衡阳地区梅毒螺旋体基因分型的实验研究

和方法 13 12 标本来源及处理2 )*4’56&-7 株由新疆 乌鲁木齐地方病防治中心董永惠惠赠，用 89:#,! ;4: <-&&. =’$（8’#>"(）提取 ;4:。临床标本为 ?@@A 年 ? 月 B ?@@C 年 D 月衡阳地区就诊于南华 大学性病研究所、附属南华医院及第二附属医院 皮肤科的疑似梅毒硬下疳的生殖器溃疡患者 C? 例（无重复病例），患者均有不洁性接触史。其 中，男 AE 例，年龄 1D B CC 岁；女 1E 例，年龄 1E B C? 岁。临床标本用蘸取无菌生理盐水的棉签擦 洗溃疡渗出物后，将液体挤入 13 C ,F G* 管内即 用 89:#,! 基因组 ;4:纯化试剂盒提取 ;4:，若 标本暂时不提取时置 H D@I或 H ?@I短期保存。 13 ? 2 试剂 2 *J+ 引物（上海生物公司合 成）；89:#,! ;4: <-&&. =’$（8’#>"(）；!K/)#L;4: 酶、.4)*7 和 ;4: 标准参照物（上海生物工程公 司）；M7"9限制性内切酶（4G<）；琼脂糖 ;4: 纯 化系统（华美生物工程公司）。 13 A 2 筛选 )* 阳性标本 2 !&-:*J+ 扩增 )*4’0 56&-7标准株和临床株，!&-: 基因引物序列（N：C’ H )OJOJO)O)OJO::)OO)O)OO)J H A’；+：C’ H J:J:O)OJ)J:::::JOJJ)OJ:JO H A’）、反 应体系和条件参照文献［?］。产物 G< 染色，?P 琼脂糖电泳后、紫外灯下观察结果。 13 Q2 *J+ 扩增 )* :+* 基因 2 !&-:*J+ 阳性者 用 *J+ 扩增 )* :+* 基因，:+* 基因引物序列 （N：C’H J::O)J:OO:JOO:J)O)JJ H A’；C’ H OO):)J:JJ)OOOO:)OJ H A’）、反应体系和 条件均参照文献［A］。扩增后取扩增产物 1@ !F 在 CP的 *:OG胶上 E@ R电泳 ? 6后用硝酸银染 色，观察并拍摄结果。 13 C2 巢式 *J+ 扩增 )* )*+ 基因及 +NF* 分析 2 !&-:*J+ 阳性者用 *J+ 扩增 )* )*+ 基因， )*+基因引物序列（外引物 N：C’H :J)OOJ)J)0 OJJ:J:J))O: H A ’； C ’ H J):JJ:O0 O:O:OOO)O:JOJ H A’；内引物 N：C’H J:O0 O))))OJJO))::OJ H A’；C’H ::)J::OO0 O:O::):JJO)J HA’）、反应体系和条件均参照 文献［A］。扩增后取 C@ !F终产物用琼脂糖 ;4: 纯化系统纯化后，取 1@ !F产物加入 M7"9内切酶 C /，ASI消化 13 C 6。取 1@ !F酶切产物在 A3 CP 的 *:OG胶上 E@ R电泳 ? 6 后硝酸银染色，观察 并拍摄结果。 ?2 结2 2 果 ?3 12 )*!&-: *J+筛选2 阳性例数共 QA 例。 ?3 ?2 扩增 )*的 :+*基因2 扩增 )*4’56&-7标准 株的 :+*基因得到约 1 1CC T!长度的片段，对应 1Q 个重复序列，扩增临床 )* 株阳性者 QA 例，得 到约 U1C B 1 ?SC T! 长度的片段，对应 1@ B 1E 个 重复序列，见图 1。 图 12 扩增 )* :+*基因部分标本 *:OG电泳图 M：@3 ? B ? VT ?@@ T! ;4: 标准参照；13 )* 4’56&-7株 W 1Q；? B D 临床株：? W 1A %"!"#$7；A W 1E %"!"#$7；Q W 1C %"!"#$7；C、S W 1Q %"0 !"#$7；E W 1? %"!"#$7；D W 1@ %"!"#$7 ?3 A2 )*+ 基因的 +NF* 分析2 临床株 )*+ 基因 阳性者共 Q1 例。)*4’56&-7 标准株和临床株的 )*+基因扩增终产物经 M7"9 酶切，获 C 个 +NF* 亚型，按 *’--#X等［A］的命名为 #，T，.，K，>。见图 ?。 2 2 2 2 2 2 图 ?2 M7"9 酶切 )*+基因 *J+产物的 +NF* M：@3 1 B 1VT 1@@ T! ;4: 标准参照物；13 )*4’56&-7 株；? B U 临 床株：1、A3 #亚型；?、E、D、U3 . 亚型；Q3 K 亚型；C3 T 亚型；S3 > 亚型 ?3 Q2 )* 的分子亚型分布 2 :+* 和 )*+ 基因均 阳性者共 AD 例，)*临床株分子亚型分布，见表 1。 @1C ! ! ! ! 表 "! #$ 例 %&临床株的分子亚型分布 %&亚型 标本例数 构成比（’） "( ) * +, # "* - * +, # "* . " *, / "# ) 0 "(, + "0 - # 1, 2 "0 3 * +, # "0 ) "/ 0*, " "0 4 * +, # "+ ) + "#, * "/ ) " *, / #! 讨! ! 