#论 著 #
m 国家 / 973计划 0项目子项目 (编号: 2007CB512306 ) ;安徽省自
然科学基金项目 (编号: 090413121 );安徽医科大学第一附属医
院博士科研启动基金
* 安徽医科大学第一附属医院神经内科 (合肥 230022 )
通讯作者 ( E-m ai:l sunzhwu@ m ai.l h.f ah. cn)
v 中国科学技术大学生命科学院
皮质下缺血性血管性疾病的MTHFR基因多态性m
朱小群* 刘际v 赵晶晶* 周江宁v 孙中武*
=摘要> 目的 研究皮质下缺血性血管性疾病 ( subcortical ischem ic vascua lar d isease, SIVD )与 N 5, N 10-亚甲基
四氢叶酸还原酶 ( m e thy lene tetrahydro folate reductase, MTHFR )基因 C677T多态性的关系。
应用聚合酶链反应
( po lym erase cha in reaction, PCR )技术和限制性酶切片段长度多态性 ( restr ic tion fragm ent leng th po lym orph ism, RFLP )
技术检测 46例 SIVD患者和 43名正常人的 MTHFR基因 C677T多态性。结果 SIVD组 T /T型、C /T型基因频
率分别为 36196% 、341 78% ,分别高于对照组 ( 201 93%、231 26% )。 SIVD组 T等位基因频率明显高于对照组 (分别
为 54135%、321 56% , P < 0101)。 T /T型、C /T型患 SIVD风险度较 C /C 型分别高 31487倍 ( 95% C I, 111217 ~
91 993)和 21954倍 ( 95% C I, 11045~ 81350)。结论 MTHFR基因 T等位基因可能是 SIVD的遗传易感因子, 而 C
等位基因则具有一定保护作用, MTH FR基因 C677T点突变与 S IVD发病密切相关。
=关键词> N5, N10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性 皮质下缺血性血管性疾病
=中图分类号> R743, R749. 1+ 3 =文献标识码> A
Methylenete trahydrofo late reductase gene polymorph ism s in patien ts w ith subcortical ischem ic vascular d is-
ease. ZH UX iaoqun, LIU J i, ZHAO J ingjing, ZHOU J iangning, SUN Zhongwu. Dep t of N euro logy, the F irst Affiliated
H osp ital of AnhuiM edica l University, H efei 230022, C hina. Te:l 0551- 2922328.
=Abstract> Objective To study the assoc iation betw een subcortica l ischem ic vascu la r d isease ( S IVD ) and m e th-
y lenete trahydrofo late reductase gene ( MTHFR ) po lym orph ism s. M ethods MTHFR gene C677T po lymo rph ism s w ere de-
term ined in 46 pa tients w ith SIVD and 43 contro ls using polym erase cha in reaction ( PCR ) and restriction fragm ent leng th
po lymo rph ism ( RFLP ). R esu lts The frequency o fMTH FR C677T hom ogenetic type and heterogenetic type in SIVD group
w ere 36196% and 34178% respective ly, wh ich w ere h igher than those in the contro l g roup ( 201 93% and 23126% ) . The
frequency of the 677T a llelew as much h igher in SIVD group than in the con tro l g roup ( 541 35% and 321 56% respectiv ely,
P < 0101). The re lative r isk o f SIVD assoc iated w ith the T /T, C /T geno type ve rsus the C /C geno typew as 31487 ( 95% CI,
11 1217~ 91 993) and 21 954 ( 95% C I, 11045~ 81350). Conclusions The T a lle le con tributes to genetic susceptib ility
for SIVD while the C a lle le is a pro tective fac to r fo r SIVD. TheMTHFR C677T gene po lym orph ism is c losely assoc ia ted w ith
SIVD.
