彭师姐论文

细胞因子活化的供体淋巴细胞输注的疗效观察 细胞因子活化的供体淋巴细胞输注的疗效观察 以及作用机制的初步研究 中文摘要 一、细胞因子活化的供体淋巴细胞输注的疗效观察 目的 观察细胞因子活化的供体淋巴细胞输注（新型DLI）治疗异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）术后急性白血病复发患者的疗效。 回顾性分析16例allo-HSCT术后复发并接受新型DLI或常规DLI治疗的急性白血病患者的临床资料，用多参数微小残留病系统，包括骨髓形态学、流式细胞术（FCM）、实时定量PCR（RQ-PCR）、复合扩增荧光标记短串联重复序列（STR）-PCR结合毛细管电泳、R显带或荧光原位杂交（FISH）综合评价比较新型DLI和常规DLI疗效差异。Treatment regimens : 结果 新型DLI组8例，治疗时疾病状态包括血液学复发（HR）7例，复发倾向1例，常规DLI组8例，治疗时疾病状态包括HR7例，分子学复发1例。新型DLI组与常规DLI组的诱导缓解率分别为62.5% vs 25%，对HR的诱导缓解率分别为57.14% vs 14.28%，诱导缓解中位时间分别为7天vs 23天。GVHD发生率分别为62.5% vs 25%，全血细胞减少发生率分别为62.5% vs 75%。1年总生存率分别为50% vs 12.5%。 结论 单中心小样本临床分析结果显示，新型DLI治疗移植后复发急性白血病的诱导缓解率为62.5%，诱导缓解中位时间7天，持续缓解时间长，是治疗移植后复发的有效手段，未来有必要进一步探索个体化治疗策略，针对患者疾病状态、复发时间及移植类型设计新型DLI的治疗剂量，以最大程度产生GVL效应，降低重症GVHD的发生，延长患者的无病生存。 关键词 复发；异基因造血干细胞移植；供体淋巴细胞输注；细胞因子 二、细胞因子活化的供体淋巴细胞输注作用机制的初步研究 目的 初步探索细胞因子活化的供体淋巴细胞输注（新型DLI）可能的作用机制。 方法 1.血细胞单采法收集经G-CSF动员后的有核细胞PBSC， Ficoll密度梯度离心法分离得到单个核细胞（MNC），用不同浓度的IFN-α（500U/ml、1000U/ml、2000U/ml、4000U/ml）激活的MNC与SHI-1细胞系共孵育不同时间（2、3和7天），MTT法检测IFN-α活hua的MNC对SHI-1细胞系的杀伤效应；2.利用SHI-1细胞系分组实验，摸索达到最佳细胞毒效应的时间和细胞因子浓度节点，应用FCM检测IFN-α对淋巴细胞和树突状细胞（DC）免疫表型的影响；3. 收集4例移植后复发患者接受新型DLI治疗前后的外周血，FCM检测治疗前后的外周血中淋巴细胞亚群及淋巴细胞表面活化标志的变化。薛老师说之前的顺序有点乱，结合他的意见我将顺序做了些调整 结果 1. IFN-α能增强MNC对SHI-1的杀伤效率，高浓度IFN-α（4000U/ml）在作用时间为2天和3天时，即能显著增强MNC对SHI-1的杀伤效应，当作用时间延长至第7天时，常规浓度（1000U/ml）亦能显著增强MNC对SHI-1的杀伤效率；2. 达到最佳细胞毒效应的IFN-α浓度为4000U/ml，作用时间为3天，经过IFN-α培养3d的MNC，CD3+CD4+细胞比例升高，淋巴细胞活化标志CD69表达上调，DC表面成熟标志不同程度上调；3. 治疗有效的2例患者在治疗前后CD3+细胞、CD3+CD4+细胞、CD3+CD8+细胞均维持在稳定水平，而治疗无效的2例患者均出现不同程度的下降。治疗有效的患者均出现淋巴细胞活化标志HLA-DR表达上调。4例患者治疗前后NK细胞、CD4+CD25+ 细胞、T 细胞均未见明显变化。 结论 1.体外细胞系实验证实，经过7天的共孵育，高浓度和低浓度IFN-α均能增强供体淋巴细胞（G-CSF动员的PBSC）的抗白血病效应；2. IFN-α可能通过促进DC成熟活化，增加对肿瘤抗原的提呈，从而刺激T淋巴细胞增殖和活化，增强其杀伤效应；3.新型DLI可能通过活化传统T细胞发挥GVL效应。 关键词 供体淋巴细胞输注；干扰素-α；树突状细胞；淋巴细胞免疫表型；作用机制 作者： 彭碧云 指导老师：唐晓文 副教授 Clinical Research of Cytokine-Activated Donor Lymphocyte Infusion and Preliminary Study of Its Mechanisms Abstract Part Ⅰ Clinical Research of Cytokine-Activated Donor Lymphocyte Infusion Objective：To evaluate the effect and efficacy of cytokine-actived donor lymphocyte infusion (the novel DLI) in patients who relapsed after allogeneic hematopoietic stem cell transplantations (allo-HSCT). Methods：Sixteen patients with acute leukemia were retrospectively analyzed, who relapsed after allo-HSCT and were treated with the novel DLI or conventional DLI. Through multi-parameter detection of minimal residual disease, including morphology examination, flow