第1章 蛋白质合成

nullnull第二专题 蛋白质结构及生物合成null第一章 蛋白质的生物合成 蛋白质分子的氨基酸顺序由其编码的基因决定, 基因的遗传信息在转录过程中从DNA传到mRNA。 存在于mRNA分子中且由碱基序列决定的遗传信息被表达为蛋白质中氨基酸顺序的过程，称为蛋白质的生物合成（即翻译过程）。 蛋白质的生物合成在核糖体上进行，其过程比DNA复制和RNA转录都要复杂。在其合成过程中需要200余种生物大分子参加，其中包括核糖体、mRNA、tRNA及多种可溶性蛋白因子。 目前，关于蛋白质合成方面的进展很快。null 据2006年6月《分子细胞》报道，来自以色列科学家研究了DNA代码如何转化为蛋白质合成指令。他们揭示了细胞“编辑器”结构，该细胞“编辑器”将从DNA模板中形成的第一个RNA进行直接“剪切和粘贴”。许多疾病都试图破坏这一过程，因此理解这一相关机械工作原理可能会帮助我们在未来纠正或者防止疾病对这一过程的破坏。 约25年前科学家们在基因中发现DNA片，这些DNA片像“填充”片一样点缀在蛋白质形成代码之中，科学家们仍不清楚这些DNA片段的功能。因此科学家对此展开研究，以解开该过程之迷，为此科学家将正确序列提取出来，排列在一起，然后对一套连贯指令进行研究。这种过程称为“核糖核酸剪接”，它发生于细胞核中的“剪接体”。null 在一个大而复杂的蛋白质和短股RNA中，剪接体将代码片的开始部分和结束部分区分出来，然后对它们进行精确的剪切，并把它们缝合在一起。同样，选择性基因剪切也发生在剪切体中。选择性基因剪切是人体中各种各样蛋白质的基础，选择性基因剪切将基因代码片段以不同方式串连在一起。 以色列遗传学教授鲁思.斯皮尔林和有机化学教授约瑟夫.斯皮尔林等人制作了世上最详细的剪切体结构三维演示图。他们弃用了以前在试管中对剪切体剪切工作机理进行研究的方法，改为直接从活细胞中提取剪切体，然后把剪切体放到电子显微镜下进行检查的办法。  他们所从事的工作相当困难。因为活细胞中的剪切体是由4个相同模块组成的，这4个相同模块像水珠一样在RNA线上串连在一起。任何一个微型剪切体都具备自我剪切的能力。这4个相同模块之间的连接相当灵活，模块与模块之间可以相互调换位置。因此，直到现在，在整个混合体中固定下一个确切的形状和结构是一件几乎不可能的事情。null 该小组找到了一条在模块间剪切RNA连接、而不破坏短股RNA完整性的途径。保持短股RNA完整是研究剪切过程的基础。因此他们能够对模块进行分别研究。在非常低的温度下瞬间冷冻剪切体模块，使科学们尽可能观察到剪切体模块贴近自然的状态。通过对数千张不同角度拍摄下的图像的细微观察，科学家绘制出了剪切体复合三维结构图。 该结构图显示，在一个通道周围有两个清晰而不均等的半切体。大的半面包含有蛋白质和RNA短片，而小的半面只有蛋白质。在通道的一边有一个洞穴，研究人员认为它的作用是为等待通道进行自我加工的脆性RNA保留空间。 该小组没有观察到的现象可能与观察到的同样重要。通过试管方法检测RNA剪切时发现了一个复杂序列的证据，在这个复杂序列中剪切体进行自我组装，以便重新开始各自的剪切工作。但是该小组成员从活细胞中提取剪切体进行研究却发现，RNA剪切是发生在预先形成的剪切体中的。这一点符合所知道的细胞最优化工作方式。null 2006年9月《science》文章指出:美英研究人员共同发现了一种新的天然蛋白，不仅可以防癌，而且还能决定人们寿命的长短。这一发现为研究年龄增长与癌症的关系提供了新思路。 研究显示，在正常的细胞分裂过程中有一个必要的检查点,以保证新合成细胞能够维持遗传物质的稳定性。与检查点有关的蛋白在癌症发生中扮演着重要角色，假如它产生缺陷，就会导致人体癌症或肿瘤。英格兰的戈登·利思戈说：“发现与检查点有关的蛋白保证细胞在受损后不进行分裂，从而可防止癌症发生；而在线虫中，这种蛋白还能决定它们的寿命;这些蛋白以前被认为只在分裂细胞中起作用，但新的研究发现，它在不分裂细胞中也同样发挥功能。”  　 通过进一步研究，科学家最终能使正在分裂的细胞中与检查点有关的蛋白保持活跃状态，分裂已结束的细胞（如脑细胞）中与检查点有关的蛋白则停止运转，这样可增加脑细胞或“神经元”的存活量，为神经退化性疾病例如老年痴呆症的治疗提供新的解决。null 2006年3月《PCNA》报道，来自芝加哥和另外两个科研机构的研究人员已经破解了导致SARS(非典)的冠状病毒中一种重要的新药物靶标结构---重要蛋白酶。通过破解这种叫做类木瓜蛋白酶的三维结构，研究人员获得了一种能用于治疗SARS感染者（或者与SARS类似的疾病，如感冒、支气管炎或肺炎）的新药的分子路线图。     类木瓜蛋白酶酶对所有与上呼吸道感染有关的冠状病毒的复制和感染至关重要，而除去这种酶将能够终止感染。在这项新的研究中，研究人员使用强烈的X射线照射这种酶的晶体形式，从而获得这种酶的详细分子结构信息。这种蛋白酶的结构信息将有助于研究人员开发出能够准确靶向该酶的智能药物，而且目前研究人员已经发现了与这种酶结构的特殊“口袋”相契合的化合物，并成功抑制了这种酶的活动。 null 2006年9月《Nature》指出，日本科学家发现一种蛋白质可识别流感病毒等ＲＮＡ病毒并诱发抗病毒反应。       日本科学家审良静男带领的研究小组进行的动物实验显示，一种名为“ＭＤＡ５”的蛋白质与机体的自然免疫能力有关。科学家利用基因技术培育出体内“ＭＤＡ５”不发挥作用的实验鼠，然后让实验鼠感染各种病毒，并与正常鼠进行比较。实验结果发现，体内“ＭＤＡ５”蛋白质不发挥作用的实验鼠更容易感染流感病毒等ＲＮＡ病毒。       这一结果表明“ＭＤＡ５”蛋白质可识别流感病毒等ＲＮＡ病毒并触发抗病毒反应。科学家认为，由于遗传上的差异，有些人体内可能缺少“ＭＤＡ５”，相对更容易患上流感。因此，通过检测不同人的遗传差异，也许有助于更有针对性地预防流感。 null 据2006年9月《细胞》杂志发表的文章报道，意大利科学家发现了一种与高血压相关的蛋白质分子Emilin1。这一发现将会给影响三分之一人口的高血压病的研究提供一个突破口。  　　通过以往的研究，科学家们了解到超过50％的血压水平异常都是由遗传原因所造成。意大利的Stefano.Piccolo等人证实，当从实验老鼠体内去除这种Emilin1细胞蛋白时，其体内血细胞表现出生长异常，变得更狭小并使得其血压增高。  　　据称，他们相信Emilin1分子是通过调节TGF-beta这种生长因子起作用。而后者涉及到癌症的发生，以及动脉粥样硬化以及纤维化症等过程。   　　据了解，高血压病是指病因尚未明确，以体循环动脉血压高于正常范围为主要临床表现的一种独立疾病。据卫生部资料显示，全球成人高血压患者达6亿，到2006年可能增加到6.5亿。这些人中至少有1/3未作过诊断，有超过1/2的人未加以治疗。我国现有高血压患者已超过1亿，每年新增300万人以上。 null 2005年12月日本一个科研小组新发现一种增强胰岛素功能的蛋白质。它可控制血糖值，增强胰岛素功能。专家认为，这一发现有助于开发治疗糖尿病和高血脂的药物。 这种可控制血糖值的蛋白质被称为“ＴＦＥ３”，属于一种调节基因功能的转录因子。研究人员给患糖尿病的老鼠植入合成“ＴＦＥ３”的基因，并让其在肝脏中发挥作用，结果发现老鼠的血糖值下降，接近正常值。     糖尿病存在两种类型，一种是因为缺少胰岛素，一种是胰岛素不太起作用。实验结果证明，“ＴＦＥ３”对这两种糖尿病都有效果，而且可以改善高血脂的症状。     糖尿病、高血脂都与多种基因有关。研究人员认为，“ＴＦＥ３”蛋白质对控制与糖尿病有关的多种基因和起“指挥”作用的基因均可发挥作用，并能激活“指挥”基因，从而使胰岛素功能增强 。null 2006年9月《Science 》杂志报道，的研究人员宣布，蛋白序列可以和DNA序列不对应。 一种蛋白可以被重新排列，而且与编码它的DNA不呈线性的对应关系。基因由编码蛋白的DNA序列（外显子）和不编码蛋白的DNA序列（内含子）相间排列组成。蛋白编码的第一步是将DNA转录为RNA，然后RNA通过剪接过程将内含子去掉，外显子直线连接起来，形成翻译蛋白的范本。 直到现在，人们一直认为DNA和蛋白的线性对应关系只会受到RNA剪接的干扰。免疫学中蛋白也会发生拼接事件，不同的蛋白片段，多肽段也可能以不同于来源蛋白的排列顺序而排列在一起。 Van den Eynde博士在文章中提出的新奇现象，发生在抗原加工和呈递过程中产生的抗原多肽，抗原多肽可以指引免疫系统破坏目标细胞。null 科学家一般认为当T淋巴细胞辨认出异常细胞表面呈递的抗原多肽时，例如肿瘤细胞、病毒感染细胞或者同种异体的细胞，免疫系统就会攻击这些异常细胞。抗原呈递细胞可捕获抗原，细胞中的蛋白酶体将外源蛋白切割为多肽段，然后呈递到细胞表面，CD8+T细胞识别呈递的抗原多肽，摧毁异常细胞。 Belgium/USA研究小组发现蛋白酶体也可依照编码蛋白的DNA序列范本相反的顺序，将多肽段拼接在一起。这样的机制使来自一个蛋白的数量有限的抗原，能形成成千上万种序列形式。研究人员鉴定出的第一个人类癌症特异抗原序列，有利于临床抗特异性癌症疫苗的研究。 这项研究结果的机制扩大了可形成单一蛋白抗原多肽的数量，也拓展了对抗癌症和传染病的多肽疫苗之应用范围。 null    据2006年9月美国化学学会 (ACS)年会的研究报告指出，斯坦福大学的科学家James.Swartz提出“无细胞”蛋白质合成法，即利用细胞制造蛋白质的零件，将它们放入系统中，制造大量经过设计的蛋白质，用于医疗用途中。 如何利用这种“无细胞”蛋白质合成法，包括制造具有各种用途、纳米级的病毒球形外鞘来制造更安全的疫苗。研究人员一直希望可以高效率且低成本地制造医疗用途的蛋白质。但是利用完整的细胞制造蛋白质是有些困难的，因为细胞无法承受太大的化学变化。   null 如果利用这套无细胞技术，可以成为制造蛋白质的工厂，在这项研究中，研究人员制造的病毒外鞘，是根据一种会感染大肠杆菌的病毒之外壳。当相同蛋白质的180个拷贝聚集成纳米级的足球就形成了这种病毒的外壳。     这些小球的直径只有27纳米，将形成为新类型制药及新材料的依据。这项研究不但第一次利用无细胞的系统制造出外鞘，而且还进一步将独特的反应性氨基酸黏附在外鞘的表面。     这些氨基酸可以让病毒外鞘黏附或携带特殊的蛋白质，或是黏附于其它外鞘，使它们可以组合在一起。这种微小的球体可以运输疫苗或药物，在血液中移动，或是连接成不同的结构，制造出新的材料。null　　2006年9月《细胞》杂志报道了蛋白质合成机理研究的新进展 。美国的科学家哈利.洛勒尔专门从事核糖体研究，研究主要目标就是解开核糖体是如何工作和发展的。许多最为有效的抗生素对象就是细菌核糖体。这一研究成果推动了新型抗生素的开发，这些抗生素可以杀死那些对目前使用药物产生抗体的细菌。比如抗药性葡萄球菌感染就医院所面临的一个极为严重的问题。 　　洛勒尔等人在2001年制作出了首个完整核糖体分子结构的高清晰图。现在，研究小组已经制作出了更为高清晰的分子结构图，这使他们具备制作核糖体原子模型的能力。 　　新分子结构图展示了以前从未见过的详细细节，并为展现出蛋白质合成过程中参与合成的确切核糖体部分。