板蓝根提取工艺及质量标准的研究

山西医科大学硕士学位 摘要 板蓝根为十字花科植物菘蓝的_下燥根，在中国有广泛的栽培，是我国多年来常用的清 热解毒药，具有抗病毒、抗内毒素、解热镇痛、抗炎、活血化淤、抗癌的功效，有文献报 道上述功效主要与其所含水溶性成分氨基酸、多糖和脂溶性成分靛玉红、靛蓝等有效成分 有关。而目前板蓝根制剂的提取工艺是水提醇沉法，该工艺能明显造成脂溶性有效成分的 损失，为此本课题对板蓝根的提取工艺进行了系统的研究，并对板蓝根制剂的质量标准进 行了研究。 本课题以板蓝根中两种有效成分(精氨酸和靛玉红)的含量指标为依据，优选醇溶液 的提取工艺，并通过正交实验对影响该工艺的条件进行筛选，确定70％乙醇溶液，加入体 积为12倍量，提取3次，每次1小时为最佳提取工艺。并依据药典方法，制得了板蓝根 颗粒剂。 本课题采用高效液相色谱法对板蓝根制剂的质量标准进行了研究。在甲醇：水(80：20)， 加入辛烷磺酸钠(CsHITNa03S)使其浓度为O．005mol／L、加入磷酸二氢钾(KH2P04)使其浓 度为0．02mol／L，用磷酸调节至pH2．6为流动相，检测波长206nm的液相条件下，对精氨 酸的含量进行了测定；同时在甲醇：水(80：20)(0．1％二乙胺，用醋酸调中性)为流动相， 检测波长289nm的液相条件下，对靛玉红的含量进行了测定，根据对三份样品的测定结果 得出本颗粒剂中精氨酸的含量为9．79mg／g、靛玉红的含量为4．12lag／g。并且对板蓝根制剂 进行了薄层鉴别研究，分别以靛玉红和精氨酸对照品为对照，以正己烷一二氯甲烷一丙酮(5： 4：1)和正丁醇一冰醋酸一水(19：5：5)为展开剂，结果显示所建立的薄层鉴别方法成熟、 稳定，可作为靛玉红和精氨酸的薄层鉴别方法。 制剂方面，本课题进行了中试放大试验。为进一步的大生产奠定了基础。 关键词：板蓝根，提取，靛玉红，精氨酸，HPLC，TLC 专业提供学术期刊、学位论文下载、外文文献检索下载服务 购买地址: http://krwl.taobao.com 山西医科犬学硕士学位论文 Abstract Isatidisisthexero—rootofIsatistinctoria，havingbeenwidelycultivatedinchina．It’Sone kindoforthodoxheat—clearinganddetoxicatingmedicinalmaterialsinourcountry，havingmany effectivenessofAnti-virus、dntiendotoxin、An#inflammatory、AnticarcinogenicandSOon．It’S reportedthattheseeffectivenesscomefromwater—solubilityaminoacids、polysaccharidesand liposolubilityIndirubin、Indigotin—theeffectivecomponentinlsatis．Butnowtheextraction technologyisthemaintechnologyofextractionartwork，whichobviouslymakestremendous expensesoftheliposolubilityeffectivecomponent．Theexperimentinvestigatedtheextraction technologysystematically，alsousedHPLCtoestablisheitsqualitystandard． WiththecontentofIndirubin-theeffectivecomponentinlsatisasindex，theinfluencing factors(Thedensityofflcoholsolvent，theratioofmaterialandsolventandtheextracttimeand SOon)werestudiedbytheorthogonaidesign，Thebestextracttechnologywasaccepted，itwas asfollows：70％alcoholassolvent；theratioofmaterialandsolvent1：12：extractingthreetimes withlhforeachtime． AproperqualitystandardwasestablishedbyHPLCtodeterminethecontentofRadix IsatidisinIndirubinandArginine．thecontentofArginine—t11eeffectivecomponentinlsatis hadbeendeterminedonthemobilephasesconsistedofmethanol-water(80：20O．005mol／L CsHl7Na03Sand0．02mol／Lpotassiumdihydrogenphosphate)withthewavelengthofdetector 206nm．ThecontentofIndirubin_IheeffectivecomponentinIsatishadalsobeenexaminedon themobilephasesconsistedofmethanol—water(80：200．1％diethylamine、withthewavelengthof detector289nm．