出血性血小板病凝血酶受体及益气活血方的治疗作用

申请代码： C03050402 受理部门： 收件日期： 受理编号： 解除保护 国家自然科学基金 申 请 书 资助类别：面上项目 亚类说明：自由申请项目 附注说明： 项目名称：出血性血小板病凝血酶受体研究及益气活血方的治疗作用 申 请 者：沈霖 电话： 027－85726395 依托单位：华中科技大学 通讯地址：湖北省武汉市航空路 13 号 邮政编码：430030 单位电话：027-87543437 电子邮件：shenlinhb@yahoo.com.cn 申报日期： 2005年2月21日 国家自然科学基金委员会 cdp 机密 cdp 机密 cdp 机密 国家自然科学基金申请书 第 2 页 版本 1.003.094 基本信息 wpPIYr6r/9B 姓 名 沈霖 性别 男 出生 年月 1952 年 12 月 民 族 汉族 学 位 学士 职称 教授 主要研究领域 中西医结合临床基础研究 电 话 027－85726395 电子邮件 shenlinhb@yahoo.com.cn 传 真 个 人 网 页 无 工 作 单 位 华中科技大学 /同济医学院 申 请 者 信 息 在研项目批准号 名 称 华中科技大学 代 码 43007402 联 系 人 张婷姣 电子邮件 kjcjcb@hust.edu.cn 依托单位信息 电 话 027-87543437 网站地址 www.hust.edu.cn 单 位 名 称 代 码 [在此录入修改] 合作单位信息 [在此录入修改] 项目名称 出血性血小板病凝血酶受体研究及益气活血方的治疗作用 资助类别 面上项目 亚 类 说 明 自由申请项目 附注说明 申请代码 C03050402:中西医结合临床基础研究 基地类别 预计研究年限 2006 年 1 月 — 2008 年 12 月 研究属性 应用基础研究 项 目 基 本 信 息 申请经费 26.0000 万元 摘 要 项目研究内容和意义简介（限 400 字）：出血性血小板病是以反复发作性皮肤粘膜出血、月 经过多、鼻衄或眼底、球结膜出血为主症，血小板计数正常，但血小板聚集功能存在缺陷 的出血性疾病。其发病因未明，西医药疗效不甚理想。理论上任何途径的血小板聚集过程 都涉及血小板活化，最终归之于血小板膜糖蛋白（GP）Ⅱb／Ⅲa 复合物。凝血酶在其中占 有重要地位。凝血酶是最强的血小板活化剂。其活化血小板主要是通过一个 G 蛋白偶联七 个穿膜区受体和 GPⅠb-Ⅺ-Ⅴ两种途径。新近发现人类血小板表达的 PARl 和 PAR4 受体，激 活其中任何一种，都可以诱导血小板活化。本项目拟采用单克隆抗体、流式细胞仪及分子 生物学技术，在受体及分子水平上研究出血性血小板病凝血酶受体功能与活性，以探讨该 病的发病机理；在此基础上，运用益气活血方治疗，并重点观察中药对凝血酶受体的影响， 为中医药治疗受体性疾病提供临床及理论依据。 关 键 词(用分号分开，最多 5个) 出血性血小板病；凝血酶受体；益气活血方 cdp 机密 cdp 机密 国家自然科学基金申请书 第 3 页 版本 1.003.094 项目组主要成员(国家杰出青年科学基金不填此栏) 编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮件 项目分工 每年工 作时间 （月） 1 沈迪 1922-7-1 男 教授 其他 华中科技大学 027-85729139 shendiwh@yahoo.com.cn 指导研究 6 2 朱闽 1957-12-31 女 教授 博士 华中科技大学 027-85726823 mz1988@yahoo.com 凝血酶受体 检测 4 3 李蕾 1966-1-21 女 主治医师 博士 华中科技大学 027-85726395 lileilei21@yahoo.com.cn RT-PCR技术 测定 6 4 谢晶 1965-3-12 男 副教授 博士 华中科技大学 027-85726395 Jingxie9@hotmail.com 流式细胞仪 检测 6 5 周丕琪 1968-1-3 男 助理研究员 硕士 华中科技大学 027-8572682 3 zhoupiqi@yahoo.com.cn 免疫印迹实 验 8 6 杨艳萍 1962-6-29 女 副教授 