cytometry (FCM), real time quantitive PCR (RQ-PCR), multiplex PCR amplification of short tandem repeats markers (STR-PCR), karyotype analysis with R-banding and fluorescence in situ hybridization, the therapeutic response of the novel DLI and conventional DLI were campared.Treatment regimen of two kinds of DLI were: Result：Eight patients received the novel DLI, in which 7 patients had hematological relapse and 1 patient had recurrence tendency. Other 8 patients received conventional DLI, in which 7 patients had hematological relapse and 1 patient had molecular relapse. Complete remission (CR) rate induced by the novel DLI and conventional DLI was 62.5% vs 25%, respectively. Complete remission rate for patients with hematological relapse was 57.14% vs 14.28%, respectively. The median time required for a response to CR was 7d vs 23d, respectively. In the group of receiving the novel DLI, the occurrence of GVHD and pancytopenia were 62.5% and 62.5%, whereas in the group of receiving conventional DLI, 2 of 8 patients developed GVHD and 6 patients (75%) developed pancytopenia. The overall survival at 1 year were 50% and 12.5% respectively. Conclusions：This pilot study in our institution here shows that a CR rate of 62.5% could be achieved used by the novel DLI treatment in relapsed patiens after allo-HSCT. The median remission-induction time is 7 days, and the remission state is durable. The novel DLI may be an effective therapy for patients with acute leukemia relapsed after allo-HSCT. In future, the optimal regimen of the novel DLI should be explored according to patients’ disease stage, relapsing time after HSCT and transplantation modality, in order to enhance GVL and minimize GVHD as well as prolong disease-free survival. Key words：relapse; allogeneic hematopoietic stem cell transplantation; donor lymphocyte infusion; cytokine Part Ⅱ Preliminary Study of Mechanisms for Cytokine-Activated Donor Lymphocyte Infusion Objective：To investigate the mechanism of cytokine-actived donor lymphocyte infusion (the novel DLI). Methods：1. G-CSF-primed peripheral blood nucleated cell was collected by leukapheresis. The nucleated cell was separated by ficoll density gradient centrifu- gation to obtain mononuclear cells (MNC). The SHI-1 cell strains were incubated with MNC activated by various concentrations of interferon-α (500, 1000, 2000 and 4000U/ml) and different times (2, 3 and 7 days). The tumoricidal activity