null 洛勒尔说，“现在制作的分子结构图将全面了解核糖体的整个活动过程”。核糖体是由蛋白质和核糖核酸分子组成的复杂分子机器。他们研究的细菌（嗜热栖热菌）核糖体由三个不同核糖核酸分子和50个不同蛋白质组成。 　　洛勒尔在1970年就提出核糖体中核糖核酸成分担负着核糖体的关键功能。在当时，洛勒尔这种想法被认为是“疯子观点”，但是洛勒尔和其它科学家的后续研究却证明他的观点是正确的。 　　 “当首次提出此项观点时，很多人认为观点极其异端。但是现在大家已经接受这种观点。最近的研究确认核糖体中的核糖核酸在核糖体的功能发挥方面起着关键性作用。蛋白质也起着很重要的作用，但是比起核糖核酸来却要逊色一些”。 　　为了制造一个新蛋白质，基因中的脱氧核糖核酸序列会首先将一个遗传指令复制成一个核糖核酸分子   信息。此时核糖体从核糖核酸信息中读取遗传代码，而后将该代码植入蛋白质结构当中。null 蛋白质是一种通过折叠成复杂三维形状来执行其功能的线性分子。他们由氨基酸建筑块组成。氨基酸的排列顺序决定蛋白质的结构。氨基酸经核糖核酸分子转输进入核糖体中。在核糖体中，核糖核酸传输时通过核糖核酸信息认证特定序列的遗传代码，而后氨基酸以正确的序列加入其中。 　　洛勒尔研究小组制作的分子结构图不仅展示了核糖体的完整结构，而且还展示了核糖核酸信息及两个核糖核酸传输的整个范围。此项研究成果使我们对分子活动机理有了一个粗细的了解。洛勒尔将他制作的分子结构图与其它科研小组的分子结构图进行了比较，他发现核糖体或者核糖体的下层结构位置不同。目前他正在探索分子活动中核糖体活动的线索。他说，“我们下一步目标就是跟踪核糖体的其它功能，以制作出更为详细的核糖体分子结构图”。    研究人员使用了一种名为X射线结晶学的技术，该技术能制造出净化核糖体晶体，而后使用聚集X射线光束透视这些晶体，并对产生的不同衍射模式进行分析。null   2006年10月《Science》文章挑战蛋白经典理论。来自美国的科学家Boehr等人揭示酶在结构上的变动有助于增加酶与受催化物质结合的机率，并提出酶结构上的变动可进一歩牵涉到整个反应作用的循环机制，让酶在进行催化作用上更有效率。      长久以来科学家们都了解蛋白质并非是不可变动的固体，而是在任何瞬间都会产生结构上细微变化的弹性物质。即使是不会发生整体结构上大幅改变的蛋白质，也通常会在兆分之一秒的时间内使原子产生一千万分之一公分(nm)的移动。      对于酶在结构上的变化，先前经典研究认为酶结构上的变异可使尚未结合到底物的酶事先形成与底物相结合的结构，因此可以帮助酶与特定配体互相辨认而结合。而此次Boehr与他的同事利用对酶研究的发现，让我们可以想象蛋白质在还没跟其它蛋白质结合之前，结构上的变异性不是完全随机、毫无方向可言的，反而是朝着使蛋白质更容易跟受质结合的状态前进。 null   此外，Boehr等人也提到酶与底物结合的同时，结构上的变异也可以帮助酶形成有利于往催化反应下一歩进行的状态。因此透过结构上的变异，酶催化作用的能量变化图或许不像以往认为的单一漏斗的型态，而比较像是由许多个漏斗结合在一起拥有好几个低能量状态的样式。而这些连接在一起的漏斗会因为酶与底物或配体互相接合的同时而产生大小与深浅的变化。       这一研究也提出酶在较高能量的中间物状态也具有和较低能量状态下类似的结构。对这说法进一歩的验证将有助于我们对蛋白质相互作用的机制有更多的认识，也对于我们往后在进行药物设计上有极大的助益。 null 2006年10月英国科学家发现了运输蛋白的机理，揭示运输蛋白在完成“货物”的搬运后怎样停止下来。这一发现非常重要，因为这种叫做肌浆球蛋白5的蛋白质是在人体内广泛存在的一种运输蛋白，而且这些蛋白在人类的很多重要生理过程中都起着作用，包括听觉，肌肉收缩，消化以及神经传输—从大脑将信息传递到身体各个部分。  研究人员表示：“当肌浆球蛋白5被破坏时，会发生很多致命症状。一旦我们增加了对这一过程的了解，就可以解决由于这些蛋白破坏带来的问题。当然我们还有很多问题有待解答，但是已经有了一个基于生物纳米技术分子系统的模型，可以复制整个过程：将我们需要的分子—例如药物搬运到寻需要的地方。”  这一新发现是第一个展示肌浆球蛋白5怎样运动到目的地的机构。null 肌浆球蛋白5在尾部有两个长长的突出，每个突出包含一个发动机和杆，在尾部的另一端有一对装货物的地方。在细胞中，肌浆球蛋白5能通过发动机和叫做F-actin的细丝状物来使杆状物交替运动。但这样的运动是单向的，所以肌浆球蛋白5只能往一个方向运送物质。当物质运送完成后，接下来发生的事情就不大清楚了。 该小组人员说：“现在看来，肌浆球蛋白5在完成工作后会折叠起来，动力系统也被关闭，防止它到处游荡。但是它们怎样找到下一个货物并不清楚，或许它们会被去往其它方向的运输蛋白带走，开始一个新的循环过程。这就像按时间表运作的火车系统。null 50年代初生物学领域的三大发现促进了对蛋白质生物合成过程的阐明： 1.核糖体是蛋白质合成场所 Paul等人给动物注入放射性同位素标记的氨基酸，几分钟后杀死动物、取出肝脏分离亚细胞结构，结果发现仅在有核糖体的颗粒中存在标记的蛋白质。由此认为，核糖体是蛋白质生物合成的场所。 2.氨基酸活化现象 Mahlon等人发现，氨基酸与ATP和细胞质在一起保温后，氨基酸被活化，并且连接在一种热稳定的可溶性RNA上，这种RNA后来被称为转运RNA（tRNA）。null3.tRNA应接器假说 mRNA分子中核苷酸编码的遗传信息如何被翻译成蛋白质分子中20种氨基酸的顺序？