肉毒杆菌及肉毒毒素研究进展_赵思俊

专 论 综 述 36 2013年 8月 4日，国家质量监督检验检疫总 局通报了我国 4家进口新西兰恒天然公司受“肉毒 杆菌”污染乳制品的企业名单，食品安全，尤其是 婴幼儿食品安全再一次引起人们高度关注。肉毒杆 菌作为一种致命病菌，能引起肉毒中毒症，引起全 社会的高度关注。现就肉毒杆菌及肉毒毒素的研究 进展进行综述，以期为加强食品安全监管提供技术 支持。 1 肉毒杆菌 肉毒杆菌（Bacillus botulinus），又称肉毒梭 状芽胞杆菌（Clostridium botulinum），是一种革 兰氏阳性厌氧芽孢菌，广泛分布于自然界中，其芽 胞在江河湖海的淤泥沉积物、尘土和动物的粪便中 都有存在，水和土壤中的芽胞，是造成食物污染的 主要来源。厌氧环境中，该菌分泌强烈的肉毒毒素， 能引起特殊的神经中毒症状，对人类和动物的致死 率很高，是毒性最强的蛋白质之一。因此，这种毒 素还可用于制造生化武器。 肉毒毒素（Botulinum neurotoxin，BoNT）最早是 由 E.van Ermengen在 1897年调查比利时 Ellezelles 暴发的一次食源性传染性时发现 [1]，随后，在世界 各地都陆续报道过肉毒毒素中毒事件 [2-4]。由于它具 有厌氧生长、低温生长产毒的特点，使其在日益普 及的真空包装、冷冻食品及罐装食品中具有生长优 势，从而成为这类食品中毒的主要原因之一。 2 肉毒毒素——具有生物学意义的菌体产物 肉毒杆菌的致病性在于所产生的神经毒素— —肉毒毒素，这些毒素能引起人和动物的肉毒中毒。 根据肉毒毒素的抗原性，肉毒杆菌至今已有 A、B、 C（Cα 和 Cβ）、D、E、F、G等 7个型，各型的 肉毒杆菌分别产生相应型的毒素。其中，A、B、E、 F型可引起人群中毒，C、D型毒素主要是畜、禽 肉毒杆菌及肉毒毒素研究进展 赵思俊 1，李雪莲 2，曹旭敏 1，王 娟 1，王玉东 1，王君玮 1，曲志娜 1 （1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.青岛易邦生物有限公司，山 东青岛 266032） 摘 要：肉毒杆菌是一种致命病菌，能引起肉毒中毒症。肉毒杆菌作为影响 食品安全的一个重要风险因素，尤其是在 新西兰恒天然公司部分产品受到肉毒杆菌污染事件发生后，肉毒杆菌及肉毒毒素受到了普遍关注。现就肉毒杆菌及肉毒毒 素的生物学特性、中毒机制、诊断及治疗研究进展进行综述。 关键词：肉毒杆菌；肉毒毒素；综述 中图分类号：R996.1 文献标识码：B 文章编号：1005-944X（2013）08-0036-04 Progress in Research on Bacillus botulinus and Botulinum Toxins Zhao Sijun1， Li Xuelian2， Cao Xumin1， Wang Juan1， Wang Yudong1， Wang Junwei1， Qu Zhina1 （1.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao ，Shandong，266032. 2.Qingdao Yeboi Bioengineering Co. Ltd，Qingdao， Shandong，266032） Abstract： Bacillus botulinus is a deadly bacteria，can cause botulism disease by botulinum toxin which is amon g the most powerful known poisons. As an important risk factor for food safety，especially the in- cident