论 许多性传播疾病的病原体，如 567、淋球菌、 沙眼衣原体［0 8 /］，已进行了分子分型用于相应疾 病的流行病学研究。%& 不能根据血清学和分子 方法进行区分，从而限制梅毒的分子流行病学的 研究。随着 %&全基因序列的解析，&9::-; 等［#］发 现不同临床株的 %& 株间存在着 <=& 和 %&= 基 因的差异，对于 <=& 基因，不同的 %&株可包含有 约 /( 个碱基对长度不等的重复序列；对于 %&= 基因，&>=产物通过酶切后存在限制性片段长度 多态性（=?@&）。将两方法结合起来，建立了一种 比较简便的区分 %& 临床株的方法。在美国和南 非等一些梅毒高发区，该方法已被系统地用于梅 毒分子流行病学的调查［1，$］。本研究在此基础 上，先用高度特异、敏感的 %&AB:<&>=［*］方法筛选 可疑梅毒的硬下疳标本，阳性者再区分亚型，得到 "( 个亚型，证实在衡阳地区存在 %&的多亚型性， 其中 "0)亚型最常见（0*, "’），与国外文献报道 一致［#，1］。但由于临床标本来源的限制，以及未 见国内相关文献报道，"0 ) 亚型是否为我国其它 地区的优势流行株，是否比其他亚型更具毒力和 更容易传播有待进一步研究。本研究中，0# 例 %&AB:<&>=阳性的标本最终用于分型的有 #$ 例， 原因可能系扩增 <=& 基因的 &>= 敏感性较低或 者由于标本在保存的过程中有 CD< 降解所致。 研究进一步表明该方法简便，重复性好，用银染能 提高分辨率，便于直接观察结果。用该方法对 %& 亚型进行区分，对于了解 %& 分子亚型的地区分 布和流行情况、确定梅毒新病例的起源、控制梅毒 的传播等有着重要意义，有待进一步扩大标本研 究。 参考文献： ［"］! 中国预防医学科学院流研所疾病监测室, *((( 年 "* 月份全国疾病监测点 #+ 种法定 传染病疫情动态简介［ E］,疾病监测，*(("， "/（"）：# F +, ［*］! @9G 5，=B)HI J，>KHL >M，HN -:, DHO NHINI 4BP I;AK9:9I：P-N9BL-: )HI9.L B4 - &>= QHNKB) 4BP )HNHRN9BL B4 %PHABLHQ- A-::9)GQ 9L R:9L9S R-: IAHR9QHLI GI9L. GL9TGH PH.9BLI B4 NKH CD< AB:;QHP-IH 6 .HLH［ E］, E >:9L U9RPB39S B:，*(("，#2（+）："20" F "20/, ［#］! &9::-;<，@9G 5，>KHL >M，HN -:, UB:HRG:-P IG3N;A9L. B4 %PHABLHQ- A-::9)GQ IG3IAHR9HI A-::9)GQ［ E］, VHW %P-LIQ C9I，"22$，*+ （$）：0($ F 0"0, ［0］! V-LN9-.B U@，V-LN9-.B XY，5-4-::- E>，HN -:, UB:HRG:-P HA9)HQ9B:B.; B4 567 F " 9L4HRS N9BL 9L NKH &K9:9AA9LHI，"2$+ NB "221：NP-LIS Q9II9BL B4 IG3N;AHI J -L) X -L) ABNHLN9-: HS QHP.HLRH B4 IG3N;AHI > -L) ?［ E］, E , [IHI -L) :9Q9N-N9BLI B4 .BLBRBRR-: IHPBN;A9L.［ E］, 6LN E V%C <6CV，"22/，1 （"）："0"$, ［/］! UBBPH V<，UBHI =，7-L 7-:\HL.BH) 6，HN -:, YHLBN;A9L. B4 >K:-Q;)9- NP-RKBQ-N9I 9L GP9LH IAHR9QHLI O9:: 4-R9:9N-NH :-P.H HA9)HQ9BS :B.9R-: ING)9HI［ E］, E >:9L U9RPB39B:，"22$， #/（"(）：#(11 F #(1$, ［1］! VGNNBL UM，@9G 5，VNH9LHP，HN -:, UB:HRG:-P VG3N;A9L. B4 %PHABLHQ- A-::9)GQ 9L -L BGLN; O9NK 9LRPH-I9L. I;AK9:9I QBP39)9N;： GIH B4 IAHR9QHLI 4PBQ G:RHPI -L) 3:BB)［E］, E 6L4HRN C9I，*(("，"$#（""）："/(" F "/(/, ［$］! &9::-; <，@9G 5，X3P-K9Q V，HN -:, UB:HRGS :-P N;A9L. B4 %PHABLHQ- A-::9)GQ 9L VBGNK <4S P9R-：RPBII F IHRN9BL-: ING)9HI［E］, E >:9L U9S RPB39B:，*((*，0(（"）：*+/ F *+$, （收稿日期：*((/ F (# F (2） ""+ Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight