不同类型 Ｈ５ 亚型禽流感疫苗的免疫保护效力比较研究

中国农业科技导报， ２０１４， １６（１）：４６－５１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 　 收稿日期：２０１４⁃０１⁃０９；接受日期：２０１４⁃０１⁃１３ 　 基金项目：国家科技重大专项（２０１２ＺＸ１０００４２１４）；哈尔滨市科技攻关计划项目（２０１１ＡＡ６ＢＮ０１９）资助。 　 作者简介：赵双成，硕士研究生，主要从事禽流感基因疫苗研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｓｈｕａｎｇｃｈｅｎｇｚｈａｏ＠ １６３．ｃｏｍ。 ∗通信作者：姜永萍，副 研究员，博士，主要从事禽流感基因工程疫苗研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｙｏｎｇｐｉｎｇ＠ ｃａａｓ．ｃｎ； 陈化兰，研究员，博士，主要从事动物 流感基础与防控研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｈｕａｌａｎ＠ ｃａａｓ．ｃｎ 不同类型 Ｈ５亚型禽流感疫苗的免疫保护效力比较研究 赵双成１，２，　 柳金雄１，２，　 陈普成１，２，　 曾显营１，２，　 葛金英２，３， 乔传玲１，２，　 田国彬１，２，　 姜永萍１，２∗，　 陈化兰１，２∗ （１．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室， 哈尔滨 １５０００１； ２．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室， 哈尔滨 １５０００１； ３．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部人兽共患病重点开放实验室， 哈尔滨 １５０００１） 摘　 要：为比较以我国首个 Ｈ５亚型禽流感病毒分离株 Ａ ／ Ｇｏｏｓｅ ／ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ／ １ ／ １９９６（Ｈ５Ｎ１）［ＧＳ ／ ＧＤ ／ ９６］为基 础构建的新型重组禽流感病毒灭活疫苗（Ｈ５Ｎ１亚型，Ｒｅ⁃１株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（Ｈ５ 亚型）、 禽流感、新城疫重组二联活疫苗（ｒＬＨ５⁃１株）以及禽流感 ＤＮＡ 疫苗（Ｈ５ 亚型，ｐＨ５⁃ＧＤ）的免疫保护效力。 分 别将四种禽流感疫苗以 ２．８ μｇ ＨＡ ／ ０．３ ｍＬ（肌肉注射）、１０３ＰＦＵ ／ １００ μＬ（刺种）、１０６ＥＩＤ５０ ／ １００ μＬ（滴鼻、点 眼）、１５ μｇ ／ ２００ μＬ（肌肉注射）等不同剂量和方式免疫 ３周龄 ＳＰＦ鸡，首次免疫 ３周后再加强免疫一次，加强 免疫 ２周后用 １０６ＥＩＤ５０的高致病力禽流感病毒（ＨＰＡＩＶ） ＧＳ ／ ＧＤ ／ ９６ 鼻腔途径进行攻击，观察发病与死亡情 况。 分别于攻毒后第 ３ ｄ、第 ５ ｄ、第 ７ ｄ采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况，同时检测 免疫及攻毒后血清 ＨＩ抗体的动态变化。 所有疫苗均可对免疫鸡形成 １００％完全保护（不发病、不致死、不排 毒）；在病毒攻击前，灭活疫苗（Ｈ５Ｎ１亚型，Ｒｅ⁃１株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（Ｈ５亚型）、禽流感、新 城疫重组二联活疫苗（ｒＬＨ５⁃１株）以及禽流感 ＤＮＡ 疫苗（Ｈ５ 亚型，ｐＨ５⁃ＧＤ）所诱导的 ＨＩ 抗体平均水平分别 为 ８􀆰 ７５ｌｏｇ２、６．５ｌｏｇ２、５．１３ｌｏｇ２和 ７．８８ｌｏｇ２。 新型的基因工程疫苗具有良好的免疫保护性，已经或将在 Ｈ５ 亚型 ＨＰＡＩＶ的防治实践中起到有益的补充作用。 关键词：禽流感；Ｈ５Ｎ１；疫苗；保护效力 ｄｏｉ：１０．１３３０４ ／ ｊ．ｎｙｋｊｄｂ．２０１４．０２５ 中图分类号：Ｓ８５４．４３　 　 　 文献标识码：Ａ　 　 　 文章编号：１００８⁃０８６４（２０１４）０１⁃００４６⁃０６ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｍｏｎｇ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｈ５ Ｓｕｂｔｙｐｅ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＺＨＡＯ Ｓｈｕａｎｇ⁃ｃｈｅｎｇ１，２， ＬＩＵ Ｊｉｎ⁃ｘｉｏｎｇ１，２， ＣＨＥＮ Ｐｕ⁃ｃｈｅｎｇ１，２， ＺＥＮＧ Ｘｉａｎ⁃ｙｉｎｇ１，２， ＧＥ Ｊｉｎ⁃ｙｉｎｇ２，３， ＱＩＡＯ Ｃｈｕａｎ⁃ｌｉｎｇ１，２， ＴＩＡＮ Ｇｕｏ⁃ｂｉｎ１，２， ＪＩＡＮＧ Ｙｏｎｇ⁃ｐｉｎｇ１，２∗， ＣＨＥＮ Ｈｕａ⁃ｌａｎ１，２∗ （１．Ａｎｉｍａｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｈａｒｂｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈａｒｂｉｎ １５０００１； ２．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈａｒｂｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ＣＡＡＳ， Ｈａｒｂｉｎ １５０００１； ３．Ｚｏｏｎｏｓｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｈａｒｂｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ＣＡＡＳ， Ｈａｒｂｉｎ １５０００１， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｉｅｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ， ｉｎａｃｔｉｖｅｄ （Ｈ５Ｎ１ ｓｕｂｔｙｐｅ， ｓｔｒａｉｎ Ｒｅ⁃１）， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｏｗｌｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ⁃ ｂａｓｅｄ ｌｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ（Ｈ５ ｓｕｂｔｙｐｅ）， ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ａｎｄ ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ， ｌｉｖｅ（Ｓｔｒａｉｎ ｒＬＨ５⁃１） ａｎｄ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ（Ｈ５ Ｓｕｂｔｙｐｅ， ｐＨ５⁃ＧＤ）， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ Ｈ５Ｎ１ ｉｓｏｌａｔｅ Ａ ／ Ｇｏｏｓｅ ／ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ／ １ ／ １９９６（Ｈ５Ｎ１） ［ＧＳ ／ ＧＤ ／ ９６］． Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ３⁃ｗｅｅｋ⁃ｏｌｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ （ ＳＰＦ） ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｗｅｒｅ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｌｙ ｉｎｊｅｃｔｅｄ （ ２． ８ μｇ ＨＡ ／ ０． ３ ｍＬ）， ｖｉａ ｗｉｎｇ⁃ｗｅｂ ｐｕｎｃｔｕｒｅ （ １０３ ＰＦＵ ／ １００ μＬ）， ｏｃｕｌｏｎａｓａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ （１０６ ＥＩＤ５０ ／ １００ μＬ） ａｎｄ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｌｙ ｉｎｊｅｃｔｅｄ （ １５ μｇ ／ ２００ μＬ） ｗｉｔｈ ｆｏｕｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｈ５ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｂｏｏｓｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｄｏｓａｇｅ ａｆｔｅｒ ｔｈｒｅｅ ｗｅｅｋｓ． Ａｌｌ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｗｅｒｅ ｎａｓａｌｌｙ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ ｗｉｔｈ １０６ＥＩＤ５０ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ （ＨＰＡＩＶ） ＧＳ ／ ＧＤ ／ ９６ ａｔ ｔｗｏ ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｂｏｏｓｔ． Ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ａｎｄ ｃｌｏａｃａｌ ｓｗａｂｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｌｌ ｇｒｏｕｐｓ ａｔ ３ ｄ， ５ ｄ ａｎｄ ７ ｄ ｐｏｓｔ ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｆｏｒ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏ ｅｇｇｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｄａｉｌｙ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｉｇｎｓ ａｎｄ ｄｅａｔｈｓ ｆｏｒ ２ ｗｅｅｋｓ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ， ｓｅｒａ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｗｅｅｋｌｙ ａｆｔｅｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ （ＨＩ） ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｓ， ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｂｙ ｎｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｉｇｎｓ， ｎｏ ｄｅａｔｈ， ａｎｄ ｎｏ ｖｉｒｕｓ ｓｈｅｄｄｉｎｇ， ｗｅｒｅ ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ ｉｎ ａｌｌ ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｇｒｏｕｐｓ． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ＨＩ ｔｉｔｅｒｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｗｅｒｅ ８􀆰 ７５ｌｏｇ２， ６．５ｌｏｇ２， ５．１３ｌｏｇ２ ａｎｄ ７．