病毒分离培养的细胞培养法

病毒分离培养的细胞培养法 一、细胞培养用于病毒研究的优点： 细胞培养在病毒学方面的研究最为广泛，除用作病毒的病原分离外，还可研究病毒的繁殖过程及其细 胞的敏感性和传染性（细胞的病理变化及包涵体的形成）。观察病毒传染时细胞新陈代谢的改变，探讨抗 体与抗病毒物质对病毒的作用方式与机制，以及研究病毒干扰现象的本质和变异的规律性，可用于病毒的 分离鉴定，抗原的制备及疫苗，干扰素的生产、病毒性疾病诊断和流行病学调查等。近年来，可用于繁殖 病毒载体以用于基因治疗。 应用细胞培养来研究病毒有下列优点： 1、没有隐性感染：动物可能带有某些病毒的隐性感染，往往有干扰作用和假阳性出现。细胞培养一 方面是来源于动物部分组织，减少了隐性感染的机会，另一方面组织培养细胞可进行预先检查而加以克服。 2、没有免疫力：动物经隐性感染获得免疫力，对接种病毒会发生抵抗，但由于后天免疫一般不现 在细胞抵抗力的增加，因此离体细胞无免疫力，利于病毒生长。 3、容易选择易感细胞：细胞来源方便，可供作病毒敏感性的筛选，可以从中选择最敏感的细胞以满 足实验要求，同时还利于从单一细胞水平上研究病毒的繁殖过程和病毒一细胞的相互关系。 4、接种量大：动物和鸡胚的接种均受数量、年龄、途径的限制，细胞不仅可以大量生产，而且还可 较久地持续培养，便于病毒生长，特别是对那些生长缓慢或需在新环境中逐渐适应的病毒更为有利。 5、培养条件易于控制：由于细胞培养可以用人工控制温度、气体、pH、培养基成分，因此可采用大 规模生产方式来生产细胞和病毒及其细胞产物。 6、提高了疫苗的产量和质量：细胞的大量生产可满足疫苗产量的需求，而且异性蛋白少，引起变态 反应机会少。疫苗中污染菌少或无，可随制随用，成本低，来源方便，便于贮存，且效力均匀，易标准化。 7、加速病毒分离过程：病毒分离采用细胞培养不仅阳性率高，而且分离过程可显著加速早出结果， 但应用对该病毒敏感的细胞。 二、用细胞培养分离病毒 (一)接种标本的处理： 1、粪便标本：用于分离肠道病毒之粪便标本放入装玻璃珠 40ml沉淀管内，大约每 2克粪便用 15ml Hanks液稀释(其余粪便于-20℃保存备用)，用橡皮塞紧后剧烈振摇，使粪便乳化，经 2500r/min沉淀 15分 钟后，按将上清用无菌八层纱布过滤，于 4℃以 10000r/min沉淀 1小时再取其上清，1.8ml加入 0.2ml抗菌 素液进行处理(浓度为 25000u/ml的双抗及 250mg/L二性霉素 B)剩下的悬液保存于-20℃备用。 在 4℃下经抗菌素处理的悬液 1小时后接种两管猴肾细胞和人二倍体细胞，每管 0.25ml,置 37℃培养观 察细胞病变(CPE)。如果接种材料毒性大出现非特异的细胞退化，则将培养物尽快传代。 2、肛门拭子——肛门拭子擦试后放在约 2ml的肉汤内，低温保存，培养前挤出液体于 4℃下 2500r/min 沉淀 15分钟，抗菌素处理及接种细胞培养方法同上。 3、咽漱液及咽拭子——呼吸道病毒常取咽嗽液或鼻咽拭子(放在肉汤内)标本，立即接种细胞培养物或 保存于-70℃，抗菌素处理方法同上。 抗菌素处理(4 1℃ 小时)后，即可接种两管以上的细胞培养物，每管 0.2ml,37℃培养，观察 CPE(或血吸 附，或干扰现象，依病毒种类而定)。 4、组织悬液：活体检查或尸体解剖取出的组织保存于-70℃，取出此组织选择适当的样品放入无菌平 皿内称重，然后移入乳钵内，加入 0.75%牛血清白蛋白的缓冲盐溶液磨成 20%悬液，若为结缔组织应加入 适量铝氧粉研磨。 