of interferon-α actived MNC against SHI-1 was measured by MTT; 2. The key point of time and cytokine concentration was explored while the cytotoxicity of MNC against SHI-1 was maximal, the chage of surface molecules expression of lymphocytes and dendritic cells (DC) incubated with interferon-α was analyzed by flow cytometry (FCM); 3. Peripheral blood of 4 patients who were treated with the novel DLI was collected. The immunophenotype of lymphocytes after treatment was analyzed by FCM. Result：1. Interferon-α (IFN-α) enhanced the cytotoxicity of MNC against SHI-1 cell strains. After incubation for 2 and 3 days, high concentration of IFN-α (4000U/ml) could significantly enhance the cytotoxicity of MNC. While incubation for 7 days, conventional concentration of IFN-α (1000U/ml) could enhance the cytotoxicity of MNC against SHI-1 cell strains significantly; 2.The optimal key point or check point of cytokine concentration and time are 4000U/ml and 3 days. The percentage of CD3+CD4+ cell increased significantly and the activated marker CD69 of T lymphocyte also increased markedly. The expression level of CD83, CD86 and HLA-DR of DC also increased; 3. CD3+ 、CD3+CD4+ and CD3+CD8+ cell maintained at the stable level among the patients who had a response to the novel DLI, but decreased at the different level in the patients who had no response to the novel DLI. HLA-DR, the activated marker of lymphocyte, increased in the patients with response of novel DLI. While the percentages of NK cell、CD4+CD25+ cell and T cell did not changed during the novel DLI for all the 4 patients. Conclusions：1. In vitro, both high and low concentration of IFN-α can enhance MNC activity to kill the target cell after incubation for 7 days; 2. IFN-α may promote the maturation of DC and enhance the capability of presenting tumor antigen, which can stimulate T cell to active and proliferate and mediate the tumoricidal activity; 3. The GVL effect of the novel DLI may be mediated by traditional T lymphocyte. Key words：donor lymphocyte infusion; interferon-α; dendritic cell; immunophenotype lymphocyte; mechanism Written by Peng Biyun Supervised by Prof Tang Xiaowen 目 录 引 言 异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是治愈血液系统恶性肿瘤的唯一有效手段。随着医学诊疗新技术的发展，allo-HSCT在造血干细胞的来源、不同移植方式的应用、移植预处理和GVHD防范策略、移植后微小残留病检测体系及免疫治疗等诸多方面都取得了新的进展。但是无论何种形式的移植，都存在一定比例的复发率，总体复发率在20-40%，复发是移植后死亡的主要因素之一，是制约移植成败的关键问。 目前临床上治疗移植后复发，尤其是出现血液学复发的急性白血病（AL）患者的手段十分有限，一般可考虑供体淋巴细胞输注(DLI)、二次移植或通过再化疗的方法。