支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范_草案_

·诊治· 支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范 (草案) 中华医学会呼吸病学分会 　　支气管肺泡灌洗 (BAL) 能直接获取肺内炎症免 疫效应细胞 ,是探讨肺局部免疫病理过程的一种比 较安全和有用的检查方法。对某些肺疾病 ,特别是 弥漫性间质性肺疾病 (如特发性肺纤维化、结节病、 外源性过敏性肺泡炎、肺泡蛋白沉积症、风湿性疾病 伴肺纤维化和Langerhans 组织细胞增生症等) 、肺部 肿瘤以及免疫受损患者的肺部感染等 ,BAL 已成为 辅助临床诊断和预后判断的重要检测手段。近 20 年间支气管肺泡灌洗液 (BALF) 检测无论从检测范 围和检测项目上都有了长足的进展。由于 BALF 检 测受诸多因素的影响 ,如 BAL 操作时混血 ,大气道 分泌物混入 ,吸引负压大小 ,灌洗量 ,回收量 ,灌洗液 在肺内停留时间的长短以及肺泡上皮通透性的改变 等不同 ,所得结果亦有一定差异。因此 ,建立化 和规范化的 BAL 操作和 BALF 实验室检测程序是获 得准确结果的关键和前提。现将 BAL 操作及 BALF 实验室检查技术做一原则规范。 支气管肺泡灌洗操作方法 一、术前准备 同纤维支气管镜 (纤支镜) 术前准备 ,常规在纤 支镜气道检查后于活检刷检前做 BAL。局部麻醉剂 为 2 %利多卡因。 二、BAL 操作技术 1.灌洗部位选择 :对弥漫性间质性肺疾病选择 右肺中叶 (B4 或 B5)或左肺舌段 ,局限性肺病变则在 相应支气管肺段进行 BAL。 2. BAL 操作步骤 : (1) 首先在要灌洗的肺段经 活检孔通过一细硅胶管注入 2 %利多卡因 1～2 ml , 做灌洗肺段局部麻醉 ; (2) 然后将纤支镜顶端紧密 楔入段或亚段支气管开口处 ,再经活检孔通过硅胶 管快速注入 37 ℃灭菌生理盐水。每次 25～50 ml ,总 量 100～250 ml ,一般不超过 300 ml ; (3) 立即用 50～ 100 mm Hg(1 mm Hg = 0. 133 kPa)负压吸引回收灌洗 液 ,通常回收率为 40 %～60 % ; (4) 将回收液体立即 用双层无菌纱布过滤除去粘液 ,并记录总量 ; (5) 装 入硅塑瓶或涂硅灭菌玻璃容器中 (减少细胞粘附) , 置于含有冰块的保温瓶中 ,立即送往实验室检查。 支气管肺泡灌洗液实验室检查 一、BALF 细胞总数和分类计数检测 1. 将上述回收灌洗液装入塑料离心管内 ,在 4 ℃下以 1 200 r/ min 离心 10 min ,上清 (原液或 10 倍 浓缩) - 70 ℃储存 ,用做可溶性成分的检测。 2. 经离心沉淀的细胞成分用 Hank′s 液 (不含 Ca + + 、Mg + + ) 在同样条件离心冲洗 2 次 ,每次 5 min。弃去上清后加 Hank′s 液 3～5 ml 制成细胞悬 液。也可以应用灌洗原液以减少细胞丢失。 3. 在改良的 Neubauer 计数台上计数 BALF 中细 胞总数 ,一般以 1 ×109/ L 示。如果细胞数过高 时 ,再用 Hank′s 液稀释 ,调整细胞数为 5 ×109/ L ,并 同时将试管浸入碎冰块中备用。 4. 细胞分类计数 :采用细胞离心涂片装置 ,加入 备用细胞悬液 (细胞浓度为 5 ×109/ L) 100μl ,在 4 ℃ 下以 1 200 r/ min 离心 10 min ,通过离心作用将一定 数量的 BALF 细胞直接平铺于载玻片上。取下载玻 片立即用冷风吹干 ,置于无水乙醇中固定 30 min 后 进行染色 ,一般用 Wright 或 HE染色。 5. 在 40 倍光学显微镜下计数 200 个细胞 ,进行 细胞分类计数。 二、BALF 中 T淋巴细胞亚群的检测 1. 采用间接免疫荧光法 ,将上述获得的 BALF 细胞成分 ,用 10 %小牛血清 RPMI 1640 培养液 3～5 ml 制成细胞悬液。 2. 将细胞悬液倒入平皿中 ,置于 37 ℃5 % CO2 培养箱中孵育 2 h ,进行贴壁处理 ,去除肺泡巨噬细 胞。 3.取出细胞悬液 ,再用 Hank′s 液冲洗离心 1 次 ,弃上清留 20～100μl。经贴壁处理后的细胞悬 液中 ,肺泡巨噬细胞显著减少 ,淋巴细胞相对增多。 4. 将经贴壁处理的细胞悬液分装 3 个小锥形离 心管内 ,每管 20～30μl ,用微量加样器向标本中加 单克隆抗体 CD3、CD4 和 CD8 各 20～40μl ,混匀置于 4 ℃冰箱中作用 1～2 h。 ·093· 中华结核和呼吸杂志 2002 年 7 月第 25 卷第 7 期 　Chin J Tuberc Respir Dis , July 2002 , Vol 25 , No. 7 5.取出标本 ,先用 Hank′s 液冲洗离心 2 次 ,以 12 000 r/ min 离心 20 s ,然后加羊抗鼠荧光抗体各 20～40μl ,置于 4 ℃冰箱作用 30 min。 6. 取出标本用 Hank′s 液以同样速度和时间离 心冲洗 2 次 ,弃上清留 20μl 充分混匀细胞 ,取 1 滴 于载玻片上加盖玻片。荧光显微镜下数 200 个淋巴 细胞并计算出标有荧光细胞的阳性率。 几点说明 1. 用于做支气管肺泡灌洗的纤支镜顶端直径应 在 5. 5～6. 0 mm 左右 ,适于紧密楔入段或亚段支气 管管口 ,防止大气道分泌物混入和灌洗液外溢 ,保证 BALF 回收量。 2.在灌洗过程中咳嗽反射必须得到充分的抑 制 ,否则易引起支气管壁粘膜损伤而造成灌洗液的 混血 ,同时影响回收量。 3. 1 份合格的 BALF 标本应是 :BALF 中没有大 气道分泌物混入 ;回收率 > 40 % ,存活细胞占 95 % 以上 ;红细胞 < 10 % (除外创伤/ 出血因素) ,上皮细 胞 < 3 %～5 % ;涂片细胞形态完整 ,无变形 ,分布均 匀。 4. 由于 BALF 中可溶性成分检测受诸多检测因 素影响 ,如灌注量和回收量 ,肺泡上皮通透性等 ,致 使肺泡衬液稀释度亦有所不同。尽管在做 BALF 可 溶性成分检测时采用内或外标记物进行标化 ,但检 测结果仍存在着差异 ,其临床价值有限 ,故本草案未 做有关 BALF 液性成分检测方法的规范。 5.本规范不适于少量液体做支气管冲洗 (BL) 和全肺灌洗技术的操作。 6.健康非吸烟者 BALF 细胞学检测正常参考 值 : (1)细胞总分数 :细胞总数 (0. 9～0. 26) ×109/ L , 其中肺泡巨噬细胞 0. 93 ±0. 03 ,淋巴细胞 0. 07 ± 0. 01 ,中性和嗜酸细胞均 < 0. 01。(2) T 淋巴细胞亚 群 :总 T细胞 (CD +3 ) 0. 7 ,T辅助细胞 (CD +4 ) 0. 5 ,T抑 制细胞 (CD +8 ) 0. 3 ,CD +4 / CD +8 比值 1. 5～1. 8。 (收稿日期 :2002204204) (本文编辑 :韩锟) ·征文· 重症肺炎论坛征文通知 重症肺炎是呼吸系统感染临床处理中面临的最重要的挑战之一。为促进和交流该领域的研究 ,提高重症肺炎的临床诊 治水平 ,中华医学会呼吸病学分会感染学组与中华结核和呼吸杂志编辑部定于 2002 年 10 月在江苏省镇江市举办重症肺炎论 坛 ,欢迎参加 ,踊跃投稿。如无者 ,欢迎参会并授予继续教育学分。 征文内容 : (1)重症肺炎的流行病学研究 ; (2)病原学 (社区获得性和医院获得性重症肺炎) 及其抗生素敏感性 ; (3) 抗菌治 疗与评价 (包括经验性治疗) ; (4)免疫抑制和其他特殊人群肺炎 ; (5)预防与控制 ; (6)基础研究 ; (7)其它。 来稿必须是在国内、外未公开发表者 ,全文字数限在 4 000 字左右 ,并附 1 000～1 500 字非结构式摘要 1 份。截稿日期为 2002 年 6 月 30 日。 来稿请寄 :北京市东四西大街 42 号中华结核和呼吸杂志编辑部收 ,并请于信封左上角注明“重症肺炎论坛征文”字样。 《重症肺炎论坛》专题讲座选题 (1) 重症肺炎的新界定及相关问题 (邓伟吾教授) ; (2) 重症肺炎病原学诊断采样技术及其临床应用上的争议 (罗文侗教 授) ; (3) 细菌耐药机制与对策 (陈文彬教授) ; (4) β2内酰胺酶研究及其进展 (唐英春教授) ; (5) 呼吸机相关肺炎诊断治疗进展 (何冰教授) ; (6) 呼吸机相关肺炎内源性感染机制 (李华茵博士) ; (7) 抗革兰阳性菌抗生素研究进展 (殷凯生教授) ; (8) 抗革 兰阴性菌和抗真菌药物研究进展 (刘又宁教授) ; (9) 重症肺炎抗菌治疗及其策略 (何礼贤教授) ; (10) 老年人和急危重症患者 的肺部感染 (孙铁英教授) ; (11) ICU 内肺部真菌感染的诊断及其争议 (姚婉贞教授) ; (12) 免疫受损宿主的肺部感染 (瞿介明 教授) ; (13) 重症感染的生物调节治疗 (郑金旭教授) ; (14) 感染、ARDS和 MOF(刘大为教授) ; (15) 医院获得性肺炎的预防控 制及 CDC指南 (黄绍光教授) ; (16) 临床流行病学/ 循证医学在肺部感染中的应用 (胡必杰教授) 。 ·193·中华结核和呼吸杂志 2002 年 7 月第 25 卷第 7 期 　Chin J Tuberc Respir Dis , July 2002 , Vol 25 , No. 7