脊髓灰质炎实验室的监测与运转

脊髓灰质炎实验室的监测与运转 脊髓灰质炎实验室的监测与运转 分析河北省脊髓灰质炎（脊灰）实验室监测数据，评估其运转情况，为河北省继续维持无脊灰状态提供实验室数据。 分析全省11个市上报的急性弛缓性麻痹（AFP）病例个案送检表、河北省脊灰实验室病原学监测数据和国家脊灰实验室对所有脊灰病毒（PV）株进行型内鉴定数据。结果 2001-2009年河北省脊灰实验室共收到3422例AFP病例粪便标本，282例AFP病例接触者粪便标本。AFP病例中分离到PV280例，年均分离率为8.2%；分离到非脊灰肠道病毒（NPEV）368例，年均分离率为10.8%； AFP病例接触者粪便标本中分离出PV25例，年均分离率为8.9%，分离出NPEV64例，年均分离率为22.7%。未发现脊灰野病毒或疫苗衍生脊灰病毒 (VDPV)。脊灰实验室每年均通过WHO和国家脊灰实验室盲样标本的能力验证和现场认证评估，细胞系敏感性均达到WHO的要求。结论 河北省脊灰实验室运转良好，细胞系敏感、有效，河北省继续保持无脊灰状态。 河北省已连续18年未发现脊灰野病毒，一直处于维持无脊髓灰质炎（脊灰）阶段。河北省脊灰实验室主要承担全省11个市疾病预防控制中心（CDC）送检的急性弛缓性麻痹（AFP）病例及其接触者粪便标本的病原学监测，脊灰病毒(PV及其他病毒（NPEV）的分离，对阳性毒株进行血清型鉴定，所有PV阳性分离物送国家脊灰实验室进行型内鉴定，监测可能出现的疫苗衍生病毒（Vaccine-derived PV,VDPV）或输入性脊灰野病毒，为维持无脊灰状态提供实验室依据，现将2001-2009年河北省脊灰实验室运转情况分析如下。 1 材料与方法 1.1 资料来源 2001-2009年全省11个市上报的AFP病例监测资料；病毒分离与鉴定结果来自河北省脊灰实验室及中国CDC病毒病预防控制所国家脊灰实验室。 1.2 病毒分离与鉴定 由河北省脊灰实验室按照《WHO脊灰实验室手册》第四版规定的标准方法[1]，采用RD、L20B及Hep-2（2007年以后采用RD、L20B细胞）细胞进行病毒分离鉴定。对未采集到合格粪便标本的病例要求采集5份密切接触者的粪便标本，5份粪便标本混在一起（自消灭脊灰以来一直是合在一起，没有相关的文件）进行病毒分离与鉴定。细胞由中国CDC病毒病预防控制所国家脊灰实验室提供。脊灰诊断标准血清由WHO合作中心荷兰国家公共健康和环境研究院（RIVM）提供。 1.3 病毒型别的复合与型内鉴别诊断 中国疾病预防控制中心国家脊灰实验室采用WHO推荐的PCR-RFLP及ELISA法做型内鉴定，对型内鉴定异常株或直接进行VP1区基因核苷酸序列测定与分析。 1.4 统计分析 资料采用Microsoft Excel 2003软件进行资料分析、统计。 2 结果 2.1 AFP病例粪便标本分离PV及血清型鉴定 2001-2009年河北省脊灰实验室共收到3422例AFP病例粪便标本， PV分离及血清型鉴定情况见表1。 2.2 AFP病例接触者粪便标本分离PV及血清型鉴定 2001-2009年对282例AFP病例密切接触者采集了粪便标本，分离出PV的25例，年均分离率为8.9%。其中Ⅰ型5例，Ⅱ型6例，Ⅲ型5例，PV混合型9例， PV+NPEV2例，分别占20.0%、24.0%、20.0%、36.0%和8.0%。 2.3 AFP病例及其接触者粪便标本分离NPEV情况 3422例AFP病例中分离出NPEV的368例，年均分离率为10. 8%。；282例AFP病例接触者分离出NPEV 的64例，年均分离率为22.7%例（表2）。 2.4 病毒型别的复合与型内鉴别诊断 病例及其接触者粪便标本中分离的所有PV株均送国家脊灰实验室进行血清型复合，结果定型准确率为100%。