=Keywords> M ethy lenetetrahydro fo la te reductase gene po lym orphism Subcortica l ischem ic vascu la r d isease
皮质下缺血性血管性疾病 ( subcortical ischem ic
vascualar disease, SIVD )是指由于颅内小血管病变 (多
发性腔隙性梗死、腔隙状态 )和血管狭窄或 /和脑部血
液低灌注状态 (脑白质疏松、B insw anger病 )而导致的,
以血管性认知功能损害或痴呆为主要表现的一组疾
病 [ 1]。高半胱氨酸或同型半胱氨酸血症 ( Hhcy )是动
脉粥样硬化的一项独立危险因素,与心血管疾病和脑
血管疾病发病密切相关 [ 2]。MTHFR基因 677位点的
碱基 C被碱基 T置换,其编码的丙氨酸被缬氨酸取代,
导致酶活性下降,血清 H cy水平增高。MTHFR基因作
为痴呆的一个候选基因成为近年研究的一个热点 [ 3]。
我们的前期研究发现 Hhcy与 SIVD的发病密切相
关 [ 4]。因此,我们利用 PCR-RFLP技术对 SIVD和对照
组的 MTHFR基因多态性进行检测,进一步探讨 MTH-
FR基因多态性与 SIVD的关系。
1 材料与方法
1. 1 研究对象 SIVD组入组
[ 5] : ¹高危人群:包
括社会人口因素、血管危险因素、心源性因素等; º神
719中国神经精神疾病杂志 2010年 第 36卷 第 12期
经心理学评估: 应用简易精神智能检查量表 ( m in-i
m ental state exam inat ion, MM SE)、临床痴呆量表 ( clin-i
cal dem entia rating, CDR )、老年抑郁量表 ( the geriatric
depress ion scale, GDS)测试。认知功能损害评定标准:
MMSE标准为文盲 [ 17分,
[ 20分, 中学或以上
[ 24分 (文盲组、小学以中学或以上的评分折算如文
盲 17分 = 24分 ), 且 CDR > 015; » 神经影像学检查
(MRI) :广泛脑室旁和脑深部白质损害,多发性腔隙性
梗死。 SIVD组排除标准: ¹早期出现明显记忆障碍和
进行性记忆衰退; º头 MRI未发现相应的脑血管疾病
的证据。对照组入组标准: ¹神经心理学评估无异常;
º头 MRI未发现相应的脑血管疾病的证据。
SIVD组 46例, 其中男 35例, 女 11例,平均年龄
( 69189 ? 8191)岁,平均受教育程度 ( 7175 ? 4114)年;
对照组 43名,其中男 21名, 女 22名, 平均年龄 ( 64119
? 11104)岁, 平均受教育程度 ( 8158 ? 4187)年。以上
研究对象全部来自安徽医科大学第一附属医院,均为
随机选择、无血缘关系的汉族人。病例组和对照组均
签署知情同意。
1. 2 研究方法 标本基因组 DNA的制备 采用 TaKa-
Ra(宝生物工程大连有限公司 )提供 DNA抽提试剂
盒,按#说明书#中提供的实验步骤进行。
PCR扩增反应: PCR反应体系体积为 25 LL, 5 LL
DNA, 2mM dNTP 1 LL, 引物对 2 LL, 10 @ PCR缓冲液
215 LL, T aq聚合酶 0125 LL, 蒸馏水 14125 LL。 PCR
反应条件为 94 e 预变性 5 m in, 94 e 60 s, 60 e 30 s,
72 e 60 s,共 30个循环。 72 e 延伸 7 m in。
RFLP分析: ¹ H inf I内切酶消化产物: 取 10 LL
PCR产物, 10 @ buffer 2 LL, H2O 7 LL, H inf I酶 1 LL,
37 e 水浴过夜; º 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( PAGE )
分析酶切产物:取 10 LL酶切产物加入 12 % PAGE负
极端的加样孔,以溴酚蓝为指示剂, 溴化乙锭 ( EB)为
染色剂,在 80V电压下电泳 90 m in, 360 nm紫外线灯
下观察带型并予定型, 标准分子量对照为 DL2000
M arkers。引物的设计及合成: 引物设计参照有关文
献 [ 3], 其 序 列 为 上 游 引 物 P1 5c-CAAAGGCCAC-
CCCGAAGC-3c, 下游引物 P2 5c-AGGACGGTGCGGT-
GAGAGTG-3c。
1. 3 统计学方法 采用 SPSS 13. 0进行统计学分析。
病例组与对照组基因型构成的差异用 µ2检验; 两组间
MMSE评分差异用 Student t检验;应用 Logistic回归分