Crick提出了tRNA应接器假说，即tRNA分子的某一部位只能专一性结合某种氨基酸，而另一部位只识别mRNA中编码氨基酸的三联体密码子。 null 蛋白质生物合成的复杂过程可概括为四个步骤： 第一步 氨基酸活化与转运 这个过程是在氨基酸活化酶和镁离子作用下把氨基酸激活成为活化氨基酸。这一过程还有许多其它因子参与，其发生部位在细胞质。 第二步 肽链（蛋白质）合成的启动 原核细胞肽链合成的启动首先是起始因子结合在核蛋白体小亚基上，使大小亚基分开，再与mRNA一端形成复合物。 核糖体大亚基与此小亚复合物结合，形成核糖体复合物，释放出起始因子，为肽链延长作准备。这一过程发生在核糖体上。null 第三步 肽链（蛋白质）延长 核糖体的大亚基上有两个位置可与tRNA结合，分别称为“给位”（P位）和“受位”（A位），此时蛋氨酰-tRNA占据在给位上，而受位空着，准备接受下一个新的氨基酰-tRNA。 第四步 肽链（蛋白质）合成的终止 对mRNA上的终止密码子进行识别，最后的肽酰-tRNA酯键水解，使新合成的肽链释放出来。这个过程也是发生在核糖体上。null第一节 tRNA tRNA参与蛋白质生物合成有至关重要的两个功能上相连的生物化学事件。 一种是由氨基酰-tRNA合成酶（AARS）催化的tRNA的氨基酰化 通过AARS对tRNA的序列和结构元件的专一识别和氨基酰化，使tRNA转化为氨基酰tRNA。 另一种是氨基酰tRNA在核糖体上提供氨基酸 它由tRNA的反密码子与mRNA的密码子通过碱基互补配对而发动。 这两个事件有序而协同的进行，决定了每个蛋白质的氨基酸序列。null mRNA携带的遗传信息要被翻译成蛋白质一级结构，要求氨基酸排列到mRNA分子上，但是氨基酸的侧链与RNA的碱基没有特异的亲和力。相反，碱基上的氨基和酮基还会排斥氨基酸。 因此，氨基酸若不经过“乔装打扮”或经过第三者“介绍”，难以按照mRNA所规定的准确顺序来合成蛋白质多肽链。null 氨基酸先经乔装打扮（即改变侧链），再与mRNA结合的可能性不大，因为改变一个侧链就要好几个酶参加，要改变及恢复20种氨基酸侧链所需酶类就太多。 如果氨基酸分子接到一个特异的应接器上，通过应接器再排到mRNA分子上，这就要方便经济许多。实验证明了这一点，并揭示tRNA充当了应接器的角色。null一、tRNA的二级结构 1965年，Robert Holley等对酵母丙氨酸tRNA进行研究后，首先发现了tRNA的结构，因此荣获了1968年诺贝尔化学奖。 tRNA是一类小分子RNA，长度为73～94个核苷酸，富含稀有碱基和修饰碱基。 目前已经确定了数百种tRNA分子的一级结构，并发现它们都能通过碱基的互补配对形成类似的二级结构，即三叶草型（cloverleaf）结构。 其特点如下： null1.tRNA中有22个碱基是恒定不变的。 2.5`端和3`端总是配对形成受体臂或氨基酸臂：负责携带氨基酸。 3.TψC环：有特殊的假尿嘧啶 ，此环负责与核糖体上的rRNA识别结合。 4.反密码子环：在环区中央存在着反密码子三联体，负责与mRNA上的密码子识别与配对。 5.D环（D-loop）：环区有4个碱基不稳定，含有特殊的双氢尿嘧啶。 6.可变环：可变性大，长度从4nt到21nt，其功能是连接D环－反密码子环和TψC环－受体臂。 图1-1显示了tRNA的三叶草结构。null图1-1 tRNA的三叶草型结构null二、tRNA碱基的修饰 除了双氢尿嘧啶和假尿嘧啶外，tRNA含有多个修饰碱基，其中一些是简单的甲基化，另外一些复杂得多，如鸟苷转变为称为wyosine的核苷，后者包含了复杂的三个指环碱基（Y碱基）。 某些tRNA的修饰是通用的，如所有的tRNA在TψC环的同一个部位含有假尿嘧啶，大多数tRNA在反密码子附近有wyosine，个别tRNA的修饰比较特殊。 图1-2列出了tRNAs常见的修饰碱基和核苷。null图1-2 tRNA常见的修饰碱基和核苷null tRNA在合成时与其它RNA一样，都是由的碱基组成。当转录完成后，多酶系统才开始修饰tRNA的碱基。 实验证实，未修饰的tRNA不能与氨基酸结合，是无功能的。因此，tRNA碱基的修饰是它们能够发挥转运氨基酸的前提，尽管不同的修饰产生的作用并不完全一样。null三、tRNA的三维结构 20世纪70年代，Alexander Rich等应用x-射线衍射揭示了tRNA的三维结构。大量的实验证实，各种tRNA存在共同的三维结构，即稳定的L型结构，该结构的稳定依赖于tRNA茎中的碱基配对来维持。 tRNA三级结构的特征如下： 1.tRNA的三维结构呈“倒L形”。 2.氨基酸接受臂CCA序列和反密码子处于倒L的两端，二者相距70A。 3.D环和TψC环形成了倒L的角。null4.许多tRNA三维结构的氢键形成涉及的都是固定碱基，说明 tRNA具有相同的三维结构。 5.绝大多数tRNA三级结构的氢键涉及的碱基种类不同于标准的A-U和G-C配对，少数三级结构反应涉及核糖与磷酸骨架中的基团，包括核糖的2’-OH基。 以酵母tRNA-Phe为例，三级结构氢键涉及的碱基对是：U8-A14，A9-A23，G15-C48，G18-ψ55，G19-C56，m2G10-G45，G22-m7G46，m2(2)G26-A44，Cm32-A39和T54-m1A58共10对碱基。null6.几乎所有碱基均是定向排列，以致成摞，因此在它们疏水平面之间有最大反应。 即使是明显不稳定的反密码子区亦通过成摞反应折叠得甚为牢固。三级结构中的成摞现象是稳定tRNA构象的主要因素； 7.