但是由于存在原发耐药等因素，患者通过再化疗获得再次缓解（CR）的机率极小，即使能够获得CR，再缓解持续时间短，短期内可再次出现复发，因此单纯依靠化疗难以获得长期生存[1]，总体预后差。二次移植可使部分患者达到再缓解，但通常需要经过再次清髓性预处理，脏器毒性大，治疗相关死亡率高达近40%[2],而且二次移植后复发率仍较高，Eapen等[3]报道二次移植治疗移植后复发的急性和慢性白血病，1年总生存率（OS）和5年OS率分别为41%和28%，Radich等[4] 报道二次移植治疗移植后复发的急性髓系白血病（AML）的复发率可高达76%，4年的无病生存率仅为10%，同时花费巨大。自从1990年首次采用DLI治疗allo-HSCT术后复发的慢性髓细胞白血病（CML）[5]，使患者重新获得分子学水平CR，到现在，大量的临床实践证实DLI这一过继免疫治疗在治疗移植后复发和维持缓解状态中起着重要的作用，因此成为治疗移植后复发的首选策略。但是DLI的疗效有一定的局限性，即DLI的疗效具有疾病特异性，采用DLI治疗移植后复发的CML慢性期患者，可使约70-80%的患者重新达到血液学或分子遗传学的CR，大多数患者可维持持久的分子学水平缓解[6]，但是对于复发的加速期或急变期CML，诱导CR率降至12-28%，且缓解持续时间短，而对于移植后复发的AL患者，由于肿瘤负荷高，疾病进展速度快等因素，DLI的疗效欠佳，仅能使15％-29％的急性髓细胞白血病（AML）或骨髓增生异常综合征（MDS）患者达到CR，3年无事件生存率仅为31%[7-8]，对于发生血液学复发的急性淋巴细胞白血病(ALL)患者几乎无效。可见，allo-HSCT术后发生血液学复发的患者缺乏有效的治疗手段，预后恶劣，绝大部分患者最终死于复发。因此，探索更为行之有效的治疗，诱导并维持再缓解状态，降低治疗相关死亡率是血液科医生面临的一大课题。 allo-HSCT是利用移植物中细胞成分所介导的移植物抗白血病（GVL）效应来治愈血液系统恶性肿瘤，介导GVL效应的主要是供者来源的T淋巴细胞和NK细胞，它们通过不同的机制来识别并杀伤受者的白血病细胞[9]。常规DLI主要是输注未经处理的供者淋巴细胞以发挥GVL效应，消除残留病灶。目前常规DLI的作用机制不明，多数学者认为GVL效应可看作是移植物抗宿主（GVH）反应的一部分，GVH反应的靶细胞包括受者的造血组织细胞以及肝、小肠、皮肤等组织细胞，主要是前者。白血病细胞一方面拥有肿瘤特异性抗原（TSA），另一方面可能与宿主的造血细胞拥有共同的次要组织相容性抗原（mHA），从而使得供体淋巴细胞在攻击受者组织细胞的同时杀灭受者残留的白血病细胞，因此DLI可引发GVHD和GVL双重效应[10]。在上述免疫反应过程中，受者的树突状细胞（DC）一方面通过提呈mHA激活供体CD4+T淋巴细胞，另一方面还可分泌细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等刺激活化T淋巴细胞，活化的T淋巴细胞可分泌γ-干扰素（IFN-γ）、粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）进一步活化DC，还可分泌IL-2，进一步激活T淋巴细胞，形成逐步放大的“瀑布样”活化信号的级联反应，见图1。活化的DC不仅能够激活CD4+T淋巴细胞，还可通过提呈限制性HLA-I类分子-抗原肽复合物而激活CD8+T淋巴细胞，给CD8+细胞毒性T淋巴细胞的杀伤作用提供“许可证”。活化的T淋巴细胞一方面攻击表达mHA的上皮细胞产生GVHD，另一方面杀伤白血病细胞产生GVL效应。简言之，DLI过程中产生的GVL效应假说可以分为三个阶段：抗原刺激异体T淋巴细胞反应阶段，T淋巴细胞克隆扩增阶段，活化的T细胞产生效应阶段。 由于常规DLI的一个主要缺陷就是其GVL效应发生相对缓慢，DLI后T细胞必须通过识别抗原，活化，扩增成为具有一定数量的效应细胞，才能攻击肿瘤细胞，这一过程耗时较长。然而，复发的AL患者大多进展迅速，并在出现显著GVL效应前由于疾病进展死亡，因而DLI治疗效果不佳。因此目前认为常规DLI只能对存在微小残留病变的AL有治疗价值，而对于肿瘤负荷较大的血液学复发AL患者效果不佳甚至无效。因此探索新型移植后过继免疫治疗，挽救移植后血液学复发患者具有重要的临床实用价值和社会意义。 图1 DLI后T淋巴细胞活化模式图 我们对1例移植后复发，经过常规DLI治疗无效而且对格列卫耐药的Ph染色体阳性ALL患者实施了新型DLI治疗，即干扰素-α（IFN-α）联合输注经G-CSF动员后的供体外周血干细胞（PBSC）[11]，结果患者1周获得骨髓形态学缓解，2周获得细胞遗传学和分子学水平缓解，而且供体细胞嵌合状态从低水平的混合嵌合转变为供体细胞完全嵌合，疗效显著。这一治疗结果引发我们的思考，为何常规DLI无效，而应用新型的IFN-α联合G-CSF动员的供体PBSC输注，在不实施化疗的情况下能够如此迅速的清除gao zhong liu fu he de 白血病细胞，达到形态学、细胞遗传学和分子生物学的全面缓解呢？是否由于新型DLI中加入了IFN-α，改变了常规DLI的疗效，因此成为新型DLI治疗的核心所在？ 临床治疗的新发现促使我们探索该种新型DLI治疗的作用途径和机制，并希望在此基础上设计出更为合理的新型移植后过继免疫治疗方案。为此，我们总结了8例接受新型DLI治疗的移植后复发急性白血病患者的临床资料，并回顾性分析了常规DLI治疗移植后复发AL的疗效，比较两种DLI临床疗效的差异；另一方面，利用细胞株体外实验，验证IFN-α活化的PBSC对SHI-1细胞的杀伤效率，并利用流式细胞仪检测IFN-α对淋巴细胞亚群免疫表型及活化标志的影响，同时检测IFN-α对树突状细胞活化的影响，试图初步探讨该新型DLI的作用途径，为进一步揭示其机制奠定基础。 