析,采用比值比 (OR )评价不同基因型对疾病的影响,并
计算其 95%的可信区间 ( 95% CI)。检验水准 A= 0105。
2 结果
2. 1 总体认知功能损害情况 SIVD组 MMSE评分
( 24163 ? 4135) ,对照组为 ( 27119 ? 2102),两组间统计
学处理有统计学差异 (P = 01001)。
2. 2 基因型判定 经 PCR扩增后 MTHFR基因目的
片段大小为 246 bp,根据酶切情况, MTHFR基因型有 3
种: T纯合 T /T基因型有 246 bp一条带, C纯合 C /C基
因型有 174 bp、72 bp两条带, 杂合型 C /T基因型有
246 bp、174 bp、72 bp三条带。
2. 3 MTHFR基因型及等位基因频率 见表 1。由表
1可知, SIVD组与对照组基因型均有统计学差异 ( µ2
= 71023, P = 01030)。 SIVD患者中MTHFR基因 C /T、
T /T基因型频率高于对照组, 与 SIVD存在正关联;而
C /C基因型频率则明显低于正常人,与 SIVD存在负关
联。 SIVD组中 MTHFR基因等位基因 C的频率为
45165% , T等位基因频率为 54135% ;与对照组的 C等
位基因 67144%、T等位基因 32156%比较有统计学差
异 ( µ2= 41286, P = 01038)。
2. 4 MTHFR基因多态性致 SIVD效应 Logistic回
归分析结果显示:变量基因型的 W ald µ2 = 61805, P =
01033,说明 3种不同基因型在 SIVD组与对照组之间
的差异有统计学意义。以 C /C型作为哑变量,检验结
果表明 SIVD组与对照组之间 C /T型与 C /C型的差异
有统计学意义 (P = 01041) , OR = 21954, 95% CI: 11045~
81350; SIVD组与对照组之间 T /T型与 C /C型的差异也
有统计学意义 (P = 01020) , OR = 31487, 95% CI: 11217-
91993。以 T /T型作为哑变量, SIVD组与对照组之间的
C /T型与 T /T型的差异无统计学意义 (P = 01773)。
Table 1 Comparision o f the distribution ofM THFR geno type and a llele genotype between SIVD group and contro l group
表 1 SIVD组与对照组 MTHFR基因型频率与等位基因频率的分布
G roups组别 n The frequency o fMTHFR genotypeMTHFR基因型频率 (% ) T he frequency of a llele geno type等位基因频率 (% )
C /C C /T T /T C T
SIVD group SIVD组 46 28. 26 ( 13) 1) 34. 78 ( 16) 1) 36. 96 ( 17) 1) 45. 65( 21) 1) 54. 35( 25) 1)
Control group对照组 43 55. 81 ( 24) 23. 26 ( 10) 20. 93 ( 9) 67. 44( 29) 32. 56( 14)
1) Comparedw ith the control group, P < 0105 与对照组比较, P < 0105
720 Chin J Nerv M ent D is Vo.l 36, No. 12 Dem cember 2010
3 讨论
H cy浓度升高的原因有遗传和环境营养两种因
素,去除各种环境营养因素,代谢酶的基因突变引起其
缺陷或活性下降是导致 H cy升高的主要原因。MTH-
FR将 N5, N10-亚甲基四氢叶酸还原为甲基四氢叶酸,
后者作为 H cy再甲基化甲硫氨酸的甲基供体。MTH-
FR基因定位于染色体 1p363上, cDNA全长 22 kb。
H inf位点限制性内切酶片段长度多态性系 cDNA序列
上第 677位核苷酸 Cy T突变,产生 1个H inf限制性内
切酶识别序列,这一变化造成编码的氨基酸由丙氨酸
变成缬氨酸, 这种突变造成 MTHFR活性下降, 导致
H cy水平增高 [ 3]。
有关 MTHFR基因多态性与痴呆和老化之间的关
系报道较多。 Reg land等 [ 6]研究发现, MTHFR基因突
变后导致不耐热 MTHFR( Mt THFR )产生,从而导致酶
活性下降和 H cy升高, MTHFR基因多态性和携带
ApoE-4等位基因协同作用可导致阿尔茨海默病
(A lzhemi erps disease, AD )发生。日本学者等对 100名