2001~2006年国家脊灰实验室对所有PV株采用ELISA 和PCR-RFLP方法进行型内鉴定，并对ELISA法鉴别为双反应株（我省没有非疫苗类似株）及PCR-RFLP鉴定为疫苗变异株进一步做VP1区基因核苷酸序列测定与分析， 2007~-2009年由于两种试剂短缺对PV株直接进行VP1区基因核苷酸序列测定与分析，2001~2009年河北省未发现VDPV。 2.5 河北省脊灰实验室的质量控制 2.5.1 接受WHO和国家脊灰实验室的能力验证 河北省脊灰实验室每年接受WHO和国家脊灰实验室关于病毒分离的1组5份盲样标本（2001~2003年由国家脊灰实验统一制备，2004年至今由WHO统一制备，国家脊灰实验室统一分发）的能力验证项目，按照《WHO脊灰实验室手册》第4版的要求进行病毒分离与鉴定，在接收到考核标本后28d完成，均以满分的成绩通过。 2.5.2 接受WHO和国家脊灰实验室专家的现场认证考核 河北省脊灰实验室每两年接受WHO和国家脊灰实验室专家现场认证。主要从实验室布局，实验仪器使用与维护、细胞形态，PV定型情况等多方面进行了现场考核，平均成绩均在97分以上，得到了专家认可。 2.5.3 细胞敏感性评价 河北省脊灰实验室于2005年按照《脊灰实验室手册》方法和要求制备了实验室质量控制标准毒株（QC）。自2006年按照WHO和国家脊灰实验室要求进行两种细胞系的敏感性常规检测，与QC株的平均滴度的波动均在±0.5 log10CCID50/0.1ml (表3)，说明河北省细胞系敏感、有效。 3 讨论 2001-2009年河北省脊灰实验室共收到3422例AFP病例粪便标本，PV年均分离率为8.2%，AFP病例接触者PV年均分离率为8.9%，AFP病例NPEV年均分离率为10.8%，接触者NPEV年均分离率为22.7%。数据显示：河北省自2004年以来PV分离率有下降趋势，与全国各省PV分离情况相同。PV单型别中PV型别主要以Ⅱ型为主，占31.4%，与有关报道一致[2] ，AFP病例及其接触者中PV混合型分离率最高。NPEV分离率比较平稳，继续保持在较高水平，但2008、2009年有明显上升趋势，说明这两年肠道病毒有流行趋势。 数据显示：AFP病例接触者粪便标本PV、NPEV分离率均较高，NPEV尤为明显，由于每个病例接触者的5份粪便标本是混在一起进行病毒分离与鉴定，分离率可能存在一定的误差。但是，随着消灭脊灰的进展，NPEV感染引起的麻痹越来越引起关注，对AFP病例NPEV感染进行分析，研究其病毒学、流行病学及临床特征，对揭示无脊灰后NPEV对儿童健康的危害性，对急性弛缓性麻痹的预防诊断治疗可提供重要的参考依据。目前许多国家都在开展PV的环境监测，监测结果表明，PV的环境监测不仅具有较高的的敏感性，而且相对于AFP监测系统来说，更能真实反映环境中PV的存在及循环状况[3、4]，维持无脊灰状态，有必要开展健康人群的病原学监测。。 河北省脊灰实验室每年接受WHO和国家脊灰实验室的能力验证项目及两年一次现场考核认证，均以优秀的成绩通过，得到WHO和国家脊灰实验室专家组的一致认可和高度评价。同时，随着全球完成消灭脊灰目标实现日期的推迟，维持无脊灰工作的难度越来越大[5]，脊灰实验室高质量监测对及时发现输入性脊灰野病毒或VDPV起至关重要的作用。细胞敏感性是脊灰实验室质量保证体系中的重要组成部分，只有当实验室质量控制标准毒株已制备好，并且滴度已确定，滴度结果具有可重复性时，才能开展细胞敏感性常规监测[6]。河北省细胞系一直敏感、有效，为从细胞中扩增出低滴度的脊灰病毒提供了技术保障，防止假阴性的病毒分离结果的产生，为维持无脊灰状态提供了可靠的实验室数据。每年PV定型准确率为100%，所有送检的PV阳性分离物型内鉴定或进行VP1区基因核苷酸序列测定与分析，未发现脊灰野病毒或VDPVs的发生。 自2001年以来河北省脊灰实验室运转良好，实验室监测系统敏感，数据可靠、有效，河北省脊灰实验室保持在高水平，为维持无脊灰状态提供了可靠的质量保证。