只有少数几个三级结构氢键把密码茎固定于分子的其它部位，因此反密码子区的相对方向在蛋白质生物合成期间可以改变。 其它tRNA也有同样的三维结构,不同之处仅在倒L形的角有轻微改变，说明此拐角区也许是可伸屈的,以允许tRNA在执行不同功能时做相应改变(见图1-3) 。null图1-3 A：tRNA的晶体三维结构图；B：tRNA三维结构图 A Bnull四、tRNA对氨基酸的识别 tRNA通过反密码子和mRNA上的密码子相互配对，将特定的氨基酸运送到核糖体上肽链合成位点上。 tRNA是如何识别特定氨基酸的呢？这与tRNA的“身份”（identity）问题有关。 tRNA身份是指tRNA分子被某种氨基酰-tRNA合成酶识别并使其氨基酰化的结构基础，对tRNA身份的研究将阐明一种tRNA为什么只携带一种特定的氨基酸，而不携带别的氨基酸。 从发现tRNA以来，tRNA身份问题一直是tRNA研究的热点。null T7RNA聚合酶转录系统是用来研究tRNA身份常用的系统，首先由Uhlenbeck实验室建立。 他们将一个上游带有 T7RNA聚合酶启动子和3`-端带有限制性内切酶位点的tRNA基因克隆到质粒中，然后将质粒用限制性内切酶酶解，在体外转录出未修饰的tRNA，测定氨基酰-tRNA合成酶对一系列突变tRNA基因转录产物的动力学常数，即可揭示tRNA中不同核苷酸对识别的贡献。null 研究表明，不同来源的氨基酰-tRNA合成酶识别tRNA的位点不完全相同。但在同一物种中，每一种氨基酸专一的tRNA受体都有相同的部位参与氨基酰-tRNA合成酶对tRNA的识别过程。 反密码子、73位核苷酸、接受茎、可变口袋及可变（茎）环等部位通常在识别过程中起着重要作用。 在大肠杆菌中，除tRNA-Ala、tRNA-Ser、tRNA-Leu外，反密码子是一个重要的识别元件。 最近又发现反密码环上除反密码子以外的其它碱基和反密码子茎上的一些碱基对个别tRNA分子的识别也有重要作用。null 大肠杆菌的20种tRNA中，除tRNA-Thr外，第73位碱基都在氨基酰-tRNA合成酶对tRNA的识别中起着重要作用。73位核苷酸由于在识别方面的重要性而被称为“辨别子(discriminator)”。 有人统计了不同来源tRNA的73位碱基情况，发现73位出现哪种碱基不是随机的：嘌呤碱基特别是A出现的几率很大，而嘧啶碱基特别是C出现的几率很小。null 与73位核苷酸一样，接受茎也是想象中引人注目的识别位点，这是因为它也靠近氨基酸结合的3`末端而有可能与氨基酰-tRNA合成酶接触。 大肠杆菌tRNA-Ala接受茎上的G3:U70由于在识别中的重要性而受到了广泛关注。尽管很早就证明了tRNA-Ala的接受茎对识别很重要，但具有决定意义的是1988年两个著名研究小组分别在两大权威杂志上发表了从不同方面验证的相近的结果：接受茎上的一个简单的特征结构（G3:U70）是tRNA-Ala的主要识别元件。 得到这一结果并不意外，因为除tRNA-Ala外，所有tRNA分子的3:70位都不是G3:U70。null 在tRNA分子表面，由D环和TΨC环上的五个核苷酸16、17、20、59、60组成了一个小区，在不同的tRNA中这些核苷酸并不保守，因此称之为可变口袋（variable pocket），这完全是一个tRNA三级结构上的概念。 任何一个核苷酸在D环的插入或删除都有可能改变这个口袋的构象。 自Sampson等证明G20是酵母tRNA-Phe的一个识别元件以来，相继又发现大肠杆菌tRNA-Ala、tRNA-Phe、tRNA-Leu、tRNA-Arg在可变口袋中拥有识别元件。 null 在大肠杆菌体系中，人们根据反密码子茎和TΨC茎之间有无长可变茎将tRNA分子分为两类：没有长可变茎为第一类tRNA，具有长可变茎为第二类tRNA。仅有tRNA-Ser、tRNA-Tyr、tRNA-Leu属于第二类。 研究发现，大肠杆菌tRNA-Phe、tRNA-Ser、tRNA-Tyr的可变(茎)环在识别过程中起着重要作用。null 修饰碱基一般对识别作用不大，这是由于体外转录产物接近于天然tRNA的活力，甚至一个tRNA- Phe基因也能被特异性地氨酰化。 但是也有修饰碱基在氨基酰-tRNA合成酶对tRNA识别中起关键作用的例子，如大肠杆菌tRNA-Ile2反密码子是LAU（L，lysidine，赖胞苷，C的衍生物），对应的DNA是ATG，当基因转录后，从ATG转录出CAU中的C若不被修饰，则该tRNA为tRNA-Met，被MetRS识别，对应的密码子为AUG，但若C34被修饰为赖胞苷，则该tRNA为tRNA-Ile2，被IleRS识别，对应的密码子为AUA。 null L34不仅决定了该tRNA是tRNA-Ile还是tRNA-Met，而且决定了该tRNA对应的密码子是AUA还是AUG。 氨基酰-tRNA合成酶对tRNA识别的研究在上世纪九十年代由一级结构进入三级结构，由静态研究进入动态研究。胞质tRNA的D环15位与可变环48位形成Levitt配对。大肠杆菌tRNA-Cys没有这一配对，代之以G15和G48。null Hou等人研究证明，tRNA-Cys上G15-G48位置的三级结构（主要是磷酸核糖骨架）在CysRS对tRNA- Cys识别中起着重要作用。这显示了tRNA三级结构在氨基酰-tRNA合成酶识别上所起的作用比以前所认识到的更为重要。 Schimmel实验室用合成的RNA小分子—小螺旋(minihelix)和微螺旋(microhelix)做为氨基酰-tRNA合成酶的模拟底物，发现了接受茎与TΨC茎环在许多情况下足以决定tRNA的专一性。