TheresultsshowedthatthecontentofArgininewas9．79mg／gandIndirubin was4．12ug／ginIsatidispreparation．AndtheTLCmethodhadalsobeenusedtodiscriminate ArginineandIndirubinwiththedevelopingsolventconsistedofn-butan01．glacialacetic acid·water(19：5：5)andN-hexane-methylenechloride—acetone—acetone(5：4：1)． Inthefieldofpharmacytests．Formulationprocessofgranulewasalsoinvestigatedto provideabasisforthelargescaleproduction． Keywords：Radixlsatidis，Extracting，lndirubin，Arginine，HPLC，TLC II 山西医辩大学域士学位论文 刖 罱 板蓝根Radixisatidis(又名：靛青根《本草便读》，靛蓝根《分类草药性》，靛根《中 药行性经验鉴别法》)来源于十字花科植物菘蓝(IsatisindigoticaFort)的根，两年生草本 植物，适应性很强，对自然环境和土壤要求不严，在我国产地较广，是一味常用清热鳃毒 中药。 板蓝根含有吲哚类化合物：靛苷(indoxyl．B．glucoside)、靛玉红(indimbin)靛蓝 (indigotin)；喹唑类生物碱isaindigotidione(1、2)、色胺酮；氨基酸类：精氨酸(A玛)； 芥子苷类化合物；含硫类化合物：告衣春、告衣春；有机酸类：苯甲酸、水杨酸、氨基 苯甲酸、丁香酸；腺苷；多糖等。现代药理研究表明，板蓝根具有抗病毒；解热、镇痛、 抗炎；活血化淤：抗癌等功效，对金色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、脑膜炎双球菌等均有抑 制作用。目前临床上主要用于防治流行性腮腺炎、流行性乙型脑炎、流行性感冒、病毒性 传染、乙肝等。据文献报道板蓝根上述功效主要来自所含水溶性氨基酸、多糖和脂溶性靛 玉红、靛蓝等有效成分。 鉴于目前板蓝根制剂的主要生产工艺是将板蓝根用水煎煮，将合并的煎煮液浓缩，然 后再加入乙醇，静置，取上清液，浓缩，干燥得清膏，在清膏中加入适当的辅料，制成不 同的板蓝根制剂，如板蓝根茶和板蓝根颗粒(《中国药典》2005年版一部p487)。此种工 艺明显造成板蓝根中脂溶性有效成分靛玉红、靛蓝等提取率降低。但尚未见系统研究乙醇 提取板蓝根工艺的方法。现行《中国药典》对板蓝根制剂的质量标准要求仍停留在主要以 定性鉴别的方法来加以考证，没有定量质控方法。这就在很大程度造成现有板蓝根制剂质 量良莠不齐的现状，难以规范市场中板蓝根制剂产品的标准。因此本论文对板蓝根的提取 工艺和质量检控方法进行了系统研究。 在提取工艺研究中，用乙醇代替水作为板蓝根的提取溶媒，通过多因素多水平实验， 考察了不同浓度的乙醇溶液对板蓝根药材有效成分的提取率。通过定量检测提取物中水溶 性有效成分和脂溶性有效成分的含量，确定最佳提取工艺。 实验方法包括下列步骤： ①取板蓝根饮片适量，加50--90％乙醇溶液5～15倍量，置合适容器中，密闭，冷浸1—24 小时； ②加热回流提取0．5~2小时，合并乙醇提取液； ③滤过，在真空度为lO～90kPa下，减压回收乙醇，得药液： ④将药液在真空度10--90kPa下，减压浓缩至相对密度为1．25～1．35(50℃)的稠膏； ⑤将稠膏减压干燥，得产物。 在质量标准研究中，依据《中国药典》(2005年版)有关颗粒制剂的要求，进行板蓝 根颗粒制剂的制备。并对其进行定性、定量方面的研究。 山西医辩大学硕士学位论文 定性研究采用薄层色谱法，对脂溶性有效成分靛玉红，水溶性有效成分精氨酸进行了 定性研究，建立了板蓝根颗粒剂的定性鉴别方法。 定量研究采用高效液相色谱法，对脂溶性代表成分靛玉红和水溶性代表成分精氨酸进 行了定量检测研究，建立了板蓝根制剂的含量检测方法。 2 山西医科大学硕士学位论文 第一章 板蓝根提取工艺的研究 l材料、仪器及试药 1．1板蓝根药材 购于山西省中药材公司(产地：河北安国，批号：050312、051018、060103)符合中 国药典规定的板蓝根饮片要求。 1．2主要仪器与试剂 岛津LC．10ATvp液相仪、SPD．10Avp检测器、RPL．C2000柱温箱 RE．52A．A旋转蒸发仪 可调式MH5000型电热套 靛玉红对照品(批号：110717、200204)购自中国药品生物制品检定所 精氨酸对照品(批号：200508)购自中国药品生物制品检定所 乙醇(浓度：95％购自北京市化学试剂厂) 硅胶G(青岛海洋化工厂) 其它所用试剂均为分析纯 2实验方法及结果 2．1提取方法考察 提取工艺路线主要根据药物中有效成分的理化性质和药理作用、制剂剂型、生产可行 性、生产设备、及经济效益多方面因素来确定。本实验对板蓝根的不同提取工艺进行了比 较研究，在确定好的提取方法后，对影响该提取工艺的主要因素如：醇浓度、料液比、提 取时间、提取次数等进行考察研究。 2．1．1不同提取工艺的比较研究 对传统提取工艺(水提醇沉)和本实验所研究的提取工艺(醇溶液提取)进行比较， 以提取物中脂溶性和水溶性两种不同极性有效成分的定性鉴别和含量测定为监控指标比 较两种提取工艺。 2．1．1．