(中山毒理课件)微核试验和染色体畸变

null小鼠骨髓细胞微核试验小鼠骨髓细胞微核试验受试物: 环磷酰胺 受试动物: 小鼠null实验目的 学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞(PCE)微核测定方法null 细胞分裂分为四个期： 1、G1期（DNA合成前期）：细胞生长，为DNA复制做 准备。 2、S期（DNA合成期）：体细胞的DNA含量由2C增加到4C 3、G2期(DNA合成后期)：该期主要为M期作准备，包括复制因子的失活和有丝分裂促进因子的分化,有关细胞骨架系统重新组装的蛋白质合成 4、M期(有丝分裂期)：前期，早中期，中期， 后期（微核形成期），末期 null图13-1 细胞周期可划分为四个阶段null 微核（micronucleus） 是染色体或染色单体的无着丝点片断或纺锤体受损而丢失的整个染色体，于细胞分裂后期留在细胞质中，末期后，单独形成几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，比主核小，故叫微核。null 原理： 1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点 的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中 2 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动，从而遗留在细胞质中 null 结论： 微核试验能检测化学或其他物质因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点 null 微核可出现于多种细胞中，但在有核细胞中难以与正常核的分叶及核突出物区分，故常计数PCE细胞中的微核，因为成红细胞发展为红细胞时，主核排出，成为PCE，这些细胞保持其嗜碱性约24小时，然后成为正染红细胞（NCE）,并进入外周血。 注：在主核排除时，微核仍保留在细胞中null 操作步骤： 一　染毒： 染毒途径：腹腔注射环磷酰胺，染毒二次， 　　　　　0、24小时各染毒一次，6h后取样 染毒剂量：50mg/kg 二　处死： 　　颈椎脱臼法处死小鼠 　　　　null 三：骨髓液的制备和涂片 　1 处理：方法：取胸骨，去掉血污和肌肉，剪去每节骨骺，用弯止血钳将骨髓挤于预先滴有小牛血清的清洁载玻片上，混合均匀后推片 2 固定：将推好凉干的骨髓片放进染色缸，甲醇固定15分钟，取出晾干 3 染色：用新鲜配制的Giemsa应用液（Giemsa储备液一份加pH6.8的磷酸盐缓冲液9份）染色10－15分钟，细流水冲掉玻片染色液，晾干null 四　观察和计数： 　１ 观察：先用低倍镜观察，选择分布均匀的域，再在油镜下观察计数。PCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞（NCE）桔黄色。细胞中的微核大半呈圆形，边缘光滑，嗜色性与核质一致，一个细胞内可以出现一个或多个微核。 　２ 计数：1000个PCE中含微核的PCE数，并计算200个细胞中PCE/NCE的比值null结果与： 1 结果：试验只计数PCE中的微核，微核率以千分率表示。每组的雌雄动物分开计数微核PCE均值。 2 分析：正常的PCE/NCE比值为1（0.6-1.2），如果＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制；如果＜0.05，则表示受试物剂量过大，结果不可靠。null 图 1 ：正常嗜多染红细胞 PCE （× 400 ） 图 2 带微核嗜多染红细胞 MNPCE （× 400）null 注意事项： 1、剪胸骨时通过剪断两边的肋骨来把整块胸骨取下来，以防不小心把胸骨剪断 2、挤出骨髓处的肌肉要剔除干净 3、滴到玻片上的小牛血清不要太多，涂时要涂匀，以便推片 4、染色前可以先看一下整体涂片情况，细胞分散度是否良好 5、关键步骤是制作良好的骨髓涂片以及优良的染色图流程图 处死小鼠，取胸骨 推片 固定 染色 观察并记数 动物骨髓细胞染色体畸变分析动物骨髓细胞染色体畸变分析null目的和意义: 1、学习动物骨髓细胞染色体标本的制作 2、了解动物体内染毒及染色体畸变类型 null 染色体畸变： 指染色体的结构改变，它是指遗传物质大的改变，一般可用光学显微镜检查适当细胞有丝分裂中期的染色体来发现 染色体畸变分析： 指观察染色体形态结构和数目改变，又称为细胞遗传学实验null 实验原理: 1 染色体畸变只能在细胞分裂的中期进行观察和分析，为收集足够的中期相细胞，在收获细胞前，用秋水仙碱处理，以阻断微管蛋白的聚合，抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使分裂间期和前期的细胞停留在中期相。 2 细胞通过低渗，使染色体均匀散开，然后固定、染色，可在油镜下观察操作步骤操作步骤一、收获细胞 1 秋水仙碱处理实验动物（小鼠4mg/kg 处死动物前6h腹腔注射） 2 取股骨 3 PBS液5ml冲洗骨髓，1500r/min离心10min， 去上清 二、低渗 1 打散沉淀物，加入37 ℃预温的0.075mol/L的 KCl 6ml混匀，于37℃低渗15－20min 2 再加固定液1－2ml混匀，立即于1000r/min离心10min，去上清null 三、固定 1 使细胞悬浮，加入固定液4ml混匀，放置室温10－20min，然后1000r/min离心10min，去上清 2 同样方法再固定一次，去上清，留0.5ml 四、制片染色 使细胞悬浮，将细胞悬液滴于冰冻的载玻片上，干燥，用10％Giemsa染液染色10－20min，取出清洗自然干 五、阅片 先在底倍镜下选择分散良好、细胞未破裂的中期分裂相，油镜下观察并染色体结构异常和数目异常细胞结果分析与评价结果分析与评价结果： 以每只动物为观察单位，每只动物观察100个中期分裂相，计算其畸变细胞率 分析与评价： 1 阴性和阳性对照组的畸变率应与所用动物的种属及有关资料相符 2 试验结果可以用多种统计方法处理，所得结果应该是相同的 3 各实验组即便细胞率与阴性对照组相比较，应该有显著性差异，还应有剂量反应关系null图 1：正常精母细胞（× 1000 ） 图 2 ：精母细胞染色体环（× 1000 图 3 ：精母细胞链状四价体（× 1000 ） 图 4 ：精母细胞染色体数目减少（× 1000 ） null 注意事项： 低渗是本实验的关键，控制好低渗时间，做出分散良好的染色体标本，关系到实验结果的准确性流程图流程图处死小鼠，取股骨 取骨髓，离心 低渗、固定、再离心 固定两次 染色 阅片