of the product for Fonterra by botulinum toxin co ntamination was occured，Bacillus botulinus and botulinum toxin has been widespread concerned. The paper reviews the progress of biological characteris- tics，toxic mechanism，diagnosis and treatme nt for Bacillus botulinus and botulinum toxin. Key words： Bacillus botulinus；botulinum toxin；review 37 专 论 综 述2013年第30卷第8期 肉毒中毒的病原，对人不致病。G型肉毒杆菌极少 分离，未见 G型菌引起人群中毒报道。我国肉毒 杆菌食物中毒大多是由 A型引起的，其他型相对 较少。 肉毒杆菌属于中温菌，生长最适温度 25~37℃，产毒最适温度 20~35℃，最适 pH为 6~8.2，当 pH低于 4.5和超过 9时，温度低于 15℃ 或超过 55℃时，肉毒杆菌不能繁殖和形成毒素。 另外，食盐能抑制该菌的生长和毒素的产生，但是 不能破坏已形成的毒素。提高食品中酸度也能抑制 该菌的生长和毒素的产生。 肉毒毒素是目前已知的化学毒物与生物毒 素中毒性最强烈的一种，其小鼠 LD50为 0.00625 ng，少至 0.1~1.0 μg的肉毒毒素就可导致人中毒死 亡。肉毒毒素是一种大分子蛋白质，A、B、E、F 各型毒素均含有两种蛋白质成分：神经毒素和无毒 性的红细胞凝集素。结构研究明：肉毒毒素由轻 链（L链，氨基端，50 KDa）与重链（H链，羧基 端，100 KDa）通过一个二硫键连接 [5]。其中重链 与肉毒毒素的受体特异结合有关，其羧基端分子量 约 50 KDa的片段（Hc）是肉毒毒素的受体结合区 （RBD），存在受体结合位点 [6]，但是对受体结合 区哪些片段在与受体的相互作用中发挥关键作用还 缺乏足够了解，研究还发现 Hc片段是肉毒毒素的 主要保护性抗原，含有中和性 B细胞表位 [7]。 肉毒毒素对消化酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶）、 酸和低温很稳定，对碱和热敏感，易于被破坏失去 毒性。在正常胃液中 24 h尚不能将毒素破坏。故 吃了含有毒素的食品，毒素可以被胃肠道吸收。各 种肉毒毒素的致病性虽相同，但一种毒素只能被其 产生的抗毒素所中和，无交叉免疫，这在抗毒素血 清治疗上有重要意义。 3 肉毒毒素的致病机制 肉毒毒素的作用包括结合、定位和麻痹 3个 阶段 [8]。一旦毒素与神经细胞受体或具有内吞作用 的间接受体结合后，抗体就不能中和毒素。接着内 涵体的酸性发生变化，启动毒素转运区域构象发生 变化，同时囊泡腔在囊泡膜质子泵 ATP酶作用下 酸化，暴露出一个疏水区域，在膜上产生一个离子 通道，L链通过此通道进入胞液。在胞内，毒素分 解三种蛋白释放Ach，导致肌 肉松弛或痉挛麻痹 [9]。 轻链和重链的 N端结构由 1个保守的二硫键 连接，在二硫键存在的状态下，毒素重链 HN结构 域形成一条环形结构，将深陷于轻链表面裂缝中的 锌离子催化部位遮蔽，从而不表现酶活性 [10]。在 双链毒素进入神经细胞后，二硫键被还原，释放出 的轻链才能表现出酶活性，催化部位能够容纳底物 16个氨基酸残基。与催化部位的锌离子形成配位 键的除了 2个组氨酸残基的咪唑环、1个结合于保 守谷氨酸的水分子外，还有 1个谷氨酸羧基，1个 色氨酸分子也可能参与了配位。毒素轻链的这种独 特的配位形式、空间结构与已知的金属蛋白酶并不 相同，属于一个新型的金属蛋白酶家族 [11]。 