此悬液经 1500r/min沉淀 15分钟，吸掉上清，取适量标本经 500u/ml双抗处理，4℃下 1小时以 0.1～ 0.2ml/管接种 2～4管细胞上，37℃培养、观察 CPE，血吸附，或干扰现象，必要时也可接种动物。原标本 及剩余组织悬液均保存于-70℃。 (二)病毒的细胞培养 病毒的细胞培养，通常用人胚肾(或 VERO猴肾细胞)，WISH及 FL人胚羊膜细胞，人胚二倍体细胞 (WI38、2BS、SL8等)、鸡胚细胞及传代细胞(如 Hela细胞，Hep-2细胞和 KB细胞)等制备的单层细胞。病 毒感染细胞后，大多能引起细胞病变（cytopathic effect, CPE）,无需染色可直接在普通光学显微镜下观察， 记录时+代表 25%以下细胞发生病变，++代表 50%左右细胞发生病变，+++代表 75%左右，++++代表 100% 左右细胞发生病变。不同病毒 CPE产生的现象不同，有的细胞变园、坏死、破碎或脱落如滤泡性口腔炎病 毒(VSV)、B3型柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒等。有的只使细胞变圆，并堆集成葡萄状，如腺病毒。而麻 疹病毒，呼吸道合胞病毒形成多核巨细胞或称融合细胞。有些病毒能使细胞形成包涵体，位于细胞浆内或 核内，一至数个不等，嗜酸性或嗜碱性。 有的细胞不发生细胞病变，但能改变培养液的 pH，或出现红细胞吸附及血凝现象（如流感病毒或副流 感病毒、NDV-F、仙台病毒），有的需用免疫荧光技术，或 ELISA法检测。用来分离培养病毒常用的细胞 如下表 2-13。 表 2-13 分离培养病毒常用的细胞培养 类 型 名 称 原代细胞培养 猴肾细胞、人胚肾、肺细胞、人羊细胞、鸡胚成纤维细胞、 兔肾、狗肾细胞等 二倍体细胞株 WI-38(人胚肺细胞株)HL-8(恒河猴胚细胞株) 传代细胞系 Hela细胞(人子宫颈癌细胞系)、Chang C/I/L/K(人结肠 C、肠 I、肝 L与肾 K细胞系)、(绿猴肾细胞系) BHK-21（幼地鼠 肾细胞系）等 大多数病毒最适温度为 35～37℃，但鼻病毒最适温度为 33℃。至于呼吸道病毒(合胞病毒除外)，一般 则减低温度为宜，而且以旋转鼓培养为佳，但有的病毒需静置培养，应依病毒种类而定。 (三)在细胞培养中病毒作用之识别： 某些接种物对细胞可能有毒性作用，导致细胞退化，若在接种后 24～48小时内出现退化现象，必须 进一步传代稀释除去接种物中可能存在的有毒物质，在预定观察期内，细胞若产生自发退化现象，每批标 本的细胞培养物应收获、合并，并进行传代培养，观察细胞病理性改变(CPE)、包涵体的形成、细胞转化 代谢改变等。 (四)在单层细胞上滴定病毒 不同稀释度的病毒液接种细胞后，使组织培养物一半发生退化的最高稀释度称为组织培养物 50%发生 病变的剂量，即：TCID50(亦称 50%组织培养物感染剂量)。 TCID50的测定，首先将病毒用维持液作对数或半对数逐步稀释，每个稀释度接种四支以上细胞培养管， 接种后的培养物在适宜条件下培养，定期观察 CPE，如果一半或一半以上的细胞培养出现 CPE则视为阳 性(或感染)，再计算 TCID50。 大多数病毒的中和试验中用 100TCID50，其含 100TCID50病毒悬液的稀释方法计算如下： TCID50滴度的对数+2=含 100TCID50病毒液之稀释度对数 例如：如果 TCID50滴度=10-6.5/0.1ml 则-6.5+2=-4.5即 0.1ml含 100TCID50的病毒悬液之稀释倍数为 1:10000～100000 (1:50000)。 三、病毒的鉴定技术 (一)病毒蚀斑技术 1、概论： 病毒蚀斑(又叫空斑)如同噬菌体的噬斑，一个蚀班为一个病毒体的繁殖后代品系。在细胞培养中做蚀 斑是一种较精确地测定病毒感染力的方法，将病毒各稀释度种入单层细胞瓶，吸附 1小时后，在单层细胞 上复以营养琼脂培养基，病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。但由于琼脂的限制只能感染邻近的细胞，形成“蚀 斑”的退化细胞区，经中性红活细胞染料着色后，活细胞显红色，而蚀斑区细胞已退化不着色，形成不染 色区域。凡是能在细胞培养物中产生细胞死亡破裂现象（CPE）的病毒都可采用蚀斑技术来分离和测定。 蚀班技术在测定病毒感染时是很好的定量方法，也是测定干扰素和抗体中和病毒繁殖能力的一种非常 敏感的方法。此外还可以用来纯化病毒，纯化时挑选合适的空斑进行传代即可。若目的是要提高病毒毒力， 应选大空斑，若是为了减毒以制备疫苗应挑选小空斑，但每瓶空斑数目不得超过 20～40个为宜。 试验时，培养瓶应翻转培养，以除去水滴在琼脂面流动以免各个蚀斑交叉融合，中性红加入时间应在 蚀斑出现前加入，在暗处孵育，以防止染料抑制病毒和破坏细胞。对那些生长较慢的病毒蚀斑，中性红则 不是加在最初的覆盖层里，而是加在经过几天培养后的最后一层覆盖层上，可使培养物维持更久，甚至有 的中间还得补加营养琼脂覆盖层 1～2次。 蚀斑使用的琼脂往往有少量抑制物而影响蚀斑的产生，应将琼脂用单蒸水浸泡过夜，再用单蒸水冲洗 2～3次，而后用去离子水冲洗 1～2次后，用 Hanks液配制成 3%浓度，煮沸 1小时除菌备用。 有人在试验时补加 25mM的MgCl2或 CaCl2及 1mM半胱氨酸，可加强肠道病毒形成蚀斑。而MgCl2 的加强作用最强。 2、蚀斑技术举例： 2.1 虫媒病毒在鸡胚纤维母细胞中的蚀斑 (1)选择经 24～48小时培养的 4×105万/L鸡胚细胞若干瓶。 (2)将细胞瓶按病毒稀释度分组标志，每个稀释度为 2～3瓶，对照 2～3瓶。 (3)配制含 2～5%小牛血清的 0.5%水解乳蛋白的 Hanks(LH)稀释液(维持液)100ml： 0.2或 0.5%LH 97ml（也可用 Eagle MEM或 199、RPMI1640培基） 灭活小牛血清 2ml 双抗(2万单位/ml) 1ml,调 pH至 7.4～7.6（双抗指青霉素和链霉素） (4)在冰浴盘内用上述稀释液将病毒作一系列稀释。 生 物 秀 -专 心 做 生 物 ww w. bb ioo .co m 冰浴盘内 (5)用 Hanks液(pH约 7.8)洗涤细胞层约 3分钟（轻洗勿使细胞脱落）。 (6)将各稀释度种两瓶细胞，每瓶(小方瓶)接种 0.5ml病毒(大方瓶接种 1ml)，轻轻摇匀。 (7)置 37℃温箱吸附 1小时（中间摇动一次），切勿倒置。 (8)加含培基的融化琼脂，每大瓶加 10ml每小瓶加 5ml，控制温度在 45～50℃左右加入，以防凝固。 