参 考 文 献 [1]Pollyea DA, Artz AS, Stock W, et al. Outcomes of patients with AML and MDS who relapse or progress after reduced intensity allogeneic hematopoietic cell transplantation. Bone Marrow Transplant. 2007; 40: 1027-1032. [2]Barrett AJ, Locatelli F, Treleaven JG, et al. Second transplants for leukaemic relapse after bone marrow transplantation: high early mortality but favourable effect of chronic GVHD on continued remission. A report by the EBMT Leukaemia Work- ing Party. Br J Haematol.1991;79: 567- 574. [3]Eapen M, Giralt SA, Horowitz MM, et al. Second transplant for acute and chronic leukemia relapsing after first HLA-identical sibling transplant. Bone Marrow Trans- plant. 2004;34:721-727. [4]Radich JP, Sanders JE, Buckner CD, et al. Second allogeneic marrow trans- plantation for patients with recurrent leukemia after initial transplant with total-body irradiation-containing regimens. J Clin Oncol. 1993;11:304-313. [5]Kolb HJ, Mittermüller J, Clemm C, et al. Donor leukocyte transfusions for treatment of recurrent chronic myelogenous leukemia in marrow transplant patients. Blood.1990;76: 2462-2465. [6]Dazzi F, Szydlo RM, Cross NC, et al. Durability of responses following donor lymphocyte infusions for patients who relapse after allogeneic stem cell transplant- tation for chronic myeloid leukemia. Blood. 2000; 96: 2712-2716. [7]Dazzi F, Fozza C. Disease relapse after haematopoietic stem cell transplantation: Risk factors and treatment. Best Pract Res Clin Haematol. 2007; 20:311-327. [8]Porter DL, Antin JH. Donor leukocyte infusions in myeloid malignancies: new strategies. Best Pract Res Clin Haematol. 2006;19:737-755. [9]Barrett AJ. Understanding and harnessing the graft-versus-leukaemia effect. Br J Haematol. 2008;142:877-888. [10]Kolb HJ. Graft-versus-leukemia effects of transplantation and donor lymphocytes. Blood.2008;112:4371-4383. [11]Wang Y, Xue MX, Wu XH, et al. Successful treatment of relapsed Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia with T315I mutation after haplo-identical hematopoietic stem cell transplantation with donor lymphocyte transfusion and interferon α-2b. Leuk Res. 2009;33:e111-113. 第一部分 细胞因子活化的供体淋巴细胞输注 的疗效观察 异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是治疗甚至治愈血液系统恶性疾病的唯一有效手段。但是移植后复发是制约移植预后的主要瓶颈之一，严重影响移植患者的生存率。因此积极探索行之有效的治疗策略无疑具有深远的意义。