学士 华中科技大学 027-85726395 Yanpingyang@yahoo.co m.cn 血小板膜糖 蛋白试验 8 7 戴燚 1977-11-3 男 博士生 硕士 华中科技大学 027-85726823 daiyifreeman9401@21cn. com 免疫印迹实 验 8 8 夏远军 1978-11-23 男 博士生 硕士 华中科技大学 027-85726823 yuanjunxia@yahoo.com. cn 血小板活化 实验 8 9 [在此录入修改] 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 9 5 2 2 说明: 1. 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。 说明: 2. 项目组主要成员不包括项目申请者。 cdp 机密 cdp 机密 国家自然科学基金申请书 第 4 页 版本 1.003.094 经费申请表 （金额单位：万元） 科目 申请经费 备注（计算依据与说明） 一.研究经费 23.7500 以下严格按“国家自然科学基金经费管理办法”执行 1.科研业务费 3.3000 （1）测试/计算/分析费 1.5000 血小板聚集、流式细胞仪、血小板活化试验检测 （2）能源/动力费 0.5000 水电费 （3）会议费/差旅费 0.8000 重要学术会议支出 （4）出版物/文献/信息传播费 0.5000 文献查询、论文版面费和印刷费 （5）其它 0.0000 2.实验材料费 18.4500 （1）原材料/试剂/药品购置费 18.0000 单克隆抗体，各种荧光与酶标二抗，PVDF 膜；ECL显色试剂盒；中药材及制剂 （2）其它 0.4500 购买实验耗材 3.仪器设备费 1.0000 （1）购置 0.0000 （2）试制 1.0000 制备实验标本 4.实验室改装费 0.0000 5.协作费 1.0000 实验标本收集；化验室进行血小板计数、出、凝血时间等常规检测协作费 二.国际合作与交流费 0.0000 1.项目组成员出国合作交流 0.0000 2.境外专家来华合作交流 0.0000 三.劳务费 1.0000 研究生及博士后人员科研劳务费 四.管理费 1.2500 按申请金额 5％计算 合 计 26.0000 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配） 与本项目相关的 其他经费来源 其他经费来源合计 0.0000 国家自然科学基金申请书 第 5 页 版本 1.003.094 查看正文撰写提纲 报告正文 （一）立项依据与研究内容 （4000-8000 字）： 1. 项目的立项依据 出血性血小板病是一组反复发作性出血性疾病。患者常有轻重不等的肢体瘀斑，月 经过多，鼻衄，齿龈出血或眼底、球结膜等出血倾向，血小板计数、血小板形态、出凝 血时间及凝血象均属正常，且除外其它原因所致的出血，但血小板聚集功能存在缺陷。 在本病的发病原因及治疗方面虽有不少论点，但其确切的发病机制至今未明；西医药用 强的松、氨肽素、安络血及维生素 C、P 等治疗，疗效也不甚理想。 关于皮肤粘膜出血和月经过多症状与血小板聚集功能缺陷的关系，是我们在临床上 研究类似出血性疾病时所见到的。早在 1984 年,同济医科大学沈迪等人发现一组血小板 计数正常而对刺参粘多糖诱导的血小板聚集反应明显减低或缺如的皮肤粘膜出血或伴 月经过多患者，当时称为“新型血小板聚集功能缺陷症”，并经国内部分血液学家的复 制和证实。然而其中有些出血者的血小板被腺苷二磷酸（ADP）、花生四烯酸（AA）、 血小板活化因子（PAF）、肾上腺素和胶原等诱导，也可出现血小板聚集缺陷，其缺陷 率在 752 例中约占 31.6%，称为“未明原因血小板病”。这两组出血性血小板病的研究 均曾受国家自然科学基金的资助（编号 3870716 和 39370322），研究结果共发表论文 40 余篇，他人重复试验和证实的发表论文 37 篇。 90 年代初，在湖北省卫生厅资助下，研究组开始运用中医药辩证治疗本病。本病的 出血症状属中医“血证”。在临床辩证中，发现上述两种血小板病患者中有“气虚”者 占 78.1%，提示该病中医病机多属“气不摄血证”。