60岁以上人群进行了检测,结果发现存在 MTHFR基
因 C677T突变的痴呆患病率显著高于非突变患者,其
中 7例男性痴呆患者中有 5例为 MTHFR T /T型 [ 7]。
MTHFR基因 C677T突变不仅与老年期痴呆发病有关,
且与痴呆的严重程度有关。
近年来有几项研究探讨 MTHFR基因型与血管性
痴呆 ( vascular dementia, VaD )的关系, 但结果不一。
M cIlroy等 [ 8]研究发现: AD、VaD、中风患者血浆 H cy均
较对照组显著升高;尽管携带 MTHFR T等位基因时可
显著增加 VaD和中风后痴呆患病风险,但 MTHFR基
因型并不影响血浆 H cy水平。因此作者认为: 血浆
H cy升高与中风、AD、VaD发病密切相关, 但这种影响
与其他血管危险因素、营养状况、MTHFR基因型等无
关。H assan等 [ 9]将颅内小血管病 ( cerebral sm all vessel
disease, SVD )分成两种类型, 即多发性腔隙性梗死和
缺血性脑白质疏松。结果发现: SVD血清 H cy水平较
对照组显著升高, 且 H cy水平高低与多发性腔隙性梗
死和缺血性脑白质疏松的关系均密切相关,尤以后者
为甚; MTHFR基因 677T等位基因仅是缺血性脑白质
疏松的危险因子。
但 Chapm an等 [ 10]通过对 41例 VD患者、49例 AD
患者和 40名对照组 MTHFR基因多态性研究发现, VD
患者与 AD和对照组相比,其 MTHFR基因多态性分布
并无显著异常,故认为 VD的发病机制可能与其他血
管性疾病有所不同。 Po llak等 [ 11]研究发现: V aD、AD、
正常对照组间平均血浆 H cy值无显著差异, MTHFR T /
T型以及 T等位基因在 3组间也无显著区别,故认为
MTHFR C677T突变并未增加 VaD和 AD的患病风险。
Zulian i等 [ 12]通过对 60例 VaD、45例 AD、54例正常对
照的 MTHFR基因多态性研究发现, 3组之间 MTHFR
基因多态性分布也无显著性差异,因而认为MTHFR基
因多态性分布与 VaD、AD发病无关。
我们的结果表明: SIVD组与对照组 MTHFR基因
频率分布不同。 SIVD组与对照组 T等位基因频率、C
等位基因频率相比较有统计学意义。采用比值比
(OR )来评价不同基因型对疾病的影响时, 我们发现 3
种不同基因型致 SIVD效应上存在着统计学差异 (P =
01033)。 SIVD和对照组之间 C /T型与 C /C型的差异
有统计学意义; SIVD和对照组间 T /T型与 C /C型的差
异也有统计学意义。但 SIVD和对照组间的 C /T型与
T /T型的差异无统计学意义 (P > 0105)。从上述结果
可以看出, MTHFR基因 C /T型、T /T型患 SIVD风险度
较 C /C型分别高 21954和 31487倍,提示 T等位基因
可能是 SIVD的遗传易感因子,而 C等位基因则具有一
定保护作用,进一步支持 MTHFR基因 C677T点突变
与 SIVD发病密切相关。
不足之处在所难免。本研究样本量偏小,最好能
将 SIVD再分成多发性腔隙梗死、缺血性脑白质疏松、
腔隙性梗死合并脑白质疏松 3组进行研究,观察 3组
中 H cy水平,以及 MTHFR C677T等位基因变化情况。
将来, 我们进行的随访研究将有助于进一步观察基线
水平 H cy、MTHFR基因多态性、适当使用药物降低 H cy
水平等方面对 SIVD向 VaD转化的影响。
参 考 文 献
[ 1 ] Rom an GC, Erk in jun tti T, W allin A, et a.l Sub cort ical isch em ic
vascu lar dem en tia[ J] . Lancet Neu ro,l 2002, 1 ( 7) : 426- 436.
[ 2 ] W elch GN, Losca lzo J. H om ecys teine and atheroth rom bosis[ J] .
N Engl JM ed, 1998, 338( 15 ): 1042- 1050.
[ 3] Frosst P, B lom H J, M ilosR, et a.l A cand id ate gen et ic risk factor
for vascu lar d isease: a comm onm u tat ion inm ethylen etetrahydrofo-
late reductase[ J] . N atGen et, 1995, 10 ( 1) : 111- 113.