4 肉毒毒素中毒的主要类型 肉毒毒素中毒根据其传播途径不同可分为 3 个类型，分别是食源性肉毒毒素中毒、婴儿肉毒毒 素中毒、创伤性肉毒毒素中毒 [12-14]。在目前己知的 病例中，食源性肉毒毒素中毒占绝对多数，其次是 婴儿肉毒毒素中毒。 4.1 食源性肉毒毒素中毒 食源性肉毒毒素中毒主要是由于进食了含有 肉毒毒素的食品所引起，也是人类肉毒毒素中毒最 普遍的一种形式。 食品在制作过程中被肉毒杆菌芽孢所污染， 制成后未彻底灭菌，芽孢可在厌氧环境中发芽繁殖、 产生毒素，食前又未加热烹调，已产生的毒素被食 后引起食物中毒，多见于罐头食品、乳制品、真空 包装食品和冷冻食品等，在我国，肉毒中毒大多由 发酵的豆制品和面制品所致。 4.2 婴儿肉毒毒素中毒 婴儿肉毒毒素中毒由于新生儿正常菌群缺乏， 其食入的肉毒杆菌芽孢可以萌发、繁殖、产生毒素， 从而引起婴儿中毒。 婴儿的发病年龄通常在 2周到 8个月，年龄 在 9个月以上的婴儿未见相关报道。婴儿中毒 A 型多于 B型，F型极为罕见。1岁以下的婴幼儿不 宜食用蜂蜜，因为蜜蜂在采集花粉酿蜜的过程中， 很容易把被肉毒杆菌污染的花粉和蜜带回蜂箱，导 专 论 综 述 38 致蜂蜜中含有的肉毒杆菌较多，容易引起婴儿肉 毒毒素中毒。芽孢在人体内一般不能出芽，但由于 婴儿肠道的特殊环境，可能引起感染和中毒。临床 表现为先是便秘，继而出现头颈部肌肉软松、吮乳 无力、吞咽困难、眼帘下垂、全身肌肉松弛减退， 可持续 8周以上。只要注意营养和护理，一般可在 1-3月内自然恢复，严重者亦可因呼吸麻痹而导致 婴儿猝死。婴儿肉毒病是肉毒杆菌感染后在体内繁 殖产生毒素所致，属于感染性中毒，与单纯性中毒 不同。 4.3 创伤性肉毒症 创伤性肉毒中毒，类似破伤风，由于伤口处 污染的肉毒杆菌芽孢繁殖、产毒，毒素从伤口进入 血液循环，随血流到达神经系统后引起肉毒中毒而 导致。 5 肉毒毒素中毒的临床症状 肉毒中毒的临床表现与其他食物中毒不同， 胃肠道症状少见，主要为运动神经末梢麻痹。临床 表现包括因肌肉活动不协调而出现肢体歪斜，舌外 伸，食物的取用、咀嚼、吞咽出现困难。意识正常， 如果未出现继发感染，体温仍保持正常。 该病潜伏期 18~72 h，先有一般不典型的乏力、 头痛等症状，随后眼肌麻痹，开始出现复视、斜视、 眼睑下垂等，后来发展至咽喉部肌肉麻痹，吞咽、 咀嚼困难，进而隔膜麻痹、呼吸困难，重者可死于 呼吸困难与衰竭，病死率在 30%以上。 6 肉毒杆菌和肉毒毒素的检测方法 由于肉毒杆菌的致病性主要在于其产生的外 毒素，并且由于肉毒杆菌属于厌氧菌，培养条件要 求高，一般实验室不具备这样的条件，所以检测的 重点主要是对肉毒毒素的检测。目前实验室中常用 的检测肉毒毒素的方法是基于抗原抗体反应、针对 毒素蛋白的检测，还有小鼠致死及中和实验、胶体 金免疫层析法等，另外，也有少量采用分子生物学 方法检测肉毒毒素基因的报道 [15-18]。 6.1 肉毒杆菌的厌氧分离培养与鉴定 将可疑食物或呕吐物煮沸 1 h可以杀灭非芽胞 杆菌，接种于血琼脂平板厌氧培养；或将可疑材料 在 65~80℃条件下加热 30 min，然后 37℃培养 24 h，涂片检查细菌形态，并作生化鉴定。对于 E型 菌的芽孢还需要用溶菌酶处理，用血琼脂平板在厌 氧条件下培养。根据生化反应和毒素的产生进行鉴 定，可采用免疫荧光方法鉴定某些代谢群的菌株， 还可编码各种毒素的基因设计引物进行PCR扩增。 6.2 小鼠毒素中和试验 对于传统的检测方法，小白鼠腹腔注射法是 目前对肉毒毒素活性与定性的标准分析方法。该方 法灵敏度高，但检测周期长，至少需要 4天；另外 还存在使用实验动物带来高成本的缺点，同时需要 较复杂的实验操作。因而，近年来主要研究利用被 动血凝反应测定、放射免疫测定、凝胶扩散测定、 酶联免疫测定、肽链内切酶酶联免疫测定等，大多 采用免疫法，检测单个样品的时间可以缩短到几个 小时。