄄蛋白质复合物,然后在外 加磁场作用下将复合物从体系中分离出来,最后进 行蛋白质脱附,实现蛋白质的富集与纯化.与传统分 离方法比较,蛋白质的磁分离具有快速、高纯度、高 收率等优点. 壳聚糖(CS)是甲壳素的脱乙酰基产物,其分子 中含有的活性氨基和羟基可以很方便地对其进行功 能化修饰.并且壳聚糖还具有良好的生物降解性及 生物相容性,对生物组织也没有毒性[3].因此在生命 科学领域有广泛的应用前景.目前已有很多关于壳 聚糖载药、重金属离子吸附分离等方面的研究和应 用的报道[4-6],但是关于壳聚糖纳米粒子用于蛋白质 分离的报道还很少见. 水溶性碳亚二胺(EDC)被广泛地应用于蛋白质 以及其他活性生物分子的修饰[7].在本实验中,它通 过活化 BSA分子表面羧基,形成 O—酰基异脲,与 壳聚糖分子中氨基缩水形成酰胺键,将 BSA与壳聚 糖结合起来[8,9] . 本文在微乳液体系中以戊二醛为交联剂,制备 了磁性壳聚糖纳米粒子 Fe2O3鄄CS,在外加磁场的作 用下对磁性壳聚糖粒子进行分离和纯化,并对其形 貌和结构进行表征. 以牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白, 在磷酸盐 缓冲溶液(PBS)中加入 EDC作为催化剂,将 BSA分 子连接到磁性粒子表面. 考察了 Fe2O3鄄CS 对 BSA 的吸附性能及其在不同 pH值条件下的稳定性. 1 实验部分 1.1 试剂和仪器 壳聚糖(分子量 1.5伊105,脱乙酰度跃90%),戊二 醛(25%水溶液), 牛血清白蛋白(BSA), 1鄄(3鄄二甲氨 基丙基) 鄄3鄄乙基碳二亚胺(EDC)均为生化试剂;冰醋 酸,液体石蜡, Span鄄80, Tween鄄80均为化学纯; Fe2O3 纳米磁粉(平均粒径(10依5) nm,比饱和磁化强度 45- 60 Am2·kg-1,自制) 透射电子显微镜 (Hitachi H600,分辨率 0.3 nm, 放大倍数 50万倍, 加速电压 100 kV), 原子力显微 镜(Veeco Nano Scope鼗a SPM系统),红外光谱(Mc鄄 olet Avatar 370 DTGS) KBr压片 400-4000 cm-1, 振 动样品磁强计(Lake Shore), 紫外分光光度计(UV鄄 2450 Shimadzu, 狭缝宽度 2.0 nm, 200-800 nm), 凝 胶电泳仪(Bio鄄RAD PowerPac Basic电压 100 V). 1.2 磁性壳聚糖(Fe2O3鄄CS)纳米粒子的制备 称取 0.01 g壳聚糖加入 10 mL烧杯中,分散在 1 mL 1%醋酸溶液中,超声 15 min,溶解完全.称取 5 mg Fe2O3纳米磁粉,将其分散在壳聚糖鄄醋酸溶液 中, 超声 15 min. 按质量比为 10颐4.5颐3.5 称取石蜡、 Span鄄80 及 Tween鄄80, 搅拌均匀 , 超声 15 min. 将 Fe2O3鄄壳聚糖鄄醋酸溶液加入石蜡混合液,搅拌均匀, 超声 45 min,即可得到均一透明的棕色均相微乳液. 将微乳液置于恒温水浴中,在 1000 r·min-1下机械 搅拌,向体系中加入 100-1000 滋L 25豫的戊二醛,反 应 12 h,陈化 12 h.产物先后用石油醚、异丙醇各洗 涤 3次,使用外加磁场进行分离,除去粒子表面活性 剂及有机物.真空干燥 24 h. 将洗涤后的粒子用透射电子显微镜观察粒子形 貌.取少量干燥后的粒子,用红外光谱对其结构进行 表征.用振动样品磁强计(VSM)对纳米粒子的磁性 进行研究. 1.3 磁性壳聚糖纳米粒子对 BSA的吸附 称取1 mg磁性壳聚糖粒子,分散于1 mL磷酸盐 缓冲溶液(pH 4.8)中, 超声分散均匀, 加入100 滋L 1 g·L-1 EDC溶液,加入一定量1 g·L-1BSA溶液.置于恒 温摇床上,以每分钟200次的频率振荡反应24 h.反应 结束后, 用外加磁场进行分离, 并用pH=4.8的 PBS 溶液洗涤数次,直至上清液中不能检测出BSA(洗涤 上清液称为反应残液；最后一次的洗涤上清液称为 反应洗涤液；吸附上BSA分子的磁性壳聚糖粒子称 为粒子复合物,用BSA鄄粒子表示),粒子复合物形貌 用AFM进行观察,用紫外分光光度计检测残液和洗 涤液在278 nm处的吸收值,确定其中BSA的含量. 将连接有 BSA分子的磁性壳聚糖纳米粒子平 均分成 4 份 , 依次分散到 pH 值为 4.8、6.0、7.2、9.4 的 PBS溶液中,振荡分散后,置于摇床上,以每分钟 200次的频率振荡反应 24 h.反应结束后,使用外加 磁场进行分离,上清液称为 BSA脱附液.将脱附液 进行 SDS鄄PAGE电泳,并用银染法显色[10]. 2 结果与讨论 1584 No.10 朱晨华等：磁性壳聚糖微球对牛血清白蛋白的吸附性能 2.1 磁性壳聚糖纳米粒子的表征 2.1.1 Fe2O3鄄CS纳米粒子的透射电镜图 图 1(a、b)分别为交联度较高和较低时磁性壳聚 糖纳米粒子的形貌照片.从 a图中可以看出粒子粒 径大约为 100 nm,粒子之间有一定的粘连情况.从 b图中可看出粒子的粒径大约为 40 nm,分散性也比 较好.表明当壳聚糖交联程度比较高时,粒子粒径比 较大,交联程度比较低时,粒径比较小.从图 1(b)中 还可以看到,几乎每个 Fe2O3鄄CS粒子上都带有粒径 约为 10 nm的纳米核,这可能是 Fe2O3颗粒[11]. 这是由于交联剂戊二醛分子的两端分别有活性 醛基,可以与壳聚糖分子中的氨基缩合,生成席夫碱 (—C襒N), 使壳聚糖分子交联固化, 形成 CS 粒子. 交联度对粒子有很大影响[12],交联度过大,很多壳聚 糖分子连接在一起,得到的粒子粒径相对比较大,交 联度低时,虽然得到的粒子会比较松散,但由于粒子 包含的壳聚糖分子比较少,粒径较小. 2.1.2 CS、Fe2O3以及 Fe2O3鄄CS粒子的红外谱图 图 2是壳聚糖(a)、氧化铁鄄壳聚糖(b)、氧化铁(c) 的红外光谱.图 2(a)中 2882 cm-1的吸收峰是壳聚糖 残糖基上的甲基或次甲基的 C—H 伸缩振动峰 ; 1589 cm-1为壳聚糖分子中—NH2的吸收谱带; 1325 cm-1为壳聚糖酰胺键的特征谱带[13]; 1097 cm-1是一 级醇羟基的 C—O伸缩振动.图 2(b)中,对应波数附 新出现了 2920、2845 cm-1的吸收峰,这是戊二醛中 的—CH2伸缩振动峰;同时出现了 1665 cm-1的吸收 峰,这是制备纳米粒子时生成悬挂醛基的结果[14];在 1561 cm-1处出现了反应产物席夫碱—C襒N 的伸 缩振动吸收峰. 这说明壳聚糖粒子是由戊二醛的 —CHO和壳聚糖的—NH2和—NH +3基团反应得到 的[15].图 2(c)中 572、632 cm-1是 酌鄄Fe2O3的特征吸收 峰,在图 2(b)中也出现了这两个特征峰. 2.1.3 磁性壳聚糖纳米粒子的磁滞回线图 图 3为磁性壳聚糖纳米粒子的磁滞回线.可以 看到,当外加磁场撤去后,出现一定的剩磁现象,比 饱和磁化强度为 8.5 Am2·kg-1.超顺磁性是磁性纳米 颗粒的重要性质之一, 当粒子粒径小于 30 nm 时, 磁性纳米颗粒就会显示出超顺磁性[16].由于制备的粒 子粒径稍大于 30 nm,因此出现了一定的剩磁现象. 粒子的比饱和磁化强度为 8.5 Am2·kg-1,具有良好的 磁响应性能. 2.2 Fe2O3鄄CS粒子对牛血清白蛋白的吸附 2.2.1 粒子复合物的 AFM图 图 4(a、b)分别是磁性壳聚糖粒子 Fe2O3鄄CS 的 相位图及对应的磁扫描图, 图 4(c、d )分别是 BSA鄄 粒子复合物的相位图及对应的磁扫描图.从(a)图中 看到 Fe2O3鄄CS粒子粒径在 40 nm左右, (b)图中黑色 部分表示该区域有磁响应,结合粒子的 TEM图,可 以推断这些区域为具有磁性的Fe2O3粒子.从(c )、(d) 图 1 磁性壳聚糖纳米粒子的透射电镜图 Fig.1 TEM micrographs of the Fe2O3鄄chitosan nanoparticles (a) chitosan (Fe2O3鄄CS) with higher cross鄄linking; (b) Fe2O3鄄CS with lower cross鄄linking 图 2 壳聚糖(a)、氧化铁鄄壳聚糖(b)、氧化铁(c)的红外光谱 Fig.2 IR spectra of CS (a), Fe2O3鄄CS (b) and Fe2O3 (c) 图 3 磁性壳聚糖纳米粒子的磁滞回线 Fig.3 Magnetization curve for the Fe2O3鄄CS nanoparticles 1585 Acta Phys. 鄄Chim. Sin., 2007 Vol.23 图中可以看到,图中有两种粒子,一种粒子粒径大约 为 40 nm,有很好的磁响应性能；另一种粒子尺寸 比较大,大约为 200 nm,粒子本身没有磁性,但粒子 外部吸附着带磁性的颗粒.其中较小的粒子为磁性 壳聚糖纳米粒子,较大的粒子为表面吸附了磁性壳 聚糖纳米粒子的 BSA分子. 据文献[17]报道, 牛血 清白蛋白为 4 nm伊14 nm的椭圆形分子;由于 BSA 分子在吸附到粒子表面后表面电荷发生了变化,发 生了一定的团聚现象, 因此图4(c、d)中BSA分子比 文献报道的大一些. 图4(c、d)中存在没有磁响应的 BSA 分子, 可能是由于形成了比较大的 BSA 聚合 体[18], 而吸附上的磁性壳聚糖粒子在磁针扫描的背 面,无法显示出磁性. AFM结果表明 BSA分子已经连接到了磁性壳 聚糖粒子上,并且通过外加磁场从体系中分离出来. 2.2.2 BSA分子的吸附等温线 Fe2O3鄄CS粒子在 298 K、pH= 4.8时的 PBS溶液 中的吸附等温线如图 5所示.将实验数据进行非线 性回归分析,该曲线的回归系数 R2=0.99,非常接近 1,说明 BSA在粒子表面的吸附基本符合 Langmuir 模型. Langmuir吸附公式为 Ce/q=Ce/qm+1/(K·qm) (1) 式中, q为平衡时吸附在固体粒子表面的 BSA的质 量, qm为粒子对 BSA 的饱和吸附量 , Ce 为溶液中 BSA 平衡浓度, K 为 BSA 在 298 K 下的 Langmuir 吸附常数. 以 Ce/q对 Ce作图, 得到了 BSA分子在 Fe2O3鄄 CS粒子表面的 Langmuir吸附等温线,见图 6所示. 可以看出 , Ce /q 与 Ce 呈线性关系 , 相关系数 R= 0.9984, 直线斜率为 0.004, 截距为 0.57164, 拟合方 程为 Ce/q=0.004Ce垣0.57164 (2) 从(1)式中可知斜率为 qm-1 ,截距为(K·qm)-1 ,计 算可知 Fe2O3鄄CS粒子的饱和吸附量 qm为 250 mg· g-1, K为 0.007 L·mg-1. 2.3 BSA鄄粒子对牛血清白蛋白的脱附 一般蛋白质的非极性氨基酸残基分布在分子内 部形成疏水内核,极性氨基酸残基分布在表面的亲 水环境中.但大部分蛋白质中仍有一些疏水基团暴 露在分子表面,使蛋白质呈现一定的疏水性.蛋白质 表面的疏水性对分子的生物功能及物理化学性质等 图 4 磁性壳聚糖粒子及磁性壳聚糖鄄BSA复合物的 原子力显微镜图 Fig.4 AFM of the Fe2O3鄄CS nanoparticle and nanoparticles鄄BSA complex (a) phase diagram of the nanoparticle, (b) magnetic diagram of the nanoparticle, (c) phase diagram of the complex, (d) magnetic diagram of the complex 图 5 磁性壳聚糖粒子对 BSA的吸附等温线 Fig.5 The adsorption isotherm of BSA on the Fe2O3鄄 CS nanoparticles pH= 4.8, T= 298 K; q is adsorbed BSA, Ce is equilibrium BSA concentration in aqueous phase 图 6 磁性壳聚糖粒子对 BSA的 Langmuir吸附等温线 Fig.6 Langmuir adsorption isotherm of BSA on the Fe2O3鄄CS nanoparticles pH= 4.8, T= 298 K 1586 No.10 朱晨华等：磁性壳聚糖微球对牛血清白蛋白的吸附性能 方面起着重要的作用.现已确定[19]在距 BSA分子表 面附近有一较大的疏水区域,是分子中疏水残基聚 集在一起形成的活性部位. BSA溶液在 278 nm处 的特征吸收峰主要是由肽链上疏水基团色氨酸残基 (Trp)的吲哚环和酪氨酸残基(Tyr)的苯环 仔邛仔﹡跃 迁引起的.不同 pH环境下,蛋白质分子的结构会发 生变化,结构的变化对疏水性氨基酸残基在蛋白质 分子内外的分配产生影响,从而改变了蛋白质分子 的表面疏水性,使蛋白质分子表面功能发生变化.在 酸性较强的体系中(pH约4), BSA分子局部表面疏水 性有所降低,在碱性较强的环境下(pH跃10), BSA分 子表面疏水性有所提高,而在 pH=4-10之间, BSA 分子比较稳定[20]. 图 7为 BSA鄄粒子反应液及洗脱液的电泳图,图 中 1泳道为 BSA标样, 2泳道为反应残液, 3泳道为 反应洗涤液.比较 3个泳道,可以看到 2泳道中还有 残留的 BSA分子,说明此时粒子对 BSA的吸附已 经达到饱和状态；3泳道中没有检测到 BSA, 说明 BSA鄄粒子表面吸附不牢固的 BSA分子已经被洗涤 液洗涤清除. 4-7泳道分别为 pH= 4.8、6.0、7.2、9.4 PBS缓冲 液中的 BSA脱附液.可以看到,在 4泳道中没有检 测到 BSA 分子, 说明在 pH=4.8 的 PBS 缓冲液中, BSA分子没有从粒子表面脱附下来,两者之间的结 合十分稳定; 在 5、6、7 三个泳道中, 条带颜色逐渐 加深,说明 BSA分子从 BSA鄄粒子表面脱附下来,并 且随着 pH值的增加,脱附到溶液中的 BSA分子也 逐渐增加. 因此, BSA 分子在 pH=4.8 的 PBS 溶液 中,能够较好地吸附到磁性壳聚糖纳米粒子的表面, 并且结合比较稳定. 在不同 pH值的 PBS溶液中, BSA分子会有几 种不同的构型.由于 BSA分子等电点(PI)在 pH=4.8 左右,因此在该溶液中蛋白质分子处于最单一的构 型, 有利于粒子对蛋白质分子进行吸附 [21]. 另外由 于在pH越4.8时 BSA分子表面净电荷接近 0,壳聚糖 (PI约为 6. 3) 带正电荷,两者间有一定的静电吸附 作用,这对 BSA在粒子上的吸附也是有利的. BSA分子通过形成缩氨酸键吸附到粒子上,缩 氨酸键在弱酸性条件下比较稳定,在中性及碱性条 件下不稳定,所以将 BSA鄄粒子分散在 pH值越高的 PBS溶液中进行脱附(见泳道 4-7), BSA脱附现象 越明显[22,23]. 由电泳图可以清晰地证实在磁性粒子表面 BSA的吸附和脱附情况,在 pH=4.8的 PBS溶液中, BSA分子能稳定地吸附在磁性粒子表面,在碱性条 件下则会发生明显脱附. 3 结 论 利用反相微乳液体系,以戊二醛为交联剂,制备 了 Fe2O3鄄CS纳米粒子,并用 TEM、IR以及 VSM对 粒子的大小、结构及磁性进行表征.得到了粒径在 40 nm左右,分散性良好,并且具有很好磁响应性能 的磁性壳聚糖粒子. 在 pH=4.8的 PBS溶液中,以 EDC作为活化剂, 将 BSA分子吸附到磁性壳聚糖粒子上.粒子复合物 用 AFM进行形貌表征,可以看到形成了 BSA鄄磁性 壳聚糖复合体.用紫外分光光度计测定粒子对 BSA 的吸附量,吸附基本符合 Langmuir模型,饱和吸附 量为 250 mg·g-1. 检测 BSA鄄粒子在不同 pH的 PBS溶液中的稳 定性 , 并用 SDS鄄PAGE 电脉对结果进行表征 . 在 pH=4.8 PBS溶液中,复合物比较稳定,而在中性及 弱碱性条件下, BSA分子会发生脱附. References 1 Jurgons, R.; Seliger, C.; Hilpert, A.; Trahms, L.; Odenbach, S.; Alexiou, C. J. Phys. Condens. Matter., 2006, 18: 2893 2 Gu, H. W.; Xu, K. M.; Xu, C. J.; Xu, B. Chem. Commun., 2006: 941 3 Aspden, T. J.; Mason, J. D.; Jones, N. S. J. Pharm. Sci., 1997, 86: 509 4 Huang, X. L.; Zhang, L. M. J. Funct. 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