[ 4 ] 朱小群,姚明,孙中武.皮质下缺血性血管性疾病的血清同型
半胱氨酸和认知损害特征 [ J] . 安徽医科大学学报, 2008, 43
( 1) : 79- 82.
[ 5 ] Rom an GC, Erk in jun tti T, W allin A, et a.l Sub cort ical isch em ic
vascu lar dem en tia[ J] . Lancet Neu ro,l 2002, 1 ( 7) : 426- 436.
[ 6 ] Regland B, B lennow K, Germg¼ rd T, et a.l Th e role of the poly-
m orph ic gen es apolipoprotein E and m ethylen e-tetrahyd rofo late re-
721中国神经精神疾病杂志 2010年 第 36卷 第 12期
ductase in the developm en t of dem en tia of the A lzheim er type[ J] .
Dem ent Geriatr C ogn D isord, 1999, 10 ( 4) : 245- 251.
[ 7] N ish iyam a M, Kato Y, H ash imoto M, et a.l Apo lipop rote in E,
m ethy lenetetra-hyd rofolate reductase ( MTH FR) mu tat ion and th e
risk of sen ile dem en tia an ep id em iolog ica l study us ing the polym er-
ase chain react ion ( PCR) m ethod [ J ] . J Ep idem io,l 2000, 10
( 3) : 163- 172.
[ 8] M cIlroy SP, Dynan KB, Law son JT, et a.l M oderately elevated
p lasma hom ocys te ine, m ethylenetetrahydrofolate reductase geno-
type, and risk for s troke, vascular dem en tia, and A lzheim er d is-
ease in North ern Ireland [ J ] . Stroke, 2002, 33 ( 10) : 2351-
2356.
[ 9] H assan A, H un t B J, OpSu ll ivanM, et a.l H om ocys teine is a risk
factor for cerebral sm all vessel d isease, act ing v ia endothelial dys-
fun ct ion[ J] . B rain, 2004, 127( Pt 1 ) : 212- 219.
[ 10 ] Chapm an J, Wang N, T reves TA, et a.l ACE, MTH FR, factor V
Leiden, and APOE polym orph ism s in pat ien ts w ith vascu lar and
A lzh eim erps dem ent ia[ J]. Stroke, 1998; 29( 7 ): 1401- 1404.
[ 11 ] Pollak RD, Pol lak A, IdelsonM, et a.l The C677T mu tat ion in
th em ethy len etetra-hyd rofolate redu ctase (MTHFR ) gene and vas-
cu lar dem en tia[ J] . JAm G eriatr Soc, 2000; 48( 6 ) : 664- 668.
[ 12 ] Zu lian iG, B lepA, Zanca R, et a.l G enetic polym orph ism s in o-l
der sub jectsw ith vascu lar orA lzh eim erps dem ent ia[ J]. Acta Neu-
rol Scand, 2001, 103( 5 ) : 304- 308.
(收稿日期: 2010- 03- 31)
(
编辑: 李 立 )
(上接第 718页 )
二酸为正常值的 619倍 (分析值: 0. 62,基准值: 0. 001),即予维生
素 B12肌注, 14周时复查尿血中的甲基丙二酸浓度,并做血同型
半胱氨酸、氨、乳酸、氨基酸、酯酰肉碱谱分析,结果示: 血代谢蛋
氨酸 7. 6 Lm oL /L,丙酰肉碱水平升高 ( 5. 04 mmoL /L), 游离肉碱
水平极低 ( 7. 52 mmoL /L),乙酰 /游离肉碱比 1. 5,丙酰 /游离肉碱
比 0. 67,符合/甲基丙二酸血症,继发性肉碱缺乏症 0。继续给予