由于免疫法主要基于分子识别，在肉毒毒素 失活或部分失活的情况下，也可能检出。也就是说， 免疫方法只能测定是否存在肉毒毒素分子，而不能 测定其活性，在测定活性或毒力时，仍需要采用小 白鼠腹腔注射法。 6.3 其他检测方法 康彦等 [19]采用毛细管电泳激光诱导荧光检测 联用技术分离检测肉毒毒素 A与其人工合成多肽 底物反应后的产物来对其活性进行分析，该方法具 有需要样品量少，分析速度快等优点。苏裕心等利 用 SmartCycler系统，建立了一种高敏、特异、简便、 快速的检测肉毒杆菌等多种食源性致病菌的荧光定 量 PCR方法 [20]。 近年来，基因芯片法以其具有集成化、微型 化、自动化、高通量等特点，被广泛用于病原菌的 检测。金大智等 [21]以 16S rDNA和 23S rDNA基 因作为检测靶片段，选取 15种常见肠道致病菌作 为基因芯片检测的靶细菌，设计和筛选通用性引物 和特异性探针，优化两重 PCR反应体系，并探讨 核酸提取方法、引物不对称比例、镁离子浓度、退 火温度、退火时间、杂交温度、杂交液成分等因素 对基因芯片杂交的影响。成功建立了包括肉毒杆菌 在内的 15种肠道致病微生物的基因芯片检测法， 并用于临床诊断。 7 肉毒毒素的预防和治疗 39 专 论 综 述2013年第30卷第8期 肉毒毒素的防治，主要采用疫苗预防和使用 保护性抗体进行被动免疫治疗。疫苗是预防肉毒中 毒的最有效的方法。临床诊断往往不能有效区分中 毒的肉毒毒素类型，治疗时多使用多价的马血清抗 毒素 [22-23]。 7.1 肉毒毒素疫苗 目前肉毒毒素疫苗的类型主要有：肉毒毒素 的类毒素疫苗、肉毒毒素亚单位疫苗、肉毒毒素的 DNA疫苗等。目前国外使用较多的肉毒毒素的类 毒素疫苗是福尔马林灭活的五价疫苗。但该疫苗只 含有七个血清型中的 5种（A-E），不能抵抗 F和 G型肉毒毒素的攻击 [24]。研究表明，肉毒毒素的 Hc片段包含保护性抗原基本决定簇，作为免疫原 能引发显著保护性免疫应答，A和 B型毒素 Hc重 组蛋白的高效表达也有一定的进展 [25-26]。 7.2 肉毒毒素的治疗 7.2.1 肉毒毒素拮抗剂：小分子化合物和肽类物质 对肉毒毒素的毒性可以起到一定的抑制作用，毒素 拮抗剂成为肉毒毒素中毒防治的新途径 [27-28]。 肉毒毒素拮抗剂的靶目标主要是：1）胆碱能 运动神经末端的表面结合位点。肉毒毒素的 H链 首先与胆碱能神经末梢的突触前膜上的受体结合； 2）毒素的中和抗原表位；3）毒素轻链的活性部位。 阻断毒素与胆碱能运动神经末端受体的结合相对困 难，与之相比，抑制毒素与中和抗原表位的结合显 得更加有效，能够延缓机体死亡，而不能有效防治 瘫痪。研究发现，一些锌离子试剂、金属蛋白酶抑 制剂等可以抑制肉毒毒素轻链的活性。 7.2.2 肉毒毒素抗毒素：常用的方法是以福尔马林 类毒素免疫小鼠以制备单克隆抗体，然而研究表明 无论作为免疫原或抗原，肉毒毒素类毒素和毒素之 间存在显著的差异。目前，研究者正致力于新型抗 毒素的研究。Cenci[29]以体外表达肉毒毒素轻链片 段为免疫原制备鼠单克隆抗体，虽然在体内不能抑 制毒素的毒性，但是可以防止毒素引起的神经递质 释放的抑制。Pless等 [30]用毒素 Hc片段制备了单 克隆抗体，从而确定了 A型肉毒毒素的 Hc中至少 有 2个不同的中和抗原表位。其他研究也表明用单 抗封闭毒素 Hc上的表位，也可在一定程度上有效 预防和治疗肉毒毒素中毒。 参考文献： [1] Botulism Handbook for epidemiologists，clincians，and laboratory workers[M]. 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