８８ｌｏｇ２ ｂｅｆｏｒｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｏｕｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ａｌｌ ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｗｅｒｅ ａｂｌｅ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｈｉｇｈｌｙ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｉｅｓ ｉｎ ＳＰＦ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ａｎｄ ｈａｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｈ５Ｎ１ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｉｎ ｐｒａｔｉｃｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ； Ｈ５Ｎ１； ｖａｃｃｉｎｅ； ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ 　 　 近年来，Ｈ５Ｎ１ 亚型高致病性禽流感病毒 （ｈｉｇｈｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ，ＨＰＡＩＶ） 在世界范围内造成养禽业巨大的经济损失，同时 对全球公共卫生构成严重威胁［１］。 截至 ２０１３ 年 １２月，Ｈ５Ｎ１ 亚型 ＨＰＡＩＶ 已经导致 ６４８ 人感染， ３８４人死亡，死亡率超过 ５９．２６％，其中我国 ４５ 人 感染，３０人死亡［２］。 １９９６年，我国首次从广东省的鹅体内分离到 Ｈ５Ｎ１ 亚 型 ＨＰＡＩＶ Ａ ／ Ｇｏｏｓｅ ／ ＧｕａｎｇＤｏｎｇ ／ １ ／ ９６ （Ｈ５Ｎ１）［ＧＳ ／ ＧＤ ／ ９６］，为我国最早分离到的 Ｈ５ 亚型 ＨＰＡＩＶ［３］。 大量的研究证明， Ｈ５ 亚型高致 病力禽流感病毒均与 ＧＳ ／ ＧＤ ／ ９６ 密切相关，作为 主要免疫原的 ＨＡ基因同源性很高［４］。 疫苗免疫是禽流感防控的关键措施之一，我 国是国际上最早使用疫苗防治 ＨＰＡＩＶ的国家［５］。 农业部动物流感重点开放实验室先后以 ＧＳ ／ ＧＤ ／ ９６株为基础，成功构建了新型重组禽流感病毒灭 活疫苗（Ｈ５Ｎ１ 亚型，Ｒｅ⁃１ 株）、禽流感重组鸡痘 病毒载体活疫苗（Ｈ５ 亚型）、禽流感和新城疫重 组二联活疫苗（ｒＬＨ５⁃１株）以及禽流感 ＤＮＡ 疫苗 （Ｈ５ 亚型，ｐＨ５⁃ＧＤ） （其有效成份为 ＤＮＡ 质粒 ｐＣＡＧＧｏｐｔｉＨＡ）。 其中新型重组禽流感病毒灭活 疫苗（Ｈ５Ｎ１ 亚型，Ｒｅ⁃１ 株）、禽流感重组鸡痘病 毒载体活疫苗（Ｈ５ 亚型）、禽流感、新城疫重组二 联活疫苗（ ｒＬＨ５⁃１ 株）已先后应用于我国的禽流 感防治实践，并为我国 ＨＰＡＩＶ的有效防控发挥了 重要作用［６～９］，禽流感 ＤＮＡ 疫苗（Ｈ５ 亚型，ｐＨ５⁃ ＧＤ）正在进行新兽药证的注册申请［１０，１１］，并即 将得到推广和应用。 以 ＧＳ ／ ＧＤ ／ ９６ ＨＡ基因作为免疫原基因，其良 好免疫原性的突出特点已得到证实，但不同类型 的 Ｈ５亚型禽流感疫苗具有各自不同的特性。 因 此，本研究将基于 ＧＳ ／ ＧＤ ／ ９６株的不同类型的 Ｈ５ 亚型禽流感疫苗的免疫效力做了比较，以期为禽 流感 ＤＮＡ 疫苗（Ｈ５ 亚型，ｐＨ５⁃ＧＤ）的产业化应 用、不同类型 Ｈ５ 亚型禽流感疫苗的有效联合免 疫策略提供一定的思路。 １　 材料与方法 １．１　 实验材料 攻毒用 Ｈ５亚型 ＨＰＡＩＶ Ａ ／ Ｇｏｏｓｅ ／ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ／ １ ／ １９９６（Ｈ５Ｎ１） ［ＧＳ ／ ＧＤ ／ ９６］、ＧＳ ／ ＧＤ ／ ９６ 的阳性 抗原以及免疫阳性血清均由本实验室保存。 不同 类型的 Ｈ５亚型禽流感疫苗：重组禽流感病毒灭 活疫苗（Ｈ５Ｎ１ 亚型，Ｒｅ⁃１ 株）、禽流感重组鸡痘 病毒载体活疫苗（Ｈ５ 亚型）、禽流感、新城疫重组 二联活疫苗（ ｒＬＨ５⁃１ 株）以及禽流感 ＤＮＡ 疫苗 （Ｈ５亚型，ｐＨ５⁃ＧＤ）也由本实验室制备并保存。 ＳＰＦ鸡胚和 ＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）鸡由哈尔 滨兽医研究所实验动物中心提供，３ 周龄 ＳＰＦ 鸡 实验期间饲养于禽病感染实验室的负压隔离器中。 １．２　 对 ＳＰＦ鸡的免疫保护试验 将 ３周龄 ＳＰＦ鸡随机分为 ５组，每组 ８只，第 １组为重组禽流感病毒灭活疫苗（Ｈ５Ｎ１ 亚型，Ｒｅ⁃ １株）免疫组，以 ２．８ μｇ ＨＡ ／ ０．３ ｍＬ体积胸部肌肉 注射；第 ２组为禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗 （Ｈ５亚型）免疫组，以 １００ μＬ（１０３ ＰＦＵ）体积用刺 种针在翅膀内侧无血管处皮下刺种；第 ３ 组为禽 流感、新城疫重组二联活疫苗（ ｒＬＨ５⁃１ 株）免疫 组，以 １００ μＬ（１０６ＥＩＤ５０）体积滴鼻、点眼；第 ４ 组 为禽流感 ＤＮＡ 疫苗（Ｈ５ 亚型，ｐＨ５⁃ＧＤ）免疫组， 以 ２００ μＬ（１５ μｇ）体积腿肌两点肌肉注射；第 ５ 组对照组，注射 ２００ μＬ ＰＢＳ溶液（ｐＨ ７．２，磷酸二 氢钾０．２４ ｇ，磷酸氢二钠 １．４４ ｇ，氯化钠 ８．０ ｇ，氯 化钾 ０􀆰 ２ ｇ，用双蒸水定容到 １Ｌ）。 所有免疫组的 鸡在 ３周龄首次免疫，首次免疫后 ３ 周以同样剂 ７４１期 赵双成等：不同类型 Ｈ５亚型禽流感疫苗的免疫保护效力比较研究 量和方式加强免疫。 在加强免疫后 ２ 周分别用 １０６ＥＩＤ５０的 ＧＳ ／ ＧＤ ／ ９６ ＨＰＡＩＶ 经鼻腔途径感染， ０．１ ｍＬ ／只，攻毒后 ２周内每天观察鸡只的发 病和死亡情况，并根据死亡数统计死亡率。 对每 组试验鸡在免疫和攻毒后每周采集其翅静脉血， 分离血清，按照国标 《高致病性禽流感诊断技 术》 ［１２］ 所述 微 量 血 凝 抑 制 （ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ＨＩ）方法测定其 ＨＩ 抗体滴度。 在攻毒 后第 ３ ｄ、第 ５ ｄ 和第 ７ ｄ采集每组鸡的泄殖腔拭 子和喉头拭子，将每个拭子 １０倍连续稀释至适当 稀释度，每个稀释度经尿囊腔接种 ３枚 １０日龄鸡 胚，０．１ｍＬ ／枚，４８ ｈ收集尿囊液，微量血凝法检测， 并用 Ｒｅｅｄ ＄ Ｍｕｅｎｃｈ法计算其病毒分离的滴度。 ２　 结果与 ２．１　 不同类型 Ｈ５ 亚型禽流感疫苗免疫及强毒 攻击后的 ＨＩ抗体反应 表 １和图 １所示为不同类型禽流感疫苗免疫 后 ＨＩ抗体反应，可以看出重组禽流感病毒灭活疫 苗（Ｈ５Ｎ１亚型，Ｒｅ⁃１株）免疫后第 １周，有 ５只鸡 产生了可检测的 ＨＩ 抗体，其平均 ＨＩ 抗体水平为 １．３８ｌｏｇ２，在免疫后第 ２ 周，所有免疫鸡均产生了 ＨＩ抗体，且平均 ＨＩ 抗体即可高达 ５．８５ｌｏｇ２，在免 疫后第 ３周，平均 ＨＩ抗体水平为 ７．２５ｌｏｇ２，在加强 免疫后，ＨＩ抗体平均水平上升至８．７５ｌｏｇ２ ，在用 表 １　 不同类型禽流感疫苗免疫后 ＨＩ抗体转阳情况 Ｔａｂｌｅ １　 ＨＩ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ． 组别 Ｇｒｏｕｐｓ 免疫原 Ｖａｃｃｉｎｅ 剂量 Ｄｏｓｅ 免疫后时间（周）∗ Ｐｏｓｔ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｂｏｏｓｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ（ｗｅｅｋｓ） １ ２ ３† ４ ５ １ 灭活疫苗 Ｉｎａｃｔｉｖｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ２．８ μｇ ＨＡ ／ ０．３ ｍＬ ５ ／ ８ ８ ／ ８ ８ ／ ８ ８ ／ ８ ８ ／ ８ ２ 禽痘活疫苗 ｒＦＰＶ ｌｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ １０３ＰＦＵ ／ １００ μＬ ８ ／ ８ ８ ／ ８ ８ ／ ８ ８ ／ ８ ８ ／ ８ ３ 新禽二联活疫苗 ｒＮＤＶ ｌｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ １０６ＥＩＤ５０ ／ １００ μＬ ７ ／ ８ ８ ／ ８ ８ ／ ８ ８ ／ ８ ８ ／ ８ ４ ＤＮＡ疫苗 ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ １５ μｇ ／ ２００ μＬ ４ ／ ８ ６ ／ ８ ８ ／ ８ ８ ／ ８ ８ ／ ８ ５ ＰＢＳ ２００ μＬ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ 　 ∗表示方法为 ＨＩ抗体转阳鸡数 ／免疫鸡总数。†加强免疫。 ∗ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｓ ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒ ／ ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ． † Ｂｏｏｓｔｅｒ． 图 １　 不同类型禽流感疫苗免疫后的 ＨＩ抗体滴度 Ｆｉｇ．１　 ＨＩ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒｓ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ． ８４ 中 国 农 业 科 技 导 报 １６卷 ＨＰＡＩＶ攻击后，ＨＩ抗体平均水平没有明显的变化。 禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（Ｈ５ 亚型） 免疫后第 １周，所有免疫鸡均可检测到 ＨＩ 抗体， 平均水平可达 ３．６３ｌｏｇ２，其诱导的 ＨＩ 抗体水平在 免疫后第 ２ 周和第 ３ 周维持在 ４． ００ｌｏｇ２ ～ ４􀆰 ２５ｌｏｇ２，加强免疫后，ＨＩ 抗体平均水平攀升，达 到 ６．５０ｌｏｇ２，再用 ＨＰＡＩＶ 攻击后，ＨＩ 抗体平均水 平略有升高。 禽流感、新城疫重组二联活疫苗（ｒＬＨ５⁃１株） 免疫后第 １周，ＨＩ抗体阳转率为 ７ ／ ８，平均水平为 ３．００ｌｏｇ２，ＨＩ抗体平均水平在免疫后第 ２ 周和第 ３ 周分别为 ３．３８ｌｏｇ２和 ４．１３ｌｏｇ２，在加强免疫后，ＨＩ 抗体平均水平上升至 ５．１３ｌｏｇ２， ＨＩ 抗体平均水平 在用 ＨＰＡＩＶ攻击后的第 ２周有轻微下降。 禽流感 ＤＮＡ疫苗（Ｈ５亚型，ｐＨ５⁃ＧＤ）免疫后 第 １ 周，ＨＩ 抗体阳转率为 ４ ／ ８，平均水平仅为 １􀆰 １３ｌｏｇ２，在免疫后第 ２ 周，有 ６ 只鸡可以检测到 ＨＩ抗体，其平均水平为 １． ７５ｌｏｇ２，在免疫后第 ３ 周，所有免疫鸡的 ＨＩ 抗体阳转，平均水平为 ２􀆰 ７５ｌｏｇ２，在加强免疫后，ＨＩ抗体水平出现了明显 的攀升，平均水平可达 ７．１３ｌｏｇ２，病毒攻击前高达 ７．８８ｌｏｇ２，用 ＨＰＡＩＶ攻击后第 １周，ＨＩ抗体水平有 所下降，再病毒攻击后的第 ２ 周，ＨＩ 抗体水平有 所攀升。 ２．２　 病毒分离滴定结果 将采集的拭子按 １０ 倍倍比稀释后接种 ＳＰＦ 鸡胚，进行病毒分离和滴定。 结果显示，所有免疫 组诱导了完全的免疫保护，在病毒攻击后完全抑 制了病毒的复制；而对照组鸡在病毒攻击后 ３ ｄ 内全部死亡（表 ２）。 ２．３　 发病和死亡情况 Ｈ５Ｎ１亚型高致病性病毒攻击后的观察期限 为 ２周，所有对照鸡在攻毒后 ３ ｄ 之内全部发病 并死亡。 重组禽流感病毒灭活疫苗（Ｈ５Ｎ１ 亚型， Ｒｅ⁃１株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（Ｈ５ 亚型）、禽流感、新城疫重组二联活疫苗（ ｒＬＨ５⁃１ 株）以及禽流感 ＤＮＡ 疫苗（Ｈ５ 亚型，ｐＨ５⁃ＧＤ）免 疫组的所有免疫鸡在用高致病性病毒攻击后无发 病、无死亡，其死亡保护率均为 １００％（表 ３）。 