1水提醇沉提取工艺 依据现行2005版《中国药典》的提取工艺条件，对板蓝根进行提取。 称取板蓝根饮片约100．09，置圆底烧瓶中，加水煎煮二次，第一次煎煮2小时，第二 次煎煮1小时，煎液滤过，将滤液合并，浓缩至相对密度为1．20(50'c)的浓缩液，再加入 乙醇使得含醇量达60％，静置使其沉淀。取上清液，回收乙醇并浓缩至50ml的浓缩液备 用。 2．1．1．2醇溶液提取工艺 称取板蓝根饮片约100．09，置于圆底烧瓶中，加入一定浓度乙醇溶液加热回流提取。 山西医辩大学硬士学位论文 然后将提取液减压浓缩至50ml浓缩液备用。 2．1．1．3不同提取法有效成分含量的比较 2．1．1．3．1对照品溶液的制备 靛玉红对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的靛玉红对照品 10．59rog，至100ml容量瓶中，用氯仿溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取2．0ml至25ml 容量瓶中，加氯仿2ml，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。 精氨酸对照品溶液制备：精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的L．精氨酸对照品 39．9ling，置于100ml容量瓶中，以O．01mol／L稀盐酸溶液溶解并稀释至刻度，精密量取 1．0ml置于10ml容量瓶中，用蒸馏永稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。 2．1．1．3．2供试品溶液的制备 靛玉红供试液：分别取两工艺条件下浓缩液各约30．0ml，分别置于100mi分液漏斗中， 精密吸取氯仿溶剂30ml、30ml、20m1分三次进行萃取，待分层后分别取氯仿层。分别合 并氯仿层，减压回收氯仿得残渣，分别用10ml氯仿分次、洗涤残渣并将氯仿溶液转移至 25ml容量瓶中，分别用甲醇稀释至刻度，待用。精密吸取上述溶液各Iml至10ml容量瓶 中用流动相；甲醇：水(80：20)(0．1％二乙胺，用醋酸调中性)稀释并刻度定容，分别得供 试品溶液I。 精氨酸供试液：分别取上述分液漏斗中的水层，减压回收溶剂水得残渣，用10ml蒸 馏水分次洗涤残渣合并蒸馏水，转移至50ml容量瓶中，分别用O．01mol／L的盐酸溶液稀释 至刻度，各精密吸取2．5ml至10ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，分别得供试品溶液II。 2．1．1．3．3色谱条件 靛玉红色谱条件：流动相：甲醇：水(80：20)(O．1％--乙胺，用醋酸调中性) 流速：1．0ml／min 检测波长：289nm 柱温：24℃ 固定相：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(5pm250×4．6ram) 精氨酸色谱条件：流动相：甲醇：水(80：20)，加入辛烷磺酸钠(C8Hj7Na03S)使其浓度 为O．005moFL、加入磷酸二氢钾(KH2P04)使其浓度为0．02mol／L，用磷酸调节至pH2．6 流速：1．0mI／min 检测波长：206rim 柱温：24℃ 固定相：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(5“in250×4．6rm) 4 山西医科大学磺士学位论文 2．1．1．4结果 将醇溶液提取工艺条件与水提醇沉提取工艺条件制剂中的有效成份靛玉红和精氨酸 的含量进行比较研究。结果见表1．1； 表1-l两种工艺对靛玉红和精氨酸含量的影响 从表1．1中可以看出：两种提取工艺中，水溶性有效成分精氨酸的含量相差较少，而 脂溶性有效成分靛玉红的含量相差较多，在传统的水提醇沉工艺中靛玉红几乎没有被提 取。因此，可以说本试验所采用的醇溶液提取工艺明显优于传统的水提醇沉工艺，它既能 保证水溶性有效成分氮基酸类化合物不丢失，又能将板蓝根中的脂溶性成分靛玉红提出。 2．1．2醇溶液提取工艺单因素试验考察 2．1．2．1醇浓度的选择 准确称取板蓝根饮片约100．og，以提取倍数12倍量的溶剂、提取时阀l小时、提取 次数3次，分别考察50％、60％、70％、800,6、90％浓度醇溶液对提取效果的影响，用HPLC 法测定提取物中有效成分靛玉红和精氨酸的含量。结果见表1．2、图1．1；表1．3、图1．2。 表1．2醇浓度对靛玉红含量的影响 由西医科大学硕士学位论文 靛玉红含量(ug／g) 从表1．2中和图1．1可以看出：靛玉红含量受醇浓度的影响，在50％，60％、70％之间 是上升的趋势，在70％、80％、90％之间下降的趋势。综合分析后，本实验选择靛玉红含 量较高的值所对应的三个浓度点(60％、70％、80％)做进一步的考察。 表1-3醇浓度对精氢酸含量的影响 精氨酸含量(mg／g) 辞浓度(％) 图1-2 从表1．3中和图1-2可以看出：精氨酸含量受醇浓度的影响，在50“／,-90％之间 是下降的趋势。综合考虑并结合靛玉红的醇溶液影响试验结果，本试验选择60％、 70％、80％---个浓度点做进一步的考察。 6 8 7 6 5 4 3 2 l O 窑魁Ⅸ*誓 言：帅 以U伯¨ ¨ {茜 图 t ∞∞ 3 2，0 0 8 7 6 5 (。夸●no口曩 山西医科大学硕士学位论文 2．1．2．