培基琼脂配制法： 灭活小牛血清 6ml 双抗(2万单位/ml)1ml 卡那(2万单位/ml)1ml 加入等量 56℃融化的 3% 0.5%LH 90ml Hanks琼脂液并摇匀 7.5%NaHCO3 2-3ml (9)冷凝后将各瓶琼脂层朝上，置 37℃孵育 24小时（注意勿放倒置）。 (10)于每瓶中加入 0.2%中性红小瓶 0.25ml（大方瓶加 0.5ml）摇匀，37℃孵育 4小时后将培养物朝上 继续孵育。 注：①若需保存空斑时，可于每瓶中加入 3%氯化汞 0.5ml并摄影记录。 A② 组虫媒病毒培养 24小时，B组虫媒病毒培养 72小时观察结果。 ③病毒空斑形成单位（pfu）计算法： 蚀斑出现时，作第一次观察记录蚀斑数，于次日进行第二次观察每瓶蚀斑数以 10～50/瓶个为宜。 每瓶平均空斑数 蚀斑单位（pfu）= —————————————— 病毒稀释度×病毒接种量(ml) 计算方法举例：如果 10-7病毒液的空斑数，一瓶为 31，另一瓶为 27，每瓶中各加病毒液量是 0.5ml， 因此两瓶共有蚀斑为 58，代入公式即： 58/2 ————— =58×107=5.8×108查对数表为 8.77（即效价为 8.77Lg pfu/ml） 10-7×0.5 注：①各稀释度病毒在稀释时每个稀释度均应换取新吸管将病毒来回吹打三次(或轻轻振摇混匀)，当 加至各细胞瓶时应加至无细胞层的瓶壁侧底角，然后倾斜并来回摇动使病毒与整个细胞均匀接种。 ②加中性红时也应倾斜，轻摇，使中性红均匀复染整个琼脂表面，然后将瓶子反转培养。培养液可用 Eagle或 RPMI1640替代 0.5%HL。 生 物 秀 -专 心 做 生 物 ww w. bb ioo .co m 2.2 用传代细胞系平皿法蚀斑 (1)将单层细胞（2×105万/L 6ml）培养在直径 60毫米的平皿上，生长液为 10%小牛血清、加 89%水解 乳蛋白一酵母浸液培养液、加双抗并调 PH至 7.2。 (2)培养物置于潮湿 5%CO2气体中，于 36-37℃培养成单层，除去生长液用 Hanks液洗一次。 (3)将各病毒稀释度每皿加 0.1或 0.2ml，轻轻摇匀，使之均匀分布于整个细胞层，CO2培养箱中吸附 90分钟后，加营养覆盖琼脂。 (4)将双倍浓度营养覆盖层溶液与等量的 1%（已融化）的琼脂水液混合，在 45～50℃下维持防凝，每 皿 8ml。 双倍营养覆盖层溶液： 灭活小牛血清 6ml 10倍浓 Eagle(MEM) 20ml 3%谷氨酰胺 （水配） 4ml 加入等量 56℃已融化的 8.8%NaHco3 (水配) 5ml 2%琼脂的水浴液并摇匀 双抗 (水配) 2ml 无菌三蒸水 63ml (5)冷凝后反转平皿，CO2培养箱培养 4～5天后再加入 1ml营养覆盖层，过滤中性红。 (6)继续培养,于第 5～8日（依病者而定）,加入 0.01%过滤中性红,检查蚀斑情况。 2.3 在塑料板孔内做病毒蚀斑： (1)用塑料板（96孔或 24孔），若用旧板，洗净后浸于 95%酒精中 5分钟，再用紫外线照射 2～4小时 备用，新板可直接使用。 (2)将传代细胞系经胰酶消化分散后，用 5%小牛血清 95%的 199（或 Eagle）将细胞配成 2.4×104万/L 。 (3)按 96孔微孔板中 0.1ml/孔细胞量，24孔板中 0.5ml/孔，在 CO2培养箱中培养 24或 48小时，直至 形成单层。 (4)除去生长液,每孔加入 0.05ml不同稀释度病毒,然后将此板于 33℃吸附一小时。 ⑤按下述方法制备双倍营养覆盖液与等量溶化的 2%琼脂水溶液混匀，并维持于 45～50℃防凝。 双倍营养覆盖溶液： 灭活胎牛血清 4.0ml 10倍浓 Eagle 20ml 1%酵母浸液—5%水解蛋白水溶液 13.3ml 加入等量 56℃已融化的 7.5%NaHCO3 (水配) 6ml 2%琼脂水溶液并摇匀 双抗 (水配) 2ml 无菌三蒸水 54.7ml (6)融化的营养琼脂覆盖层液在 45～50℃下每孔加 0.1ml，待冷凝后于 CO2培养箱内培养。1～5天后再 加第二层染色覆盖层（依病毒种类而定），其中含有 1:25000的中性红，继续培养于暗处，定期检查蚀斑情 况。 (二)病毒蚀斑抑制试验 一般来说，凡是抵抗力强，容易控制蚀斑滴度的病毒（如少数虫媒病毒和肠道病毒等），皆可用“固定 病毒”、“稀释血清”的方法进行，反之，凡是抵抗力弱，不易控制空斑滴度的病毒（如大多数虫媒病毒等皆 生 物 秀 -专 心 做 生 物 ww w. bb ioo .co m 可改用为“固定血清”、“稀释病毒”的方法进行。） 1、固定病毒稀释法 (1)选择每瓶能出 50～100 (2)按 2，4或 10倍稀释法分别将正常和免 个空斑量的病毒* 疫血清作成一系列稀释** (3)取病毒分别与不同稀释度的正常和免疫血清作等量混合,并置37℃水浴作用 1小时。 (4)分别取两组混合物，按 0.5ml接种于良好单层细胞 2～3瓶/每个稀释度，37℃吸附 1小时后，覆盖 营养琼脂。 注：*取正常血清将病毒稀释至所需空斑单位。 **血清可用维持液稀释，并经 56 30℃ 分钟灭活。 (5)培养适当时间后（培养时间视不同病毒而定），加中性红染液，继续在 37℃培养 4小时，每天观察 结果，直至空斑出齐。 (6)判定结果：与对照组相比，凡能抑制空斑形成数 80%以上的抗血清稀释度为最高滴度，一般认为抑 制空斑数 80～100%者为阳性，70～79%为可疑，69%以下者为阴性。 2、固定血清稀释病毒法 (1)分别将正常血清与免疫血清 按 10倍稀释法将病毒 用维持液稀释 1:5(不灭活) 作成一系列稀释(冰浴内进行) (2)先将血清按 1ml/管分装于一系列无菌试管中，而后再分别取不同稀释度的病毒液 5ml与血清混合， 并置室温作用 1小时。 (3)分别将两组混合物按 0.5ml/瓶感染生长良好的单层细胞，每个稀释度 2～3瓶，37℃吸附 1小时后， 覆盖营养琼脂，培养 24小时后加中性红染色，继续培养 4小时后观察结果，以后每天观察结果，直至空 斑数稳定为止。 对照组空斑滴度减去实验组空斑滴度即为抗血清中和指数。 (三)细胞培养系统中的中和试验： 1、概论： 在细胞培养中进行中和试验可用于病毒实验室诊断，首先从病人分离的病毒可用于已知特异免疫血清 来中和此病毒，抑制细胞培养上的 CPE或蚀斑形成等能力，以助鉴定病毒，另外患者的急性和恢复期血清 中抗该病毒的抗体明显升高，可作为此病毒患者之诊断。 在细胞培养中测定中和抗体含量一般将血清作一系列稀释，然而加入定量（通常是 100TCID50）病毒， 即病毒定量——血清变量法，相反用定量稀释的血清来中和各个不同稀释度病毒的方法，即血清定量—— 病毒变量法系统中，抗体的滴度以能中和上述剂量病毒的最高稀释倍数来表示。此法也可用于干扰素抗病 毒效应和效价测定。 2、中和试验举例 2.1 试管单层细胞中和抗体的测定 (1)已知免疫血清与未知血清先经 56 30℃ 分钟灭活，破坏不耐热的非特异性病毒抑制物。 (2)用维持液将血清作一系列稀释用 100TCID50的病毒稀释液分别与各稀释度血清等量混合，其量依接 种培养物之管数多少而定。同时也应将病毒液与等量的稀释液混合，作为病毒对照，均放在相同条件下孵 生 物 秀 -专 心 做 生 物 ww w. bb ioo .co m 育（依病毒而定）。 (3)孵育后的血清——病毒混合物及病毒对照均按照 0.2ml/管，2管/每个稀释度进行接种。 (4)接种的培养物应培养于该病毒的最适生长条件中，定期检查 CPE或血吸附的情况等以制定血清对 病毒的抑制能力。 2.2 单层细胞微量中和试验： 微量中和试验已用于许多种病毒，采用微量 96孔板，有的是先在各孔内培养细胞，然后接种病毒—— 血清混合物，为方便起见，细胞、病毒血清可同时接种，这样未经中和的病毒使细胞退化，最后不形成单 层，相反若孔中无病毒或病毒已被中和，则经过一段时间培养后可形成单层，此板需在 5% CO2 37℃的培 养箱中培养，检查时用倒置显微镜观察。 (1)试验血清需经 56 30℃ 分钟灭活，使用的微量加样器作递倍稀释，稀释液与维持液相同，即 98%Eagle(MEM)+2%小牛血清+双抗 1ml pH为 7.2～7.4。以 0.025ml/孔。 (2)将病毒稀释至 100TCID50的浓度，取 0.05ml病毒加入血清各稀释度孔内，血清一病毒混合物置室温 结合 30分钟。 (3)同时将 HEP-2细胞或相应敏感细胞稀释成 3-5×105万/L ，其稀释液用 90%Eagle(MEM) +10%小牛 血清配制，各孔加 0.025ml，细胞对照各孔加 0.025ml稀释液和 0.025ml细胞悬液，另外设有血清对照和病 毒对照。 (4)置潮湿的 35 CO℃ 2孵箱内培养。 (5)经 48小时培养后，无病毒或病毒被中和的各孔细胞可形成单层，而病毒未被中和之各孔和病毒对 照孔则细胞退化，用倒置显微镜观察结果。 注：若测定粘液病毒中和试验，则采用血吸附抑制试验，方法基本同上，只是细胞、病毒血清混合培 养 4～6天后用 23号针头吸去各孔上清，并小心地用 0.25ml生理盐水洗涤后，每孔中加入 0.05ml的 0.5% 鼠红细胞（用生理盐水稀释），用胶带封盖，于 4℃作用 30分钟，检查板孔确保所有孔均已封牢，然后将 微量板翻转，使未被吸附的红细胞从细胞层上流下，而吸附于病毒感染的细胞上的红细胞仍附着其上，用 光学显微镜查血吸附结果，若发生血吸附抑制，则表明血清有中和作用。 2.3 色变（代谢抑制）中和试验 代谢抑制试验近年来逐渐趋向采用微量法，以节约材料和时间，下述两方法可作为代谢抑制试验的例 子，第一法适用于迅速产生 CPE的病毒，第二法即“两段法”（twophase system）则适用于使细胞发生缓慢 退化的病毒如 Reo病毒。 测定肠道病毒：一般来讲肠道病毒在灵长类上皮样细胞上生长最好，脊髓灰质炎病毒在猴肾细胞、人 胚肾、人羊膜、人胚肺和 HeLa传代细胞上生长良好，柯萨奇病毒在猴肾细胞 HeLa HeP-2 KB传代细胞等。 测定时采用微量滴定板，具体方法如下： (1)先灭活血清，然后用代谢培养基以 0.05ml微量加样器作倍比稀释从 1:8～1024，每组测试一种病毒。 同时取 1:8——1:32各稀释度血清（不加病毒）作血清对照以测定血清对细胞有无毒性。 (2)血清各稀释度内加入代谢培养液稀释至 100～300TCID50的病毒悬液 0.05ml。 (3)将细胞配成 1×104万/L 细胞悬液，各血清～病毒混合物，“血清对照”及病毒对照孔内皆接种 0.05ml 细胞悬液（含 5000个细胞）。 (4)细胞对照：四个孔内各加 0.05ml培养液及 0.1ml细胞悬液（其中含 10000细胞），另四个孔内各加 0.1ml培养液，加入 1:2稀释的细胞悬液 0.05ml（其中含 2500细胞），另四个孔内各加 0.1ml培养液及 1:4 生 物 秀 -专 心 做 生 物 ww w. bb ioo .co m 稀释的细胞悬液 0.05ml(其中含 1250细胞)，对照组含细胞量分别为试验组 2X、1X、1/2X、1/4X。 观察结果时含 10000及 5000个细胞的各孔培养液 pH应为 6.8～7.0，含有 2500个细胞孔 pH应为 7.2～ 7.6，含 1250个细胞孔 pH应为 8.0，相应各孔内 pH高于上述值，则说明所用细胞数过少或细胞代谢过慢。 若 pH低于上述值，则说明加入细胞过多。 (5)各孔内加入 0.1ml无菌矿物油，胶带封盖确保封紧，于 36℃～37℃培养 6～8天。 (6)培养到期后，观察其颜色，pH7.4或高于 7.4说明有病毒繁殖，而 pH7.2或低于 7.2则表明没有病毒 繁殖（病毒滴定时），或已发生病毒的特异性中和作用（测定抗体时）。细胞对照的 PH应同上述。 测定 Reo病毒：即“两段法”代谢抑制试验，细胞代谢引起 pH改变不大的情况下可使用本法。通常是 用于测定生长缓慢的病毒，该病毒不能在宿主细胞本身改变 pH前表现其代谢抑制作用，为此应分两段进 行。第一段方法同上，第二段是在第一段基础上，各孔再加入 0.05ml培养液以维持宿主细胞本身的 pH， 以使病毒仍能继续生长繁殖，直至产生代谢抑制现象，判定方法与上述相同。 四、用细胞培养法制备病毒血清学抗原 用于许多病毒中和试验、血凝试验、补体结合试验、凝集及沉淀反应的抗原，用组织培养之材料制备 较为理想。 用于病毒中和试验的抗原不需很纯，但是其“感染性病毒与非感染性病毒”之比值应高。因后者可结合 抗体，感染滴度高，这样经稀释后，即可除去大多数宿主材料及非感染性病毒。所以用于中和试验的病毒， 其最适培养条件应能获得最大量感染性病毒。处理和保存中亦应注意，使其不致失去感染性。 血凝抗原应具有足够高的效价，使在稀释后，尚有 4或 8个抗原单位。重要的问题在于维持液中的血 清不得含有病毒血凝的非特异性抑制物。此外，该血清中亦不得含有试验血凝系统中红血球的血凝素。维 持液血清经白陶土处理或用不含血清的维持液，则可解决非特异性抑制物的问题，有时，感染的组织培养 液用氟碳化合物处理，可使其中之血凝素“暴露”出来，有些病毒抗原的血凝效价，亦可通过反复冻融，超 声波或 Tween-80、乙醚处理而提高。 一般认为补体结合抗原，应有适当效价，不含宿主物质（因中和试验血清一起结合补体）,不得有抗补 体作用。 用于沉淀反应的病毒抗原，应为高度浓缩者，这样才能与特异抗体形成可见沉淀线。通常使用物理和 化学方法进行浓缩，但其原始材料应具有高滴度。 在浓缩提纯病毒抗原时，应避免应用可使蛋白质变性的理化方法处理，否则将改变其抗原特性,此点甚 为重要。 生物秀-专心做生物！ www.bbioo.com 生 物 秀 -专 心 做 生 物 ww w. bb ioo .co m