表 ２　 不同类型禽流感疫苗免疫 ＳＰＦ鸡用 ＨＰＡＩＶ攻击后病毒分离及滴定结果 Ｔａｂｌｅ ２　 Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｆｔｅｒ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ＨＰＡＩＶ． 免疫原 Ｖａｃｃｉｎｅ 剂量 ｄｏｓｅ 病毒分离阳性鸡 ／存活鸡（滴度：ｌｏｇＥＩＤ５０） Ｖｉｒｕｓ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ／ ｓｕｒｖｉｖｏｒｓ（ｔｉｔｅｒｓ：ｌｏｇＥＩＤ５０） ３ ｄ 喉头 Ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ 泄殖腔 Ｃｌｏａｃａｌ ５ ｄ 喉头 Ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ 泄殖腔 Ｃｌｏａｃａｌ ７ ｄ 喉头 Ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ 泄殖腔 Ｃｌｏａｃａｌ 灭活疫苗 Ｉｎａｃｔｉｖｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ２．８ μｇ ＨＡ ／ ０．３ ｍＬ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ 禽痘活疫苗 ｒＦＰＶ ｌｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ １０ ３ＰＦＵ ／ １００ μＬ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ 新禽二联活疫苗 ｒＮＤＶ ｌｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ １０ ６ＥＩＤ５０ ／ １００ μＬ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ＤＮＡ疫苗 ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ １５ μｇ ／ ２００ μＬ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ＰＢＳ ２００ μＬ － － － － － － 　 －：鸡只死亡。 －： Ｔｈｅ ｃｈｉｃｋｅｎ ｄｉｅｄ． ３　 讨论 目前，我国已经成功研制的 Ｈ５ 亚型禽流感 疫苗主要包括重组禽流感病毒灭活疫苗［６］、禽流 感重组鸡痘病毒载体活疫苗［７，８］、禽流感、新城疫 重组二联活疫苗［９］，正在研制的 Ｈ５ 亚型禽流感 疫苗主要包括禽流感 ＤＮＡ 疫苗［１０，１１］、禽流感鸭 瘟二联活疫苗［１３，１４］等。 不同类型的禽流感疫苗 具有不同的特性［１５］ 。禽流感灭活疫苗由于其抗 ９４１期 赵双成等：不同类型 Ｈ５亚型禽流感疫苗的免疫保护效力比较研究 表 ３　 不同类型禽流感疫苗免疫 ＳＰＦ鸡用 Ｈ５Ｎ１ ＨＰＡＩＶ攻击后发病与死亡情况 Ｔａｂｌｅ ３　 Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＰＦ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ Ｈ５Ｎ１ ＨＰＡＩＶ ｓｔｒａｉｎ． 组别 Ｇｒｏｕｐｓ 免疫原 Ｖａｃｃｉｎｅ 剂量 Ｄｏｓｅ 发病数 ／鸡总数 Ｓｉｃｋ ／ Ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ 死亡数 ／鸡总数 Ｄｅａｔｈ ／ Ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ 保护率（存活 ／总数） Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ （Ｓｕｒｖｉｖａｌ ／ Ｔｏｔａｌ） １ 灭活疫苗Ｉｎａｃｔｉｖｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ２．８ μｇ ＨＡ ／ ０．３ ｍＬ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ８ ／ ８ ２ 禽痘活疫苗ｒＦＰＶ ｌｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ １０ ３ＰＦＵ ／ １００ μＬ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ８ ／ ８ ３ 新禽二联活疫苗ｒＮＤＶ ｌｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ １０ ６ＥＩＤ５０ ／ １００ μＬ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ８ ／ ８ ４ ＤＮＡ疫苗ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ １５ μｇ ／ ２００ μＬ ０ ／ ８ ０ ／ ８ ８ ／ ８ ５ ＰＢＳ ２００ μＬ ８ ／ ８ ８ ／ ８ ０ ／ ８ 原组分齐全、免疫原性强而能诱导产生高水平的 ＨＩ抗体和确实有效的免疫保护，在禽流感的防控 中发挥着重要的作用，但却不能诱导产生细胞免 疫反应，也不利于疫病的流行病学调查，其油佐剂 对某些禽种具有一定的副作用。 新型的基因工程 疫苗仅表达禽流感病毒的 ＨＡ 基因，免疫后能同 感染鸡进行鉴别，不影响疾病的流行病学普查。 活载体疫苗能快速有效诱导机体产生 ＨＩ抗体，也 能诱导特异的细胞免疫反应，生产成本低，但其感 染免疫可引起炎症反应，以前免疫产生的抗体可 能会干扰免疫效果［１６，１７］。 