2料液比的选择 以提取浓度为70％的醇溶液，提取时间为1小时，提取次数为3次，分别考察6、8、 lO、12、15倍量的醇溶液对提取效果的影响，以有效成分靛玉红和精氨酸的含量为质控指 标进行比较。结果见表1-4、图1．3。 表1．4料液比对靛玉红含量的影响 靛玉红含量(pg／g) 9 t1 13 15 料液比(倍) 围1-3 可以从表l-3中和图1．3看出靛玉红含量受到料液比的影响，在6、8、10、12倍量之 间呈上升的趋势，在12、15倍之间几乎趋于平直。故综合分析之后，本试验选择靛玉红 含量出现转折处的几个对应的液料比(10、12、15倍)来做进～步考察。 2．1．2．3提取次数的选择 以提取倍数12倍量的溶剂，提取浓度为70％的醇溶液，提取时间为1．Oh／次，分别考 察提取1次、2次、3次、4次、5次对提取效果的影响，以有效成分靛玉红和精氨酸的含 量为质控指标进行比较。结果见表1．5、图14。 8 7 6 5 4 3 2 l 0 一∞i三一扣鞠州疆 山西医科大学碗士学位论文 靛玉红含量(ug／g) 2 3 4 提取次教(次) 图l-4 从表1．5中和图1-5可以看出：靛玉红含量受到提取次数的影响，随着提取次数的增 多，提取量增加，在提取3次后靛玉红的提取量达到了90％多，所以本试验综合分析之后， 选择提取1次、2次、3次来做进一步考察。 2．1．2．4提取时间的选择 以提取倍数12倍量的溶剂，提取浓度为700／0的醇溶液，提取次数为3次，考察提取时 间分别为O．511／次、1．Oh／次、2．Oh／次、2．5bJ次、3．Oh／次对提取效果的影响，以有效成分靛玉 红和精氨酸的含量为质控指标进行比较。结果见表1-6、图l-5。 表l-6提取时间对靛玉红含量的影响 ；i i 一芒∞‘一●姐捌州鞋 山西医瓣丈学硕士学位论文 靛玉红含量(ug／g) 0 0．5 1 1．5 2 2．5 3 靛玉红音量(pg／g) 图l·5 从表1-6中和图1-6中可以看出；靛玉红含量受到提取时间的影响，在O．5h／次、1．Oh／ 次、2．Oh／次之问呈上升的趋势，在2．Oh／次、2．5h／次、3．Oh／次之间几乎趋于平直。故综合分 析之后，本试验选择提取时间O．5h／次、1．Oh／次、2．Oh／次来做进一步考察。 2．2最佳提取工艺条件的考察 根据单因素试验结果，在醇溶液提取工艺中影响靛玉红、精氨酸含量提取效果的因素 主要有：醇溶液浓度(％)、液料比(倍)、提取时间(h)和提取次数(次)，因此本试验选用L《34) 正交试验设计表，对四个影响因素进行综合考察，以干膏得率、靛玉红和精氨酸的含量为 指标以得到醇溶液提取的最佳工艺条件。每份称取板蓝根饮片lOOg，按照表1．8设计内容 进行操作。 表1．7因素水平表 9 7 6 5 4 3 2 1 O 一蛞／Ⅵ一匡茁苷取 山西医辩太学磺士学位论文 表1-8L“34)正交实验方案与结果表 10 山西医科大学硬士学位论文 注：n=o．05+显著性 2．2．1结论 从表1-9中可看出：干膏得率受提取次数的影响最显著，其它因素不显著：从表1．10 中可看出：靛玉红的含量受醇溶液的浓度和提取次数的影响最显著，其它两个因素不显著； 从表1一11中可看出：精氨酸的含量受提取次数的影响最显著，其它因素不显著。综合考虑 以上方差分析的结果并结合实际的生产要求，本试验确定醇溶液提取的工艺条件为： B3D3C2A2，即提取次数为3次、乙醇浓度为70％、乙醇溶液用料为药材比的12倍量、提 出西医科大学硪士学位论文 取时间为l小时。 2．2．2工艺稳定性考察 确定提取工艺后，分别制的板蓝根提取液3份，精密量取3份提取液各30ml，依照 2．1．2．2项方法处理，按2．1．2．3项方法测定并计算其含量，结果见下表1．12。 表1．12样品含量测定结果 由上表可知，此工艺条件下得到的板蓝根提取物中脂溶性靛玉红成分的含量平均为： 4．98ug；水溶性精氨酸成分的含量平均为：9．86mg。RSD分别为1．56％和1．91％，了 提取工艺的稳定性。 2．3板蓝根颗粒的制备： ’ 参照2005年版药典一部板蓝根颗粒的制备方法：取板蓝根饮片14009，加70％的乙醇 提取3次，每次1小时，每次加70％的乙醇16800ml，提取液滤过，合并滤液，浓缩至相 对密度为1．20(5012)，加入适量糊精，制成颗粒，干燥，制成6009。 3讨论 ． 1．本课题分别考察了不同醇浓度溶剂、不同的乙醇溶液与原料比等对板蓝根提取效果 的影响。有文献报道板蓝根经冷浸过程，得到的靛玉红和精氨酸有了显著的提高，它能缩 短乙醇回流提取时间，减少了由于长时间加热下靛玉红、靛蓝等有效成分结构的变化，提 高了溶剂的提取效率。此外比较水提醇沉工艺与醇溶液工艺的结果，明显的醇溶液工艺比 水提醇沉工艺有显著性优势，故本课题最终确定的最佳提取工艺，即溶剂为700乙醇、料 液比1：12、提取时间l小对／次、提取3次。 2．现代化的提取方法很多，如酶技术、超临界流体萃取等技术。有文献表明，酶技术 已应用于中药有效成分的提取和分离当中，具有较高的效率，但该技术对实验条件的要求 较高，工业应用不广泛。超临界流体萃取技术也已用于提取有效成份的工艺研究，但超ll缶 界流体萃取设备投资大，生产成本高，并不是适合所有的有效成分的提取。 3．有文献报道，甲醇与乙醇的提取效果相近，而甲醇毒性较大，不宜于大工业生产应 用，故本课题未将甲醇作为提取溶剂之一进行考察。 12 山西医科大学硕士学位论文 第二章 板蓝根$qN质量标准研究 板蓝根是一种具有清热解毒的中药材，临床上广泛用于流感、腮腺炎、乙脑，肝炎等 多种疾病的治疗。