null五、校正tRNA 针对已经发生突变的基因，tRNA的校正系统可以对其进行修复。具有校正作用的tRNA称为校正tRNA。 在tRNA校正系统中，第一次突变是发生在mRNA上，改变了某个密码子，使有意义链变成了无意义链，因而蛋白质的产物是截短的，一般不具有功能。 第二次突变发生在tRNA上，改变了tRNA上的反密码子，如此它仍可识别原来mRNA上突变的密码子，并插入一个氨基酸，使蛋白质的功能得到恢复。null 校正tRNA的出现使完整的蛋白质得以合成。如果校正tRNA所携带的氨基酸与野生型蛋白此位点原有的氨基酸不同的话，此蛋白质的活性可能会降低。 校正tRNA系统有以下特点： 1.不是所有的校正都能产生有功能的蛋白质，关键要看氨基酸取代的情况。 比如由Leu的密码子UUG突变成UAG时，当校正tRNA所携带的氨基酸是Tyr、Ser或Trp时，可以产生校正作用。若氨基酸是带电荷的Lys、Gln或Glu，则产生的蛋白质是没有功能的。null2.校正的功能不可能是完全的，原因有二：一是校正的tRNA分子是有限的，而且还要和释放因子竞争；二是氨基酸的取代可使蛋白质的功能有所降低。 3.反密码子三个碱基中的任何一个都可能发生突变。 4.当细胞中含有多个tRNA拷贝时，校正才能发挥作用。 5.校正一般不会影响正常的终止，但也有例外。null第二节 mRNA及其携带的遗传密码 最近几年，小RNA分子由于其新发现的控制基因表达作用变得炙手可热,它给科学家们带来的惊喜显然还远未结束：另一种RNA能检测帮助细胞平稳运转的小分子水平，并根据细胞需要打开或关闭基因的表达。 　　耶鲁大学的科学家Ronald.Breaker等人在钻研了数十篇科学文献，解决了几个悬而未决的谜题后发现这些“多能”RNA分子的，他们将之命名为核开关。称为代谢物的小分子负责调节细胞的存活，代谢物的产生是一个受到基因精细调控的过程，这些基因是间接感知代谢水平的。科学家一直以为是特异蛋白与代谢物结合，诱导或抑制基因的表达。但Breaker发现的7个实例足以打消科学家徒劳寻找那些关键蛋白的积极性－其中几个甚至是30年前的研究报告。之所以以前的科学家没有找到关键蛋白是有原因的，他说。神秘蛋白实际上是信使RNA-mRNA。正常情况下mRNA的作用是将来自DNA的遗传信息送到细胞的核糖体，遗传信息在核糖体中被翻译成蛋白质。null 核开关－之所以如此命名是因为它们由RNA构成－就是特异mRNA上与代谢物结合的部分。结合改变了mRNA的形状，关闭一个基因的表达，偶尔也会打开基因的表达。“这是调查了20到30年间相关文献后得出的明确结论。”纽约的科学家Thomas. Tuschl说，但在Breaker之前，没人发现这一点。 　　2004年2月美国先进科学促进会年会上，Breaker报道了他的第八个细菌核开关。这个开关调节葡糖胺的水平，葡糖胺是帮助细菌构建细胞壁的关键糖分。不同于早先发现的7个核开关，这个核开关也是一种核酶，核酶是一类剪刀状的分子，能切断RNA并用这个能力控制基因表达。当葡糖胺在细胞内到达较好水平时，代谢物就与mRNA结合，诱导mRNA切断自身。这大大削弱了基因表达，因为DNA合成葡糖胺的信息不再被转录。奇怪的是，mRNA被剪切的部位并非蛋白编码区，但却仍然能成功破坏基因表达。 　　但显而易见细菌里充满了核开关，Breaker说。他已经证实了另外两个尚未公布的细菌核开关，并发现了10个新的候选者。真菌和植物中也发现了这种开关，Breaker尽快在动物中搜寻核开关。 null 2006年10月《Cell》杂志报道，北卡罗莱纳州的研究人员鉴定出了一种参与人类染色体形成的一个必须步骤的蛋白质。研究发现一种叫做CPSF73的蛋白就好像剪刀一样在细胞核中剪断组蛋白信使RNA链。这种剪切活动产生了形成组蛋白所需的mRNA。已经知道组蛋白与DNA结合形成染色体。 和所有蛋白一样，组蛋白通过核糖体解读特定RNA分子形成。将DNA的信息传递给核糖体的RNA就是mRNA。不被CPSF73剪切的RNA在细胞核中会被摧毁并且无法变成mRNA。组蛋白mRNA剪切发生在细胞为分裂做准备的阶段，并且对细胞最终分裂是绝对必须的。 10年前Zbigniew.Dominski等人就在寻找剪切组蛋白mRNA的蛋白质。Dominski能够在试管中重现通常在细胞核中发生的组蛋白mRNA加工过程。 null 但是这种RNA剪切反应发生的太快，致使他无法确定试管中无数的蛋白中哪一个才是真正的“剪刀手”。于是，研究人员设下了一个圈套：对组蛋白mRNA的被剪切位置的化学组成进行了轻微的改变。这种改变使剪刀手蛋白质仍然能靠近RNA，但其剪切的速度放慢了。通过放慢这个反应，Dominski就有了足够的时间来利用紫外光作为交联剂将这种RNA剪切蛋白附着到目标RNA上。一旦附着到RNA上，这种寻找已久的核酸酶就中了圈套，进而使它暴露了身份。这种被确定出的RNA剪切蛋白就是 CPSF73。已经知道这种蛋白质与一类特殊的mRNA－polyA化的mRNA的加工有关。这些mRNA充当除组蛋白外的所有蛋白的结构蓝图。 在进化过程中，所有mRNA似乎都是在CPSF73蛋白的帮助下被制造出来。这意味着分别针对polyA和组蛋白mRNA的两种 mRNA 加工机制明显不同。 研究人员进一步证明CPSF73不但能将组蛋白mRNA分子剪切成两半，而且还将组蛋白mRNA分子不需要的部分咀嚼成碎片。这一发现非常惊人，因为很少发现单独一个蛋白能够具有这两种活性。这些新发现为所有mRNA的合成提供了一个统一的机理。