根据中医“活血止血”的理论，经 体外筛选及临床摸索，自拟益气活血方治疗本病。方中黄芪、党参益气，当归活血补血， 黄芪、当归含有当归补血汤之意。赤芍、桃仁活血化瘀，甘草和中。经临床验证 467 例，中药组在控制出血，改善气虚症状，对血小板聚集缺陷的纠正及停药 1 年后复发率 等疗效方面均明显优于西药氨肽素、安络血、维生素 C、P 对照组。但其确切的药理作 用有待深入研究。 国家自然科学基金申请书 第 6 页 版本 1.003.094 2002 年本项研究继续获得国家自然科学基金资助（项目批准号 30171194），重点 研究了出血性血小板病膜糖蛋白受体变化及中药对其的影响。归纳研究的重点内容： ELISA 检测膜糖蛋白（ Membrane Glycoprateins，GP）Ⅱb、Ⅲa 含量减低，洗涤血小板 后又可恢复正常范围；流式细胞术测 GPⅠb/Ⅸ、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb、GPⅢa 及 p-选择 素表达荧光强度均低于正常人（P<0.05）；经中药治疗后，患者的血小板膜糖蛋白表达 增加，与正常组比较差异无显著性（P>0.05）而明显优于西药组（P<0.05）。提示益气 活血方在受体蛋白水平上调节血小板膜糖蛋白的表达是其治疗出血性血小板病的疗效 机理之一。值得指出的是，由于 GPⅠb 为血小板高亲和力凝血酶受体，而我们的研究 发现出血性血小板病患者 GPⅠb 低下，这就进一步启迪我们，该病发病机理可能与凝 血酶受体异常有关。 凝血酶是一个多功能血浆丝氨酸蛋白酶，它能活化血小板使之发生聚集。GPⅠb/ Ⅸ / Ⅴ复合物是血小板表面的重要膜糖蛋白，能与凝血酶结合，在血小板粘附及聚集过程 中起重要作用，长期以来被普遍认为是凝血酶受体。GPⅠb/ Ⅸ/ Ⅴ包括 4种成分：GP Ⅰbα、GPⅠbβ、GP Ⅸ、GPⅤ。很多资料表明，凝血酶高亲和力结合位点于 GPⅠb α，GPⅤ对凝血酶高亲和力结合位点形成有重要作用。近年来研究发现血小板表面还 存在一类重要的凝血酶受体，即 PARs (protease-activated receptors)，凝血酶的细胞反应 可部分地通过这一个 G 蛋白偶连受体的小家族介导进行信号传递，这一家族包括 PARl、 PAR2、PAR3 与 PAR4 四大成员。通常凝血酶反应由一个以上 PARs 受体介导，切割其 特定位点暴露新的氨基末端，从而形成一个固定配基与受体进行分子内结合，影响跨膜 信号传导。人类血小板表达 PARl 与 PAR4 受体，它们都能与 G12/13、Gq 家族偶连，并 通过分泌 ADP 引起 P2Y12 受体活化而间接激活 Gi 信号途径，引起血小板聚集、释放 以及膜糖蛋白的一系列改变。PARl 具有高亲和力，低浓度凝血酶即诱导其活化，产生 快速、强劲的血小板反应。PAR4 则亲和力较低，作用弱于 PARl，由高浓度凝血酶活化， 可以成为 PARl 途径的补充。PARs 受体的研究在国内尚刚起步，而国际上正成为热点。 因此进行凝血酶与血小板相互作用的研究，对于深刻了解出血性疾病的发病机制的机理 非常重要。 本项目根据我们十余年来对出血性血小板病研究的初步结果及中医药治疗的疗效， 国家自然科学基金申请书 第 7 页 版本 1.003.094 结合国内、外专家理论，认为不论何种诱导剂引起血小板聚集反应的途径如何，其前提 是血小板活化，凝血酶是最强的血小板活化剂，其可以调节血小板聚集、释放与内皮细 胞活化。因此研究血小板表面凝血酶受体功能对于出血与止血研究至关重要。而我们所 见的病例中多有 GPIb-I 复合物含量减低的，故初步推想这类出血性疾病可能是一组凝 血酶受体功能异常所致。而益气活血中药治疗该病的疗效机理之一，可能与调节凝血酶 受体存在一定关联。因此本课题拟用相应的单克隆抗体，流式细胞术及分子生物学等现 代新技术，研究本病中药治疗前后血小板活化过程的形态改变、聚集以及凝血酶受体的 动态变化过程，并分析这些活化过程中细胞骨架蛋白的改变，拟进一步从分子和受体水 平丰富出血性血小板病的病理实质及中药治疗的疗效机理。 主要参考文献 1. Shen Di, Wei Wenning , Wang Ailian,et al. A new variant of 沈迪，魏文宁，王辨明，等.