我们对1例移植后复发，经过常规DLI治疗无效而且对格列卫耐药的Ph染色体阳性ALL患者实施了细胞因子活化的供体淋巴细胞输注（即新型DLI）[1]，xun su huo de fen zi shui ping de huan jie, 疗效令人振奋，随后又相继对7例移植后复发的患者实施了新型DLI治疗。下面回顾性分析16例allo-HSCT术后复发并接受新型DLI或常规DLI治疗的患者的临床资料，同时将两种治疗方案的疗效进行对比。 病例和方法 1、病例资料 回顾性分析2002年5月至2009年9月在我院接受DLI治疗的16例移植后复发患者的临床资料。其中新型DLI治疗组8例，常规DLI治疗组8例，男11例，女5例，中位年龄21（12-55）岁。疾病类型包括急性髓细胞白血病（AML）7例，急性淋巴细胞白血病(ALL)9例。 2、诊断标准 复发的标准：血液学复发：参照文献[2]；分子学水平复发：间隔一个月以上，连续2次出现融合基因转录本阳性或转录本拷贝数持续升高；复发倾向：骨髓形态学检测出现原始细胞但尚未达到HR的诊断标准或供体细胞嵌合度持续下降或通过流式细胞仪检测微小残留病灶（MRD）＞10-2水平。You yi ju ma? 3、治疗方法 新型DLI：参照文献[1]；常规DLI：单采供体淋巴细胞或输全血。其中单采供体淋巴细胞或G-CSF动员后的供体外周血干细胞（PBSC）采用CS-3000血细胞分离机进行采集。The dosage of CD3 and the regimens of two groups. 4、疗效判定 利用多参数微小残留病检测系统综合评判疗效：包括骨髓形态学观察骨髓情况，流式细胞仪（FCM）检测微小残留病灶水平，R显带技术进行核型分析和/或荧光原位杂交技术（FISH）监测细胞及分子遗传学变化情况，实时定量PCR（RQ-PCR）检测分子学水平变化情况，复合扩增荧光标记短串联重复序列（STR）-PCR结合毛细管电泳检测供体细胞嵌合度。 结 果 1、病例一般资料 常规DLI组男6例，女2例，中位年龄40（17-55）岁。疾病类型包括AML 6例，ALL2例。复发的中位时间为移植后3（0.7-22）个月。DLI时疾病状态包括HR7例，MR1例。中位随访时间3.5（0.5-12）个月。 新型DLI组男5例，女3例，中位年龄18.5（12-34）岁。疾病类型包括ALL 7例，AML1例。复发的中位时间为移植后4（2.5-20）个月。DLI时疾病状态包括HR7例，复发倾向1例。中位随访时间8.3（1.5-18）个月。 2、疗效观察 常规DLI组诱导缓解率25%（2/8），分别为AML1例（MR），ALL1例（HR），1例患者达到部分缓解，5例无效。DLI至诱导缓解的中位时间为23（16-30）天。2例治疗有效患者中1例随访至第9个月时失访，1例死于GVHD、肺部感染。1年总生存率12.5%，中位生存期3.5（0.5-13）个月。 新型DLI组总体诱导缓解率75%（6/8），分别为AML1例（HR），ALL 5例（HR4例，复发倾向1例），其中1例ALL患者为再诱导化疗达缓解后接受新型DLI治疗，新型DLI直接诱导缓解率为62.5%（5/8）。DLI至诱导缓解的中位时间为7（7-14）天。 6例治疗有效患者4例存活，1例死于感染性休克，1例 fei zheng chang si wang自杀。1年总生存率50%，sui fang zhi jin, 中位生存期8.3（1.5-18）个月。新型DLI的疗效及与常规DLI的疗效对比见图1-1，1-2。 3、治疗相关不良反应 治疗相关不良反应主要包括GVHD和全血细胞减少。常规DLI组全血细胞减少发生率为75%（6/8），GVHD发生率为25%（2/8），1例给予免疫抑制剂干预后控制，1例死于GVHD。新型DLI组全血细胞减少发生率为62.5%（5/8），GVHD发生率为62.5%（5/8）, 给予免疫抑制剂干预治疗后控制，3例迁延至慢性GVHD，另外有50%患者（4/8）出现非感染性发热。 图1-1 1 li M5 allo-HSCT hou fu fa huan zhe jie shou 新型DLI治疗前后 供体细胞嵌合度和WT-1基因拷贝数的变化 图示为新型DLI治疗有效病例在治疗前后供体细胞嵌合度以及WT-1基因拷贝数的变化曲线图，由图可见，WT-1基因拷贝数由复发时15164copies迅速下降至42copies，供体细胞嵌合度从复发时的低水平混合嵌合状态（39.7%）迅速转变为完全嵌合状态（95%），并一直维持完全嵌合状态。 图1-2 新型DLI与常规DLI的OS对比 讨 论 allo-HSCT是治愈血液系统恶性肿瘤的唯一有效手段。虽然随着医学诊疗新技术的发展，allo-HSCT在造血干细胞的来源、移植方式的应用、移植的策略和方法、移植后微小残留病检测体系及免疫治疗等诸多方面都取得了新的进展。但是无论何种形式的移植，都存在一定比例的复发率，总体复发率在20-40%，复发是移植后死亡的主要因素之一，是制约移植成败的关键问题。 DLI作为治疗移植后复发患者的首选方案，可诱导约70-80%的患者重新达到血液学或分子遗传学缓解，而且大多数患者可维持持久的分子学水平缓解[3]，但是对于肿瘤负荷大或进展速度快的疾病，如CML加速期或急变期、AML，疗效十分不理想，而对血液学复发的ALL几乎无效。因此，国内外学者试图积极探索一个新的、有效的治疗移植后复发患者的。有研究认为如果化疗能诱导移植后复发的患者达到再缓解，则可增加患者对DLI的敏感性[4]。Choi等首先应用化疗治疗10例移植后复发的ALL患者，随后输注经G-CSF动员的DLI，但是仅1例患者获得长期无病生存[5]。可见，异基因造血干细胞移植后血液学复发患者预后恶劣，缺乏有效治疗手段，对移植后血液学复发患者的治疗，尤其是移植后复发的ALL患者治疗是血液科医生面临的一大挑战。 我们的治疗结果显示，新型DLI可在不经化疗的基础上，迅速清除血液学复发患者高肿瘤负荷，并在短期内（中位时间7天）获得完全缓解，有效率高达62.5%，疗效持久，最长持续缓解时间已长达18个月，结果令人振奋，不仅如此，这种新型DLI治疗的优势还在于：①效应细胞无需体外处理：在接受新型DLI治疗的复发急性白血病（AL）患者体内，可能存在着次要组织相容性抗原和大量的肿瘤特异性抗原（肿瘤细胞破坏溶解后释放），经细胞因子刺激活化的树突状细胞，白血病靶细胞以及输注的经细胞因子活化的效应细胞（T和NK细胞），具备肿瘤免疫治疗的所有必备因素，无需在体外再制备肿瘤特异性抗原和效应细胞，临床应用便利；②可能由于IFN-α，启动了细胞因子和效应细胞活化并相互作用的级联放大效应，使得临床血液学复发的患者均在短期（1月内）获得了缓解，改变了常规DLI起效慢，无法控制进展迅速的AL的缺陷；③尽管该新型DLI也无法避免产生GVHD，但绝大多数DLI研究均证实GVHD与GVL效应密切相关，北美研究表明90%的DLI有效者出现aGVHD，88%的DLI有效患者发展为cGVHD，而无GVHD的23例患者中仅3例达到缓解，因此对于移植后出现血液学复发的无药可治的AL患者，我们认为通过GVHD产生GVL效应，可能是这些患者再次取得缓解的必经之路。 新型DLI的作用机制尚不清楚，我们推测经G-CSF动员的供体PBSC，其中含有大量的免疫活性细胞，如T淋巴细胞、NK细胞、DC细胞等，预先接受IFN-α治疗的患者体内一方面产生了大量的前炎症因子（如IFN-γ，TNF-α，IL-2等），上调了宿主DC表面的共刺激分子，以及MHC-I和II类分子表达量，促进DC成熟和活化，增强了DC的抗原提呈能力，当经G-CSF动员的供体PBSC进入患者体内后，大量的供体T细胞在宿主活化DC的抗原提呈和细胞因子的作用下，T细胞发生活化，NK细胞活化，通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤白血病细胞，同时活化的CD4+T细胞自分泌或旁分泌细胞因子，滋养NK和CD8+ T细胞，杀伤肿瘤细胞，并进一步释放各种炎性因子，从而形成效应细胞活化的级联放大作用，这都有待进一步证实。未来的机制研究将有助于我们摸索细胞因子应用最佳剂量和组合，以优化新型DLI，减少重症GVHD的发生。 既往国外也有IFN-α联合DLI治疗allo-HSCT术后复发患者的报道[6-7]，但是这几例病例报道的疾病类型局限在CML等对DLI治疗反应敏感的疾病，且均为个例报道。该新型DLI治疗在国内尚未见报道。Ke jian我们实施的新型DLI shi yi xiang chuang xin xingahi liao, 为移植后AL复发的治疗又提供了一个有效的治疗手段，而且治疗相关不良反应轻微，包括非感染性发热、全血细胞减少、GVHD，患者均可耐受完成治疗。因此，新型DLI的应用无疑具有重要的临床价值和社会意义，未来有必要进一步探索针对不同移植类型患者设计新型DLI的治疗剂量，以最大程度产生GVL效应，而降低重症GVHD的发生，延长患者的无病生存。对该治疗方案作用机制的研究不仅能探索该策略的作用途径，更有可能为将来开辟一条新的过继免疫治疗方向。 参 考 文 献 [1]Wang Y, Xue MX, Wu XH, et al. Successful treatment of relapsed Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia with T315I mutation after haplo-identical hematopoietic stem cell transplantation with donor lymphocyte transfusion and interferon α-2b. Leuk Res. 2009;33:e111-113. [2]张之南.血液病诊断及疗效标准．第2版．北京：科学出版社.1998；169-229. [3]Dazzi F, Szydlo RM, Cross NC, et al. Durability of responses following donor lymphocyte infusions for patients who relapse after allogeneic stem cell transplant- tation for chronic myeloid leukemia. Blood. 2000; 96: 2712-2716. [4]Kolb HJ, Schattenberg A, Goldman JM, et al. Graft-versus-leukemia effect of donor lymphocyte transfusion in marrow grafted patients. European Group for Blood and Marrow Transplantation Working Party for Chronic Leukaemia. Blood.1995; 86: 2041–2050. [5]Choi SJ, Lee JH, Lee JH, et al. 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Biol Blood Marrow Transplant.2004; 10:204 -212 . 第二部分 细胞因子活化的供体淋巴细胞输注作用机制的初步研究 移植后复发是制约移植预后的主要瓶颈之一，无论实施何种方式的移植，都有一定的复发率，总体复发率在20%-40%，最终导致移植失败。对于移植后复发，尤其是出现血液学复发的急性白血病（AL）患者，由于治疗手段十分有限，总体预后十分恶劣。