ＤＮＡ 疫苗不仅具有与 活载体疫苗一样可以有效激发特异抗体反应与 ＣＴＬ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）细胞免疫的优点，还具 有高度安全稳定、可反复加强免疫、诱导的免疫应 答时间长的优点，也易于构建成联合疫苗、多价疫 苗或嵌合疫苗， 具有更广泛的交叉保护作 用［１８，１９］；与灭活疫苗相比，ＤＮＡ疫苗对环境友好， 不依赖于鸡胚，可以大规模的通过大肠杆菌增殖 生产疫苗，ＤＮＡ 疫苗具有更高的安全性，水剂剂 型不会在接种后引起腹膜炎和其他副作用，不会 影响蛋鸡产蛋和肉鸡肉质，ＤＮＡ 疫苗具有良好的 开发和应用前景。 我国第一株 Ｈ５ 亚型禽流感病毒 ＧＳ ／ ＧＤ ／ ９６ 具有很好的抗原性和免疫原性，也是进行疫苗研 究的模型毒株和良好的 ＨＡ 基因供体毒株。 为了 比较不同类型禽流感疫苗的免疫保护效力，本研 究将表达 ＧＳ ／ ＧＤ ／ ９６ ＨＡ 基因的重组禽流感病毒 灭活疫苗（Ｈ５Ｎ１ 亚型，Ｒｅ⁃１ 株）、禽流感重组鸡 痘病毒载体活疫苗（Ｈ５ 亚型）、禽流感、新城疫重 组二联活疫苗（ｒＬＨ５⁃１株）以及禽流感 ＤＮＡ 疫苗 （Ｈ５ 亚型，ｐＨ５⁃ＧＤ）分别免疫 ３ 周龄 ＳＰＦ 鸡， ３ 周后加强免疫，加强免疫后 ２ 周后用 １０６ＥＩＤ５０的 ＨＰＡＩＶ ＧＳ ／ ＧＤ ／ ９６ 鼻腔途径进行攻击，结果显示 所有疫苗均可对免疫鸡提供 １００％完全保护（不 发病、不致死、不排毒）；在病毒攻击前，所诱导的 ＨＩ 抗体平均水平分别为 ８． ７５ｌｏｇ２、 ６． ５０ｌｏｇ２、 ５􀆰 １３ｌｏｇ２和 ７．８８ｌｏｇ２。 结果表明，新型的基因工程 疫苗具有良好的免疫保护性，已经或将在 Ｈ５ 亚 型 ＨＰＡＩＶ的防治实践中起到有益的补充作用。 分析表明，不同类型的疫苗免疫后诱导 ＨＩ抗 体产生的速度、ＨＩ抗体水平以及对加强免疫的效 应均有不同。 禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗 （Ｈ５ 亚型）和禽流感、新城疫重组二联活疫苗 （ｒＬＨ５⁃１株）两种活载体疫苗在免疫后 １ 周就能 诱导几乎所有免疫鸡的 ＨＩ抗体阳转，且其诱导的 ＨＩ 抗体水平没有明显的个体差异，在加强免疫 后，ＨＩ 抗体水平却只有较小幅度的攀升，免疫产 生速度快是病毒活载体疫苗的优势所在，但活病 毒的特性又在一定程度上限制了必要的加强免 疫，这也可能是两种活载体疫苗加强免疫后诱导 的 ＨＩ抗体水平反而较低的原因［１６，１７］。 灭活疫苗 （Ｈ５Ｎ１亚型，Ｒｅ⁃１ 株）免疫后，ＨＩ 抗体产生速度 虽没有活载体疫苗快，但其诱导的 ＨＩ抗体水平上 升速度很快，在免疫后第 ２ 周明显高于活载体疫 苗诱导的 ＨＩ抗体，并且具有较为明显的加强免疫 效应。 禽流感 ＤＮＡ疫苗（Ｈ５亚型，ｐＨ５⁃ＧＤ）免疫 后诱导 ＨＩ抗体产生的速度较慢，ＨＩ 抗体水平也 相对来说比较低，但在第二次免疫后显示了加强 免疫的效应以及 ＤＮＡ 疫苗良好的初始免疫启动 效能，ＨＩ 抗体明显大幅度的攀升；ＤＮＡ 疫苗免疫 ０５ 中 国 农 业 科 技 导 报 １６卷 后不仅可以诱导产生体液免疫反应，也能诱导产 生针对免疫原基因的细胞免疫反应和记忆，这一 特性使得 ＤＮＡ疫苗免疫可以反复加强，进而确保 了疫苗免疫后坚实的免疫保护性和反应性。 ＤＮＡ 疫苗的免疫反应与病毒自然感染比较类似，具有 更广泛的交叉保护作用［１９］，其有效的免疫保护反 应和活病毒载体疫苗一样不完全依赖于高水平的 体液免疫反应抗体。 不同类型的疫苗特性不同，免疫反应机理不 同，免疫方式和有效剂量也不尽相同。 与传统的 灭活疫苗相比，活载体疫苗和 ＤＮＡ疫苗等新型基 因工程疫苗似乎更应该用适合于自身特性的有效 性体系来评价其免疫保护效果。 而对于 Ｈ５ 亚型禽流感这种感染宿主广泛复杂、病毒变异频 繁的疫病来说，只有多种疫苗制剂取长补短、优势 互补的联合应用，才能建立有效、全面、适用于各 种禽类免疫的坚实防控体系，切实保障我国养禽 业的健康发展。 有关不同类型疫苗对不同禽类的 免疫试验、不同类型疫苗的有效联合免疫试验等 已经进行或正在进行之中。 参　 考　 文　 献 ［１］ 　 Ｎｅｕｍａｎｎ Ｇ， Ｃｈｅｎ Ｈ， Ｇａｏ Ｇ Ｆ， ｅｔ ａｌ．． Ｈ５Ｎ１ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ： ｏｕｔｂｒｅａｋｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ［ Ｊ］ ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， ２０１０， ２０（１）：５１－６１． ［２］ 　 ＷＨＯ． Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｈｕｍａｎ ｃａｓｅｓ ｆｏｒ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ （Ｈ５Ｎ１） ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｔｏ ＷＨＯ， ２００３－ ２０１３． ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ．ｗｈｏ． ｉｎｔ ／ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ／ ｈｕｍａｎ ＿ ａｎｉｍａｌ ＿ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ／ ＥＮ ＿ ＧＩＰ ＿ ２０１３１２１０ＣｕｍｕｌａｔｉｖｅＮｕｍｂｅｒＨ５Ｎ１ｃａｓｅｓ．ｐｄｆ． ［３］ 　 陈化兰，于康震，步志高． 一株鹅源高致病力禽流感病毒分 离株血凝素基因的分析［Ｊ］ ．中国农业科学，１９９９，３２（２）：８７ －９２． Ｃｈｅｎ Ｈ Ｌ， Ｙｕ Ｋ Ｚ， Ｂｕ Ｚ Ｇ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ａ ｇｏｏｓｅ ｏｒｉｇｉｎ ｈｉｇｈｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ［ Ｊ］ ． Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ａｇｒｉｃ． Ｓｉｎ．， １９９９， ３２ （ ２）： ８７ －９２． ［４］ 　 Ｃｈｅｎ Ｈ． Ｈ５Ｎ１ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ［Ｊ］ ． Ｓｃｉ． Ｃｈｉｎａ Ｃ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．， ２００９， ５２（５）：４１９－４２７． ［５］ 　 Ｌｉ Ｙ， Ｓｈｉ Ｊ， Ｚｈｏｎｇ Ｇ， ｅｔ ａｌ．． Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ５Ｎ１ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｗｉｌｄ ｂｉｒｄｓ， ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｐｏｕｌｔｒｙ， ａｎｄ ｈｕｍａｎｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｆｒｏｍ ２００４ ｔｏ ２００９ ［ Ｊ］ ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ２０１０， ８４（１７）： ８３８９－８３９７． ［６］ 　 Ｔｉａｎ Ｇ， Ｚｈａｎｇ Ｓ， Ｌｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ．． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎｓ， ｇｅｅｓｅ ａｎｄ ｄｕｃｋｓ ｏｆ ａｎ Ｈ５Ｎ１⁃ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］ ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００５，３４１（１）：１５３－１６２． ［７］ 　 Ｑｉａｏ Ｃ， Ｙｕ Ｋ， Ｊｉａｎｇ Ｙ， ｅｔ ａｌ．． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｏｗｌｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ⁃ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｏｆ Ｈ５Ｎ１ ｓｕｂｔｙｐｅ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ［Ｊ］ ．Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． （Ｂａｓｅｌ）， ２００６， １２４：１２７－１３２． ［８］ 　 Ｑｉａｏ Ｃ， Ｊｉａｎｇ Ｙ， Ｔｉａｎ Ｇ， ｅｔ ａｌ．． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｏｗｌｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ⁃ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｆｒｏｍ Ｈ５Ｎ１ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ［ Ｊ］ ． Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，２００９，８１ （ ３）：２３４ －２３８． ［９］ 　 Ｇｅ Ｊ， Ｄｅｎｇ Ｇ， Ｗｅｎ Ｚ， ｅｔ ａｌ．． Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ⁃ｂａｓｅｄ ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｌｅｔｈａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｈ５Ｎ１ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］ ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，２００７，８１（１）：１５０－１５８． ［１０］ 　 Ｊｉａｎｇ Ｙ Ｐ， Ｙｕ Ｋ Ｚ， Ｚｈａｎｇ Ｈ Ｂ， ｅｔ ａｌ．． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｈ５ ｓｕｂｔｙｐｅ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｗｉｔｈ ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＨＡ ｇｅｎｅ ｉｎ ａ ｐＣＡＧＧＳ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ ［Ｊ］ ． Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．， ２００７， ７５： ２３４－２４１． ［１１］ 　 Ｌｉ Ｊ， Ｊｉａｎｇ Ｙ， Ｚｈａｏ Ｓ， ｅｔ ａｌ．． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｎ Ｈ５Ｎ１ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ａ ｌｅｔｈａｌ Ｈ５Ｎ１ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｑｕａｉｌ ［Ｊ］ ． Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．