维生素 B12、叶酸、左旋肉碱补充治疗, 补充甜菜碱, 奥氮平 2. 5
mg /d维持治疗。第 18周时上述代谢指标改善, 患者精神症状明
显改善,自知力部分恢复, 粗测记忆力及计算力正常, 一般常识
可。但表情仍显欣快,仍稍跛行。出院修正诊断: /脑损害和功能
紊乱以及躯体疾病所致的其他精神障碍; 甲基丙二酸血 (尿 )
症 0。出院 1个月后停用奥氮平, 继续维生素 B12、叶酸、左旋肉
碱、甜菜碱治疗。患者行走自如, 精神症状消失,表情稍显欣快,
记忆力尚可,但对病中表现部分遗忘。
2 讨论
甲基丙二酸血 (尿 )症系遗传性疾病,乃因甲基丙二酰辅酶 A
( methy lma lonyl CoA )活性下降导致甲基丙二酸及丙酸等有机酸
蓄积,影响细胞代谢而引起一系列临床表现 [ 1 ]。患者多在出生后
数周内即出现呕吐、肌张力减低、嗜睡、脱水、酸中毒等症状, 罕见
精神症状。本病例为青少年女性,青春期起病, 临床表现为类分
裂样症状,存在认知损害,并伴有神经系统阳性体征,最后经血尿
有机酸分析而确诊为甲基丙二酸血 (尿 )症晚发型, 针对性的治
疗后疗效良好,进一步验证了诊断。该病例的临床表现提示,甲
基丙二酸血症症状非常复杂,患者不仅存在躯体和神经系统症状
及体征,也可能出现认知损害、类似精神分裂症表现。同时, 该案
例良好的治疗效果,进一步验证了晚发病例的病程相对为一个良
性过程 [ 2] , 预后较好。
回顾总结本病例,提醒临床医师即使在患者具有明显的精神
症状时,也应重视和早期识别提示患者可能存在器质性损害的神
经系统症状体征及精神方面的表现,如本病例早期时已显示可疑
的智能损害,但因患者欠配合,未能进行充分的检查。同时, 临床
医师在患者出现抽搐时,既要考虑到精神药物导致的可能性,也
要考虑到器质性疾病的可能性,如该患者出现的抽搐很有可能是
代谢病对皮层的损害所致, 而非奥氮平所致。最后本病例是因肌
力下降、跛行而引起医生重视并进一步明确了诊断。提示对于跛
行的患者, 既要考虑到神经系统疾病的可能性,也要考虑到代谢
性疾病的可能性。如: 周围神经即是甲基丙二酸尿症经常受累的
部位 [ 3 ] ,其临床症状可表现为反射降低或肌萎缩及跛行。本病例
的诊断经历了一个复杂的过程, 即使在已有神经系统阳性体征并
考虑器质性疾病时,仍做了许多筛网式检查才得以明确诊断。因
此,还有一点总结:精神科儿科若怀疑器质性疾病,应常规做尿代
谢检查。
甲基丙二酸血 (尿 )症的治疗包括:急性期补液纠酸,补充左
旋肉碱治疗及长期治疗 [ 4] ,临床可分为维生素 B12反应型和不反
应型 [ 5 ]。对于有精神症状的患者,本案例的治疗过程提示,应以
代谢病治疗为主,小量精神药物治疗为辅。
参 考 文 献
[ 1] Deodato F, Boenz i S, S antorelli FM, et a.l M ethy lm alon ic and
prop ion ic acidu ria[ J] . Am JM ed G enet C Sem in M ed Gen et,
2006, 142( 2 ): 104- 112.
[ 2] T saiAC, M orelCF, S charerG, et a.l Late-onset com b ined hom o-
cyst inuria andm ethylm alon ic acidu ria ( cb lC ) and n europsych iatric
d is turb ance[ J] . Am J M ed G enet A, 2007, 143 ( 20 ) : 2430-
2434.
[ 3] Sedel F, Fontain e B, Saudubray JM, et a.l H ered itary spastic pa-
rapares is in adults associated w ith inborn errors of m etabolism: A
d iagnostic approach[ J] . J Inh eritM etabD is, 2007, 30: 855- 864.
[ 4] 王斐,韩连书. 甲基丙二酸血症诊治研究进展 [ J]. 临床儿科杂
志, 2008, 26( 8 ) : 724- 727.
[ 5] M orel CF, Lerner-E ll is JP, Rosenb latt DS. Com b ined m ethy lm a-
lon ic aciduria and hom ocystinu ria ( cb lC ) : phenotype-genotyp e
correlat ion s and ethn ic-specif ic ob servations [ J ] . Mo l Genet
M etab, 2006, 88 ( 4) : 315- 321.
=中图分类号 > R749. 2+ 5 (收稿日期: 2010- 05- 13)
=文献标识码 > A (责任编辑: 曹莉萍 )
722 Chin J Nerv M ent D is Vo.l 36, No. 12 Dem cember 2010