null mRNA分子中的核苷酸顺序与蛋白质分子中的氨基酸排列顺序是通过遗传密码相沟通的，mRNA分子从5`到3`方向，每3个连续的核苷酸碱基组成1个密码子，2个密码子之间无任何间隔标志。 mRNA中的四种碱基可组成64个密码子，代表20种氨基酸，也决定了翻译过程的起始和终止。 每种氨基酸至少有1个密码子，最多的有6个密码子。密码子AUG是起始密码，同时是蛋氨酸的密码子。有3个密码子UAA、UAG和UGA不代表任何氨基酸，起着终止肽链延伸的作用，被称为终止密码。 在mRNA中，起始密码位于5`端，终止密码位于3`端，翻译是沿着mRNA分子5`→3`方向进行。null 对遗传密码性质的推论到决定各个密码子的含义，进而全部阐明遗传密码，是科学上的杰出成就之一。 遗传密码的破译、测序方法的建立和体外重组的实现是基因工程的三大基石。在遗传密码破译后仅2～3年的时间，这项工作就获得了诺贝尔奖。 遗传密码的破译主要归功于三个方面的生物化学实验：体外翻译系统的建立、核糖体结合技术和核酸的人工合成。null1.体外翻译系统的建立 1961年，Nirenberg和Matthai建立了该系统。他们首先将大肠杆菌用氧化铝磨碎，经离心取出细胞壁及细胞膜碎片，得到了具备合成蛋白质条件的浆液。该浆液含有DNA、mRNA、tRNA、核糖体、氨基酰-tRNA合成酶及一些与蛋白质合成有关的因子。 将该系统预保温一段时间后，由于mRNA寿命短暂，DNA在DNase作用下被降解，因而这个体系中不含有自身的DNA和mRNA，故蛋白质合成停止。 此时，如果补充外源mRNA、ATP、GTP和氨基酸等成分，在37℃保温一段时间，这个体系又能合成新蛋白质，新合成蛋白质氨基酸顺序是由外加mRNA决定。 null 为了检测某个氨基酸的渗入情况，所补充的各氨基酸可选择地标记放射线元素，通过测定蛋白质的放射活性，即可了解氨基酸的渗入情况。 Nirenberg等开始用polyC作为模板来研究外源mRNA的活性，后将polyU加到上述的体外翻译系统中，意外地发现它能指导polyphe的合成，因而推断phe的密码子是UUU。 这样就为密码子的破译打开了一个突破口。此后，进一步用各种聚合物，即用二核苷酸如AU、UC、AC、AG、CG和三核苷酸UGC、AGC、UAC、UAG分别组成的共聚物作类似的体外翻译实验，确定了20个氨基酸的密码子组成。null2.核苷酸结合技术 体外翻译系统虽然解决了密码子的组成，却不能说明有关密码子中核苷酸的排列顺序。核苷酸结合技术的出现，则使密码子之迷得以彻底解开。 核苷酸结合技术是基于下述的两个基本事实： （1）人工合成的三核苷酸可以起mRNA模板作用； （2）在没有GTP存在时，三核苷酸可促进与其对应的携带有氨基酸的tRNA结合在核糖体上，而不生成蛋白质。结合的tRNA复合物可被硝酸纤维素滤膜吸附，未结合的tRNA不能被吸附。 由于三核苷酸模板只与一定的tRNA对应，此tRNA又只与一定的氨基酸结合。因此，只要有带标记的氨基酸被硝酸纤维素滤膜吸附，即可测出决定该氨基酸的密码子的组成和核苷酸的顺序。null3.人工合成核酸在破译密码中的作用 （1）用多核苷酸磷酸化酶（PNP酶）合成多聚核苷酸和具有特定顺序的三核苷酸； （2）磷酸二酯酶法合成64种三核苷二磷酸； （3）人工合成具有特定顺序的共聚物。 null 合成路线：先采用有机化学法（如磷酸二酯法）合成寡聚d（TAC）3和寡聚d（GTA）3，再以这两个寡聚核苷酸为模板，在DNA聚合酶I作用下，体外结合成两条互补的DNA链。 然后将上述的互补DNA链为模板，用RNA聚合酶转录出RNA。如果在反应混合物中加入GTP、UTP和ATP，这时polyd(TAC)被转录，而polyd(GTA)不被转录。反之，若加入CTP、UTP和ATP，polyd(GTA)就被转录。 以转录产物为模板翻译成多肽链，从多肽链中氨基酸的种类和顺序就破译出各种氨基酸密码的组成（见图1-4）。null d(TAC)3+d(GTA)3 DNA PolI＋dNTP 5`……TACTACTACTAC……3` 3`……ATGATGATGATG……5` UTP CTP +ATP +ATP GTP UTP 5’……GUAGUAGUA……3’ 5’……UACUACUAC……3’ 图1-4 人工合成具有特定顺序核苷酸示意图 null4.遗传密码的特点 （1）遗传密码是三联体密码 每一个密码子是由3个核苷酸构成，它特异地编码多肽链中的一个氨基酸。 （2）遗传密码无标点 即密码子之间没有空格，阅读mRNA时是连续的，一次阅读3个核苷酸。 （3）遗传密码不重叠 阅读mRNA时是以密码子为单位，连续阅读。 （4）遗传密码具有通用性 所有生物都有相同的密码。null（5）遗传密码具有简并性（degeneracy） 除AUG（Met）和UGG（Try）外，每个氨基酸都有一个以上的密码子，这种现象称为密码的简并性。同一个氨基酸的不同密码子称同义密码子。 密码子的简并性是相对的，决定同一种氨基酸的不同密码子的使用频率也是不一样的。从噬菌体MS2基因组和大肠杆菌的多种mRNA的核苷酸排列顺序中可以看到，高表达与低表达的基因中，密码子使用的频率有明显的不同。高表达基因的翻译效率与简并密码子的使用之间有一定的规律性。 null 当密码三联体的前两个核苷酸为GG、GC或CC时，与之配对的反密码子核苷酸则为G和C。 由于G、C之间结合的能量较大，因此在该三联体的第3位，即摆动位上，优先使用的是A或U，因为这与反密码子的U或A的结合能量较小。反之，当密码三联体的前两个核苷酸为AA、AU或UU时，则第3位优先使用G或C。 