其制剂板蓝根颗粒一直被《中国药典》所收载，但其质量标准中只有制 剂的水溶液与茚三酮的显色反应，既无专属性强的定性鉴别方法，也无准确的含量测定方 法，无法对板蓝根制剂的质量实行有效的监控，无法确保板蓝根制剂的安全、有效、可控。 本试验依据板蓝根的化学成分，应用薄层色谱法鉴别其脂溶性有效成分靛玉红和水溶性有 效成分精氨酸，同时应用高效、精确的HPLC法技术对板蓝根的有效成分靛玉红和精氨酸 进行含量测定，达到了对板蓝根制剂定性、定量质控的目的。 1材料及仪器 1．1板蓝根药材 从山西省中药材公司购买(产地：河北安国，批号：050312、051018、060103)符合 中国药典规定的板蓝根饮片要求。 1．2主要仪器与试剂 岛津LC．10ATvp液相仪、SPD．10Avp检测器、RPL—C2000柱温箱 RE．52AA旋转蒸发仪、可调式MH5000型电热套 龟子天平FA／JA型，上海精密科学仪器有限公司 靛玉红对照品(批号：110717、200204)购自中国药品生物制品检定所 精氨酸对照品(批号：200508) 乙醇(浓度：95％购自北京市化学试剂厂) 硅胶G(青岛海洋化工厂) 其它所用试剂均为分析纯 2质量标准研究 2．1性状 根据颗粒样品描述，本品为棕褐色，味微苦(无蔗糖)。 2．2鉴别 2．2．1氨基酸的鉴别 L．精氨酸对照品(购自中国药品生物制品检定所批号：200508)； 自制板蓝根颗粒剂； 广州白云山生产的板蓝根颗粒剂批号：A7A018： 薄层层析硅胶G(ee国海洋化工集团公司)； 茚三酮试液；正丁醇、冰醋酸均为分析纯。 2．2．1．1供试品溶液的制备 山西医科大学硕士学位论文 取自制醇提工艺板蓝根制剂59，研细，称取29，置具塞锥形瓶中，加入蒸馏水50ml， 浸泡20分钟后，加入0．59活性炭，超声30min后，滤过，滤液减压浓缩至5ml作为供试 品溶液。取广州白云山板蓝根制剂59，取自制的水提醇沉工艺板蓝根制剂59，同法制备 成供试品溶液。 2-2．1．2对照品溶液的制备 取王广精氨酸对照品加60％Z。醇制成每lml含O．1mg的溶液，作为对照品溶液。 2．2．1．4鉴别实验 照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB试验)，吸取上述四种溶液各5pl，分 别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇一冰醋酸一水(19：5：5)为展开剂，展开，取出，晾干。 喷以茚三酮试液，置105"0烘数分钟至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相 应的位置上显相同颜色斑点，见附图2．1。 2．2．2靛玉红鉴别 靛玉红对照品(中国药品生物制品检定所批号：200204)； 正己烷、二氯甲烷、丙酮均为分析纯。 2．2．2．1供试品溶液的制备 取自制醇提工艺板蓝根制剂59，用25ml蒸馏水溶解，转移至分液漏斗中，然后分三 次加入氯仿30ml、30ml、20ml萃取，合并三次氯仿萃取液置水浴上浓缩至2．0ml作为供试 品溶液。取广州白云山板蓝根制剂59，取自制的水提醇沉工艺板蓝根制剂59，同法制备 成供试品溶液。 2．2．2．2对照品溶液的制备 取靛玉红对照品加氯仿溶液使成每lml含靛玉红O．05mg的溶液，作为对照品溶液。 2．2．2．3鉴别试验 照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录ⅥB试验)，吸取上述四种溶液各10ul， 分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷一二氯甲烷--N酮(5：4：1)为展开剂，展开，取出， 晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点。见附图2-2。 2．3含量测定 板蓝根颗粒由板蓝根一味药材经加工制成，故本实验以板蓝根中有效成分靛玉红、精 氨酸作为含量检测的指标，分别采用HPLC法对其含量进行了测定。实验表明，该方法简 便，易操作，专属性强，经各项方法学考察，结果满意。色谱图中靛玉红和精氨酸的保留 时间与各自的对照品一致结果见附图2—7、2．8、2-9、2-10。 2．3．1精氨酸的含量 2．3．1．1色谱条件 山西医辩太学硕士学位论文 流动相：甲醇：水(80：20)，加入辛烷磺酸钠(csnl7Na03S)使其浓度为O．005moFL、加 入磷酸二氢钾(K／-／2P04)使其浓度为0．02mol／L，用磷酸调节至pH2．6 流速：1．0ml／min 检测波长：206rim 柱温：24℃ 固定相：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(5Ilm250×4．6嘞)。 2．3．1．2对照品溶液的制备 精密称取干燥后的L一精氨酸对照品39．91mg置于100ml容量瓶中，以O．01mol／L稀盐 酸溶液溶解并稀释至刻度，精密量取1．0ral，置10ml容量瓶中用蒸馏水稀释至刻度，摇匀， 即得对照品溶液。 2．3．1．3供试品溶液的制备 取本品509，研细，取约239，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入蒸馏水50ml溶解， 浸泡20分钟加入O．59活性炭，超声30分钟，滤过，滤液浓缩至约10ml，转移至10ral容 量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，O．45pm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶 液。 2．3．1．4检测波长的确定 取精氨酸对照品溶液，在200nm--400nm波长范围内进行扫描，结果如图所示出现在 206nm处有最大吸收波长，故选择206nm为检测波长。如图显示标记的吸收值最大。见附 图2-3： 2．3．1．5线性关系的考察 分别精密吸取上述对照品溶液O．5、1．0、1．5、2．0、3．0ml至20ml容量瓶中，加入O．01moFL 盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为9．975Ilg／ml、19．950ug／ml、29．932ug／ml、 39．9101．1g／ml、59．8651．tg／ml的对照品溶液，20pl定量环满刻度迸样，依上述色谱条件， 记录色谱图，以精氨酸对照品进样量(1lg／m1)为横坐标(C)，峰面积为纵坐标(A)绘制标准曲 线，其回归方程为：A=3．062+5．737X100C(r=o．99997)。结果表明，精氨酸在浓度9．975u g／ml一59．865ug／ml范围内，具有良好的线性关系。结果见表2一l。 表2-1精氨酸标准曲线 2．3．1．6精密度实验 精密量取对照品溶液1．Sml，至20ml容量瓶中，用O．01mol／L的盐酸溶液稀释至刻度， 按照上述条件进样20pl，重复进样6次，按照峰面积计算，结果RSD=0．690,6，表明精密 山西医科大学硕士学位论文 度良好，结果见表2-2 表2-2精氨酸对照品精密度实验结果 2．3．1．7稳定性实验 称取本品约23．09(六份)，按供试品溶液制备方法制备，依照正文含量测定项下操作， 20ul定量环满刻度进样，依次间隔oh、2h、4h、8h、12h、24h进样。结果为RSD=I．3％， 表明对照品溶液在室温放置24小时内稳定。结果见表2-3 表2．3精氨酸稳定性实验结果 2．3．1．8重复性实验 称取本品六份，按供试品溶液制备方法制备，依照正文含量测定项下操作，20ul定 量环满刻度进样，每个样品进样2次，RSD=0．43％，表明重现性良好，结果见表2-4 表2．4精氨酸含量的重复性实验结果 奎茧里!g! 宣量!婴啦! 墨；旦!墅1 11．512 14．91 0．43 2．3．1．9加样回收率实验 称取己知精氨酸含量的板蓝根制剂适量(六份)，按供试品溶液的制备方法制备，分别 加入相当量的精氨酸对照品，按前含量测定方法项下操作，201al定量环满刻度进样，结 果为平均加样回收率--99．45％，RSD--0．93％，结果见表2．5 16 " 引 ” 宕宕 ∞ 4 4 4 4 4 姒 研 啪 蚴 啪 l 1 1 5 5 山西医科大学硕士学位论文 表2-5精氨酸的加样回收率测定结果 2．3．1．10样品测定 称取3份自制的板蓝根颗粒剂，研细，取约23．og，按照供试品溶液制备方法制备， 每个样品20pl定量环满刻度迸样两次，色谱条件同前，求精氨酸含量平均值，结果见表 2—6 表2-63份样品中精氨酸含量的测定结果 2．3．2靛玉红的含量 2．3．2．1色谱条件 流动相：甲醇：水(80：20)(O．1％二乙胺，用醋酸调中性) 流速：1．Oml／min 检测波长：289nm 柱温：“℃ 固定相：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂5piii250×4．6嘞 2．3．2．2对照品溶液的制备 精密称取经五氧qa-磷干燥至恒重的靛玉红对照品10．58rag，至lOOml容量瓶中，用 氯仿溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取2．Oml至25m!容量瓶中，加氯仿2ml，再加甲醇 稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。 山西医科大学硕士学位论文 213．2．4供试品溶液的制备 取本品509，研细，取约239，精密称定，用60ml蒸馏水溶解，转移至分液漏斗中， 然后分三次加入氯仿试剂50ml、50ml、30ml萃取，合并三次氯仿萃取液，减压浓缩至干， 用适量甲醇：氯仿(85：15)洗涤残渣，并转移、定容至10ml容量瓶中，摇匀，O．45lam微 孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。 2．3．2．5检测波长的确定 取靛玉红对照品溶液，在200nm---400nm波长范围内进行扫描，结果如图2．5所示：在 289nm处有最大吸收，故选择289nm为检测波长。如图2．5显示标号为4的吸收值也大， 但是考虑其位于波长的边缘值，为避免末端吸收的于扰，故而排除4号位的波长，选择 289nm为最大吸收波长。见图2．5。 2．3．2．6线性关系的考察 精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的靛玉红9．98rag，至100ml容量瓶中，用30ml氯 仿溶解并加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml至25ml容量瓶中，加入甲醇稀释至刻 度，摇匀，分别精密量取0．5、1．O、2．0、4．0、8．0ml置10ml容量瓶中，加入甲醇：水(85：15) 的溶液稀释至刻度，摇匀，即得分别为0．980pg／ml、1．994ug／ml、3．996llg／ml、7．987u g／ml、15．768llg／ml的对照品溶液，20|ll满刻度进样，记录色谱图，以靛玉红对照品进样 量(ug／m1)为横坐标(C)，峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线，其回归方程为： A=-I．236706X104+59712．05C(r=0．99997)，表明靛玉红在O．980～15．768ug／ml范围内线性关 系良好。结果见表2-7。 表2．7靛玉红标准曲线 2．3．2．7精密度实验 取靛玉红浓度(1．994pg／m1)对照品溶液，重复进样6次，结果见表2-8。 表2-8靛玉红精密度实验结果 从结果可见，说明靛玉红峰面积的RSD小于3％，说明精密度良好 23．2．8稳定性实验 称取本品约23．09(六份)，按供试品溶液制备方法制备，依照正文含量测定项下操作 13 山西医科大学硕士学位论文 20pl定量环满刻度进样，依次间隔oh、2h、4h、8h、12h、24h迸样。结果RSD=0．86％， 表明对照品溶液在室温放置24小时内稳定。结果见表2-9。 表2-9样品的稳定性实验结果 2．3．2．9重复性实验 称取本品六份，按供试品溶液制备方法制备，依照正文含量测定项下操作，20¨l定 量环满刻度进样。RSD=I．34％，表明重现性良好，结果见表2．10。 表2．10靛玉红重复性实验结果 2．3．2．10加样回收率实验 称取己知靛玉红含量板蓝根药制剂适量(六份)，按供试品溶液的制备方法制备，分别加入 相当量的颠玉红对照品，按前含量测定方法项下操作，20ul定量环满刻度进样，平均回 收率--98．54％，RSD--0．67％，回收率在95*／'o---105％之间RSD小于5％，表明方法准确度良 好，结果见表2．11。 表2．11靛玉红的加样回收率测定结果 19 山西医科大学硬士学位论文 213．2．1l样品测定 称取3批自制板蓝根颗粒，按照供试品溶液制备方法制备，每个样品20pl定量环满 刻度迸样两次、记录，并求平均值。根据对三份样品的测定结果得出本颗粒剂中含靛玉红 为7．12ug／g。结果见表2一12。 表2．123份样品中靛玉红的含量测定结果 3讨论 3．1选择甲醇、丙酮、氯仿和甲醇：水(80：20)作为样品的溶剂，以甲醇：水(80：20)为流 动相，结果表明用氯仿为样品的溶剂系统，靛玉红的峰和其他所有峰均被严重干扰，难以 较好的大道分离的效果，为此该考察其他几种试剂为样品的溶剂系统，其峰型正常，但甲 醇对靛玉红的溶解性小，丙酮相当易于挥发，这些将会造成极大的误差。故而经综合考虑 采用甲醇：水(80：20)作为样品的溶剂系统。结果经实验证明取得了良好的分离度。(再次 申明现国家相关文件出台已经终止对氯仿的使用，只是出于实验的要求，仔细使用操作， 不能做外新药审批的溶剂系统) 3．2因为脂溶性的靛玉红具有相当的升华性，不宜采用加热烘干来干燥药材，故此采用五 氧化二磷干燥，可尽量避免靛玉红的升华造成不必要的误差。而且靛玉红在甲醇溶剂中只 是微溶，在氯仿中溶解性很强，但是以氯仿作溶剂会严重地影响靛玉红的峰形，用少量二 氯甲烷先溶解靛玉红然后再加入甲醇溶剂稀释，这样既保证了样品的一定浓度线性范围， 又保证了具有良好的峰形。对照品与药材的谱图如图，对照品和药材中靛玉红的保留时间 基本一致，药材中靛玉红峰与之前的杂质峰达到了基线分离，符合定量分析要求。通过采 用高效液相的方法，对板蓝根药材中靛玉红含量的实验，其精密度、重现性、稳定性和加 样回收率进行了考察，都得到了良好的结果。得出了此方法对于板蓝根中靛玉红的提取达 到了可以提纯的效果。 3．3取供试品溶液进样，分别选用不同比例的甲醇和水作为流动相，流速为1．0ml／min，检 测波长289nm。通过实验考察，结果表明当甲醇：水(80：20)时，主峰附近杂质的杂志峰 较少，能达到基线分离，但主峰靛玉红的主峰不是很理想的锐锋；在此基础上加入二乙胺 使浓度达到O．1％，并用醋酸调节至中性，结果主峰达到理想的峰型效果。故选择用甲醇： 水(80：20)(0．1％二乙胺，用醋酸调至中性)作为流动相。 3．4高含量的精氨酸作为板蓝根的一个重要特征精氨酸的含量水平也能反映板蓝根药材或 者制剂的质量。但是由于氨基酸的结果特性导致精氨酸不能采用直接HPLC分析来测定， 结构的特性导致对紫外光的敏感性很差，通过紫外扫描得出的结果，直接采用HPLC法将 山西医科大学硕士学位论文 会产生极大的末端吸收，相关资料报道，目前精氨酸的测定，一般均采用柱前衍生化的方 法或者柱后衍生化法、或者氨基酸直接分析仪。氨基酸的柱前衍生化方法很多，结合板蓝 根制剂工艺的特点，以2，4．二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生化的方法适合板蓝根中氨基酸的分 析，分析方法简单、衍生完全，但出于一些客观原因，这些都未能达到条件。因此，本实 验采用HPLC直接法、选定特殊色谱条件初步建立板蓝根精氨酸的含量测定方法。为板蓝 根系列制剂的质量控制提供了一个可靠的定量方法。 山西医科大学硕士学位论文 第三章 结论 1．本实验考察了传统水提醇沉工艺和醇溶液提取工艺，结果显示醇溶液提取工艺较 水提醇沉工艺在有效成分的含量上有着明显的优势，而且传统水提醇沉工艺操作烦琐，生 产成本较高。据此对醇溶液提取工艺进行了系统的研究，考察了醇溶液提取工艺的主要影 响因素：醇溶液浓度、料液比、提取时间、提取次数。建立L9(34)正交实验设计，依据提 取液中有效成分的含量来选取最佳提取工艺，最终确立最佳的工艺条件为：70％乙醇溶液、 料液比1：12、提取时间l小时、提取次数3次。结果显示，新工艺条件下脂溶性有效成分 含量明显增加，水溶性有效成分维持原有水平。本工艺成熟、可靠、可操作性强、适合于 大工业的生产。 2．本实验对新工艺颗粒制剂的质量标准进行了系统的研究，建立了板蓝根中水溶性 有效成分精氨酸和脂溶性有效成分靛玉红的鉴别方法和含量测定方法。 定性方面：精氨酸层析条件：以正丁醇一冰醋酸一水(19：5：5)为展开剂，展开，取出， 晾干。喷以茚三酮试液，置105"(2烘数分钟至斑点显色清晰。在精氨酸对照品相应位置上 有相同颜色斑点；靛玉红层析条件：以正己烷一二氯甲烷一丙酮(5：4：1)为展开剂，展开， 取出，晾干。结果显示，自制板蓝根颗粒，在与靛玉红对照品相应的位置上显相同颜色的 斑点，而传统水提醇沉工艺的颗粒没有任何痕迹。 定量方面：精氨酸色谱条件，流动相：甲醇：水(80：20)，加入辛烷磺酸钠(C8H17Na03S) 使其浓度为0．005mol／L、加入磷酸二氢钾(KH2P04)使其浓度为O．02mol／L，用磷酸调节至 pH2．6，经有机滤膜过滤，超声脱气30分钟；流速：1．0ml／min、检测波长：206ran，柱温： 24℃，固定相：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂5um250×4．6mm。根据对三份样品的测 定结果得出本颗粒剂中含精氨酸为9．79mg／g；靛玉红色谱条件，流动相：甲醇：水(80：20) (O．I％一--乙胺，用醋酸调中性)，经有机滤膜过滤，超声脱气30分钟；流速：1．0ml／min、 检测波长：289nm、柱温：24。C、固定相：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂5pm250X4．6mm。 根据对三份样品的测定结果得出本颗粒剂中含靛玉红为7．12|lg／g。 山西医科大学磺士学位论文 附录 1 2 3 4 图2一l精氨酸薄层色谱图 左起1精氨酸对照品 2醇提取物制剂、3广州白云山板蓝根颗粒 4自制传统工艺制剂 l 2 3 4 图2-2靛玉红薄层色谱图 左起l靛玉红对照品、 2醇提取物制剂、3广州白云山板蓝根制剂 4自制传统工艺制剂 山西医科大学硕士学位论文 1’20E+06 1．OOE+06 8．OOE+05 g 喧6．OOE+05 掌 4．OOE+05 2．OOE+05 0．OOE+00 图2-3精氨酸紫外扫描图谱 标准曲线 l±堕堑壁宣兰】 0 10 20 30 40 50 60 70 浓度(ug／．1) 图2-4精氨酸标准曲线图 山西医科大学硕士学位论文 1．OOE+06 8．OOE+05 繇6．OOE+05 旧 掌4．OOE+05 2．OOE+05 0．OOE+00 图2-5靛玉红紫外扫描图谱 标准曲线 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 浓度(pg／g) 图2"6靛玉红标准曲线图 山西医科大学硕士学位论文 。’¨¨¨¨””””””””””删。4蕊嚣打34引1蕾扎“8”删洲41啦”“”“”引㈣ 图2．7精氨酸对照品HPLC图 0123¨¨¨””””””””””舢锄蕊：彻舢”蛐"M¨引Ⅶ州剁删删 图2-8精氨酸醇提取物样品HPLC图 山西医科大学硕士学位论文 ¨2¨¨7¨”””们¨51¨””引他。蕊：”4鲫”枷蛐"8籼”。n“删盯蚺删 图2-9靛玉红对照品HPLC图 图2一10靛玉红醇提取物HPLC图 thai医科大学硕士学位论文 参考文献 【1】孙立新．1冲-HPLC法测定板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红的含量．沈阳药科大学学报， 2000，17(3)：191-193 【2】杨军．反相高效液相色谱法测定板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红的含量．中药新药与 临床药理，1996，7(21：43．44 【3】陈发奎主编．常用中药有效成分含量测定．北京：人民卫生出版社，1997，12(1)：378 【4】梁文法．薄层扫描法测定菘蓝根和叶中靛玉红与靛蓝的含量．中草药，1990，21(4)： 11-12 【5】 刘云海，秦国伟等．板蓝根化学成分的研究(I～v)．中草药ChineseTraditionaland HerbalDrugs2002年第33卷第2期 【6】崔卓，王颖等．板蓝根有效成分质量研究．辽宁中医药杂志LIAONINGJOURNALOF TRADITIONALCHINESEMEDICIN第31卷，第8期 【7】余建青，黄玲等．板蓝根颗粒提取工艺的改进．华西药学杂志，1999，14(5．6)J381．382 【8】陈玉生，许东明等．板蓝根制剂提取工艺的探讨【J】．中国中药杂志，1999，15(7)：30．32 【9】董小平．大青叶、板蓝根中靛玉红的含量测定明．南京中医药大学学报，1995，11(2)： 10l-102 【10】李国强．产蓝属植物的研究【A】。见：中国药科大学博士学位论文[C]2001．1。 【11】马心舫．板蓝根注射液的含量测定．中成药研究，1996，10(3)：37．38 【12】李影等．板蓝根颗粒生产过程中靛玉红的含量变化及工艺改进设想【J】．中成药，1990， 12(9)：8-9 【13】卢日刚．板蓝根颗粒质控方法初探【J】．中药通报，1996，11(7)：33．34 【14】许桢灿等．板蓝根中靛玉红与靛蓝含量分析．中成药研究，1987，(2)：8-9 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