我们对1例移植后复发的Ph染色体阳性ALL患者实施了细胞因子活化的供体淋巴细胞输注（即新型DLI），取得了显著的临床疗效[1]，进而引发了我们对这一治疗方案的思考。在此我们对四例移植后出现复发的AL患者在接受新型DLI治疗前后外周血中淋巴细胞亚群的变化进行了研究，同时利用细胞株体外实验，初步探讨新型DLI的作用机制。 材料与方法 一、材料 1、细胞株 白血病细胞株SHI-1由江苏省血研所陈苏宁博士馈赠。 2、经G-CSF动员后的外周血干细胞（PBSC）采集 为健康zao xue gan xi bao juan xian zhe , G-CSF动员后用血细胞分离仪采集PBSC。 3、移植后复发的白血病患者标本采集 采集2009年3月至2009年7月苏州大学附属第一医院血液科收治的4例移植后复发患者的外周血，EDTA抗凝。 4、主要试剂与仪器 IMDM培养基为Hyclone公司产品，胎牛血清（FCS）为杭州四季青公司产品，淋巴细胞分离液（Ficoll）购自上海试剂二厂，干扰素-α（IFN-α）为北京凯因生物技术有限公司产品，噻唑蓝（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）为Sigma公司产品，树突状细胞检测试剂盒、鼠抗人CD3-PC5、CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-PE、CD69-PC5、CD16-PE、CD56-PE、HLA-DR-PC5、CD25-PC5、T -PE以及小鼠IgG-PE同型对照均为Beckman Coulter公司，细胞冻存液由培养基、胎牛血清、DMSO按7：2：1比例配制，红细胞裂解液、PBS为江苏省血研所自制。 二氧化碳培养箱（Thermo公司），双目倒置显微镜（Olympus公司），紫外分光光度仪（BIORAD公司），五色流式细胞仪（Beckman Coulter公司）。 二、方法 1、细胞培养 SHI-1细胞于含20%FCS的IMDM培养液中， 置于37℃、5% CO2浓度条件下的二氧化碳培养箱中培养，每3天半量换液1次，5-6天传代1次，实验时取对数生长期细胞。 2、Ficoll密度梯度离心法分离PBSC来源的单个核细胞（MNC） ①无菌收集上述健康供者的PBSC 5ml，肝素抗凝，用1×PBS缓冲液按1：2比例稀释，充分混匀。 ②在一干净试管中加入适量淋巴细胞分离液，用吸管取稀释后的PBSC沿试管壁缓慢滴加于淋巴细胞分离液面上，将试管置于低速离心机中，水平离心2000rpm×20分钟。 ③离心后用吸管插入白膜层，吸取白膜层细胞置于另一干净试管中，加入1×PBS 5ml吹打混匀，1500rpm×10分钟,洗涤细胞两次，即得到单个核细胞。 ④末次离心后，弃上清，加入20%FCS的IMDM，重悬细胞，分别取1滴用于细胞计数和台盼蓝染色进行细胞活力检测。要求细胞活力大于95%。 3、不同浓度IFN-α激活的PBSC-MNC对SHI-1细胞杀伤效率的测定 ①将PBSC-MNC作为效应细胞（E），SHI-1细胞作为靶细胞（T），PBSC-MNC调整其细胞浓度为2×106/ml接种于96孔板中，按效靶比为10：1加入靶细胞2×105/ml，实验组加入不同浓度的IFN-α，对照组不加IFN-α。分为两组，实验组：实验Ⅰ组（PBSC-MNC+SHI-1+IFN-α500U/ml）、实验Ⅱ组（PBSC-MNC+ SHI-1+IFN-α1000U/ml）、实验Ⅲ组（PBSC-MNC+SHI-1+ IFN-α2000U/ml）、实验Ⅳ组（PBSC-MNC+SHI-1+IFN-α4000U/ml），对照组：实验对照Ⅰ组（SHI-1+ IFN-α500U/ml）、实验对照Ⅱ组（SHI-1+ IFN-α1000U/ml）、实验对照Ⅲ组（SHI-1+ IFN-α2000U/ml）、实验对照Ⅳ组（SHI-1+IFN-α4000U/ml），对照组为PBSC-MNC+SHI-1，另设两组空白对照组：单独PBSC-MNC组、单独SHI-1细胞。每组设4个复孔，置于37℃、5% CO2浓度条件下的二氧化碳培养箱中。 ②分别在培养2d、3d和7d终止反应，实验终止前4小时每孔加入20ul MTT（5mg/ml），置于二氧化碳培养箱中继续培养4小时。 ③将96孔板置于离心机中，3000rpm×10分钟，弃上清，每孔加入150ul DMSO终止反应，水平震荡10分钟，待其充分溶解后后用酶标仪在OD570nm波长处测吸光度值。每组取其平均值。 ④按下列公式计算杀伤率： 杀伤效率（%）= ODE+ODT－OD(E+T) / ODT×100%； ODE: 效应细胞孔OD570nm；ODT：靶细胞孔OD570nm；OD(E+T)：效靶混合孔OD570nm。 4、IFN-α对淋巴细胞表型和淋巴细胞活化标志的影响 ①PBSC-MNC调整其细胞浓度为1×107/ml置于含有IFN-α，20%FCS IMDM培养液中，IFN-α终浓度为4000U/ml。置于37℃、5% CO2浓度条件下的二氧化碳培养箱中培养，3天半量换液1次，补充细胞因子浓度。分别在培养前、培养后3d、7d进行以下步骤。 ②吸取相同体积的细胞悬液置一干净试管内，将试管置于低速离心机中，1000rpm×5分钟水平离心，弃上清，1×PBS缓冲液洗涤细胞1次。 ③1×PBS重悬细胞，平均分成3组，分组如下： A组加入CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE，B组加入CD3-FITC/CD16-PE/ CD56-PE/HLA-DR-PC5，C组加入CD3-FITC/CD25-PE/CD69-PC5。 ④常温下避光反应30min，1×PBS洗涤1遍