这就是说，密码子与反密码子的反应能既不能太强，也不能太弱，应是中等程度。这种相关性只存在于高表达的基因，对低表达的基因不适用。对应编码lac阻遏蛋白、色氨酸操纵子阻遏蛋白的低表达基因，所使用的密码子的频率是随机的。null（6）密码子有起始密码子和终止密码子 蛋白质合成的起始和终止信号含在密码子中，无论在原核还是在真核中AUG（Met）都是用作起始密码子，但在少数情况下也用GUG。 UAA、UAG和UGA为终止密码子，又称为无义密码子（nonsense codons）或终止密码子（chain－terminating codons），它们单个或串联在一起用于多肽链翻译的结束，没有相应的tRNA存在。null（7）反密码子中存在“摆动现象（wobble）” 64个密码子中，具有对应tRNA的有义密码子（sense codons）有61个，意味着可能有61个tRNA具有反密码子，但原核和真核细胞都只合成约30种带有反密码子的tRNA。 针对这种现象，Crick在1966年提出了摆动假说：当tRNA的反密码子与mRNA的密码子配对时，前两对严格遵守碱基互补配对法则，但第三对碱基有的自由度可以“摆动”。摆动假说也称为三中读二（2 out of 3 reading）。null第三节 核糖体 核糖体是蛋白质合成的场所，它具有大小两个亚基，在Mg2+存在下两个亚基互相结合。核糖体的成分是rRNA（占60%）和蛋白质（占40%）。真核生物和原核生物核糖体的rRNA和蛋白质的组成有一定的差异（见图1-5）。 核糖体与mRNA模板结合后，不断向前迅速合成肽链。氨基酰tRNA以极高的速度进入核糖体，将氨基酸转到肽链上，又从另外的位置离开核糖体，延伸因子也不断地和核糖体结合和解离。核糖体和附加因子一起为蛋白质合成的每一步骤提供活性区域。null图1-5 细菌和哺乳动物核糖体rRNA和蛋白质组成null 细菌的核糖体是附着在mRNA上，DNA一边转录成mRNA，核糖体就一边结合上去沿着5`→3`方向进行翻译，形成转录和翻译的偶联。 在真核细胞的胞浆中，核糖体总是和细胞骨架或粗面内质网的膜相结合。两者共同的特点是核糖体在细胞中从事翻译时并不是游离的，总是直接或间接地和细胞结构相连接。null一、核糖体的组成 原核和真核细胞核糖体的组成有所不同，两者都是核糖体蛋白颗粒，其中RNA的量要多于蛋白质。核糖体蛋白被称为r-蛋白（r-protein）。 原核细胞中所有的核糖体成分都已被鉴定。如大肠杆菌核糖体的小亚基（30S）是由16SrRNA和21种蛋白构成，大亚基（50S）是由23SrRNA和小分子5SrRNA以及34种蛋白构成。除一种蛋白存在四个拷贝以外，其余的蛋白都只有一个拷贝。 null 核糖体小亚基中的21种蛋白质分别以S1～S21表示，大亚基中的34种蛋白质分别以L1～L34表示。除S1、S6、L7和L12以外，核糖体的其它蛋白均为碱性蛋白，分子量从9,000到35,000不等。 真核生物的核糖体要比原核生物大得多，RNA和蛋白的总量很大，主要的RNA分子很长，并含有多种蛋白质，RNA在量上仍占主导地位。null二、rRNA的结构 rRNA中的修饰碱基比tRNA少得多，原核rRNA修饰碱基的比例一般不到1%。 大肠杆菌核糖体rRNA的修饰碱基主要是甲基化，16SrRNA有约10个，23SrRNA有约20个，它们大多存在于一级、二级结构非常保守的区域。 真核rRNA中核糖甲基化修饰较多。5S rRNA一般不含修饰成分。 尽管不同生物16S类rRNA或者23S类rRNA的序列有所差别，但在某些区域具有高度同源性，其功能相同，提示核糖体rRNA可能有共同的起源。null rRNA分子内含有大量的茎环结构。尽管通过rRNA序列可以推测其碱基配对区，但rRNA大分子碱基配对有多种可能性，因此很难预测其实际构像。 人们通过比较不同生物rRNA序列，建立了大肠杆菌16S类rRNA的二级结构模型。 16S类rRNA和23S类rRNA在二级结构基础上进一步折叠，形成有特点的三维空间结构，从而决定了核糖体大小亚基的形态。null 16SrRNA的空间结构在电镜下呈“Y”字型，与30S小亚基的大小和性状基本吻合，它的4个二级结构区分别对应于“Y”的相关部位。 16SrRNA有几个主要的功能区，如它的3`端保守序列－CCUCC－（第1535－1539位）是原核mRNA起始密码子，是富含嘌呤SD序列的互补结合位点，这一序列对蛋白质合成起始十分重要。 另外，在3`端还有蛋白质合成起始因子IF3结合位点。此外，16SrRNA第1390－1410位21个碱基序列是最保守区域之一，它是氨酰tRNA反密码子与mRNA密码子在核糖体小亚基上相互作用的部位。 null 23SrRNA的空间结构和16SrRNA明显不同，形状类似圆球，只有一个小隆起，其大小与形状和50S大亚基十分相似。23S类rRNA有几个功能区在蛋白质合成中非常重要，例如肽酰转移酶活性区等。 5SrRNA通过4对三级氢键将分子折叠得更为紧密。 null三、rRNA与核糖体蛋白质的结合 在rRNA分子中，抗核酸内切酶作用区可能是rRNA与核糖体蛋白质结合位点，这些位点可能有一定的二级结构，通常是带有未配对碱基突出的发夹结构。 某些核糖体蛋白质易于同游离的rRNA结合，而另一些需要其它rRNA结合蛋白诱导rRNA构像发生某些改变，才能与之结合。 每个核糖体蛋白分子都已经在核糖体上定位。在核糖体大、小亚基中，核糖体蛋白质与rRNA两种组份的质量中心大约相距2.5nm。 此现象表明，rRNA相对集中于核糖体亚基的一端，而蛋白组份则集中于另一端。null