，２０１２，５６（Ｓ４）：９３７－９３９． ［１２］ 　唐秀英，李海燕，田国斌． ＧＢ ／ Ｔ １８９３６－２００３ 高致病性禽流 感诊断技术［Ｓ］ ．北京：中国标准出版社，２００３． Ｔａｎｇ Ｘ Ｙ， Ｌｉ Ｈ Ｙ， Ｔｉａｎ Ｇ Ｂ． ＧＢ ／ Ｔ １８９３６－２００３ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ［Ｓ］ ． Ｂｅｉｊｉｎｇ： Ｃｈｉｎａ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｈｏｕｓｅ， ２００３． ［１３］ 　 Ｌｉｕ Ｊ， Ｃｈｅｎ Ｐ， Ｊｉａｎｇ Ｙ， ｅｔ ａｌ．． Ａ ｄｕｃｋ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ⁃ｖｅｃｔｏｒｅｄ ｂｉｖａｌｅｎｔ ｌｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｆａｓｔ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｈ５Ｎ１ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｕｃｋｓ ［ Ｊ］ ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ２０１１， ８５（２１）：１０９８９－１０９９８． ［１４］ 　 Ｌｉｕ Ｊ， Ｃｈｅｎ Ｐ， Ｊｉａｎｇ Ｙ， ｅｔ ａｌ．． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｄｕｃｋ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｗｏｒｋｓ ａｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ⁃ｄｏｓｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｂｒｏｉｌｅｒｓ ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｒａｐｉｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｈ５Ｎ１ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ［ Ｊ ］ ． Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．， ２０１３， ９７（３）：３２９－３３３． ［１５］ 　 Ｒａｏ Ｓ Ｓ， Ｓｔｙｌｅｓ Ｄ， Ｋｏｎｇ Ｗ， ｅｔ ａｌ．． Ａ ｇｅｎｅ⁃ｂａｓｅｄ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｐｏｕｌｔｒｙ ［ Ｊ］ ． Ｐｏｕｌｔ． Ｓｃｉ，． ２００９， ８８（４）： ８６０－８６６． ［１６］ 　 Ｓｗａｙｎｅ Ｄ Ｅ， Ｂｅｃｋ Ｊ Ｒ， Ｋｉｎｎｅｙ Ｎ． Ｆａｉｌｕｒｅ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｏｗｌ ｐｏｘｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｇｅｎｅ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｐｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｆｏｗｌ ｐｏｘ ｖａｃｃｉｎｅ ［Ｊ］ ． Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．， ２０００， ４４（１）：１３２－１３７． ［１７］ 　乔传玲，李呈军，于康震，等． 禽痘病毒感染对禽流感重组 病毒疫苗免疫效力的影响［ Ｊ］ ． 中国预防兽医学报，２００５， ２７（２）：１５４－１５６． Ｑｉａｏ Ｃ Ｌ， Ｌｉ Ｃ Ｊ， Ｙｕ Ｋ Ｚ， ｅｔ ａｌ．． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｏｗｌｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｏｗｌｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ［Ｊ］ ． Ｃｈｉｎ． Ｊ． Ｐｒｅｖｅｎ． Ｖｅｔ． Ｍｅｄ．， ２００５，２７（２）：１５４ －１５６． ［１８］ 　 Ｌｉｕ Ｍ Ａ， Ｆｕ Ｔ Ｍ， Ｄｏｎｎｅｌｌｙ Ｊ Ｊ， ｅｔ ａｌ．． ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ： ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ［Ｊ］ ． Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．，１９９８， ４５２：１８７－１９１． ［１９］ 　 Ｋｏｄｉｈａｌｌｉ Ｓ， Ｈａｙｎｅｓ Ｊ Ｒ， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｈ Ｌ， ｅｔ ａｌ．． Ｃｒｏｓｓ － ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｌｅｔｈａｌ Ｈ５Ｎ２ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｏ ｔｈｅ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ［ Ｊ］ ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， １９９７， ７１ （５）：３３９１－３３９６． １５１期 赵双成等：不同类型 Ｈ５亚型禽流感疫苗的免疫保护效力比较研究