一组 新型血小板聚集功能缺陷的初步研究. 中华内科杂志.1984，23（11）：669-670 2 . 沈迪，朱闽，王爱莲，等.未明原因多部位出血者血小板聚集功能的研究. 血栓与止血学杂 志.1996，3（4）：145-146 3. 沈迪，沈霖，王爱莲，等.脾不统血证 146 例血小板聚集功能的研究. 中国中西医结合消化杂 志，2001，9（2）：68-70 4. 沈迪，沈霖，王爱莲，等.消瘀片治疗新型血小板聚集功能缺陷的临床研究.中国中西医结合 杂志.1994,14(10):589-591 5. Shen Di, Shen Lin,Wang A L,et al. Clinical observation on effect of Xiaoyu Zhixue tablet on 104 patients with idiopathic multifocal bleeding and platelet aggregation defect.CJIM.1998,4(4):247-250 6. Shen Lin, Shen Lin, Gao Lan, et al. Effect of Xiaoyu Zhixue tablet on expression of platelet membrane glycoproteins in patients with hemorrhageic thrombopathy. CJIM.2004, 10(3):170-174 7. 沈霖，沈迪，杨胜兰，等. 健脾益气活血方治疗脾不统血併血小板聚集缺陷症疗效观察. 中国 中西医结合消化杂志. 2005，13（2）:80-82 8. Soslau G，Class R，Morgan DA，et a1．Unique pathway of thrombin-induced platelet aggregation mediated by glycoprotein lb. J Biol Chem，2001，276：21173-83 9. Skip Brass．Platelets and proteases．Nature．2001，413：26-7 10.Sambrano GR，Weiss E 了，Zheng YW et a1．Role of thrombin signaling in platelets in haemostasis and thrombosis．Nature，2001，413：74-8 11. Coughlin SR．Thrombin signaling and protease- activated receptors Nature．2001 407：258-64． 12.Chung AWY，Jurasz Paul，Hollenberg MD，et a1．Mechanisms of action of proteinase activated receptor agonists on humanplatelets．Br．J．Pharmacol，2002，135：1123-32． 13. Kim S，Foster C，Lecchi A，et a1．Protease activated receptors 1 and 4 do not stimulate Gi signaling pathways in the absence of secreted ADP and cause human platelet aggregation independently of Gi signaling. Blood，2002，99：3629-36 国家自然科学基金申请书 第 8 页 版本 1.003.094 2. 项目的研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题 2.1 研究内容 （1）出血性血小板病的凝血酶受体研究： ① 受体水平 ： A：出血性血小板病的 GPIb-IX-Ⅴ、GPIbα蛋白的表达及功能部位； B：出血性血小板病的 PAR1、PAR4 的表达及功能部位。 C：在此基础上，研究患者血小板被 PAR1、PAR4 活化肽刺激过程中细胞骨架蛋白成 分肌球蛋白、肌动蛋白、肌动连接蛋白以及 GPIbα水平的动态变化，了解本病发病过 程中两类凝血酶受体对血小板活化的影响程度与途径，以揭示本病皮肤粘膜出血的部 分机制。 ② 分子水平 A：对明显异常者，进行相应受体蛋白基因检测等后续分子生物学研究。包括出血性 血小板病的血小板 GPIbα 、PARⅠ、PAR4、mRNA 的表达；出血性血小板病的血小 板 GPIbα、PARⅠPAR4 的转录水平。 （2）益气活血方对出血性血小板病膜凝血酶受体的影响。 重点观察治疗前后患者 GPIb-IX-Ⅴ、GPIbα蛋白的表达变化以及细胞骨架蛋白的 变化，以部分阐明中药治疗的疗效机理。 2.2 研究目标 研究出血性血小板病的凝血酶受体的功能与活性等，拟从分子和受体水平探索该病 的发病机理，在此基础上运用益气活血方治疗，并重点观察中药对凝血酶受体的影响， 为中药治疗“受体性疾病”提供临床和理论依据。 2.3 拟解决的关键问题 （1）拟解决凝血酶受体的改变与出血性血小板病的发病关系。尤其是该病患者的凝血 酶受体是功能异常或是分子结构异常。 （2）拟解决中药治疗本病的作用环节，是否与调节凝血酶受体的功能有关。 3、拟采取的研究及可行性分析 3.1 研究方案 （1）病例选择：临床上选择符合出血性血小板病诊断患者及对照者，分为 4组： ①出血伴血小板聚集缺陷组 国家自然科学基金申请书 第 9 页 版本 1.003.094 ②出血而血小板聚集正常组 ③无出血症而血小板聚集缺陷组（对照组Ⅰ） ④无出血症而血小板聚集正常组（对照组Ⅱ） 这 4 组病例均参与实验研究和对比观察，争取积累足够病例及实验室资料。 （2）实验室检查：按血小板聚集途径分为 3部分。 ①血小板活化检测：采用免疫荧光单克隆抗体（CD63－异硫氰酸（FITO，TSD－藻红蛋 白及 CD62P－FITC）标记采凝血酶刺激后的血小板，应用流式细胞仪检测其阳性表达率。 ② GPⅠ-Ⅸ-Ⅴ受体检测： A：采用 CD42a-b-c（抗 GPⅠb/GPⅨ/GPⅤ）及 CD49b 或 SZ-2 单克隆抗体标记抗 凝全血，流式细胞仪下测定血小板 GPⅠbα含量。实验过程按本室报道的进行。 B：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及印痕转移（ Western blot）法测定 血小板表面 GPⅠba、GPⅨ、GPⅤ及 PAR1、PAR4 的蛋白表达及其之间的比例。并测 定 PAR1 与 PAR4 活化肽刺激血小板活化过程中细胞骨架蛋白成分肌球蛋白、肌动蛋 白、肌动连接蛋白以及 GPIbα的水平，实验过程按本室报道的方法进行。 C：在 PARs 肽刺激血小板活化同时，应用 Cytochalasin D(肌动蛋白多聚化抑制剂)、 BAPTA/AM(螯合胞内 Ca2＋)、Wortmannin(抑制磷脂酰肌醇-3-激酶 P13-K 及肌球蛋白轻 链激酶 MLCK)、ApyraseVII(低 ATP/ADP 酶，促使 ADP 分解)、Ro-31-2220(蛋白激酶 C 选择性抑制剂)及 Y27632(抑制 Rho 激酶)等多种血小板抑制剂， 比较它们对患者及 正常者血小板形态改变、聚集、释放、膜糖蛋白以及细胞骨架蛋白变化的影响， 有利 于研究 PARs 受体活化与出血性血小板病发病的部分关系，并探讨其他可能存在的信 号传导途径。 D：采用 RT-PCR 技术测定 PARⅠ、PAR4 及 GPⅠb/GPⅨ/GPⅤ、GPⅠbα mRNA 的表达及转录水平。 E：根据 Genebank 数据库已有的 PARⅠ、PAR4 及 GPⅠb/GPⅨ/GPⅤ、GPⅠbα cDNA 或氨基酸序列进行蛋白质三维结构分析，确定上述凝血酶受体的结合部位及其 与配体结合区域的关键蛋白质，重点检测其氨基酸编码碱基有无突变。 （2） 益气活血方治疗：将拟定的益气活血方药物水煎醇沉，粗提物制成片剂（前期已 经药效学、长、急毒、质控标准、稳定性试验及临床验证，作为院内制剂应用达 8 年）。 6 个月为一疗程。观察患者临床止血、血小板聚集功能恢复情况及疗效巩固情况，同时 国家自然科学基金申请书 第 10 页 版本 1.003.094 重点研究该方对凝血酶受体的影响。 3.2 可行性分析 （1）根据我们前期的初步实验，结合国内外专家的理论，出血性血小板病的发病极可 能与凝血酶受体的异常有关。 （2）结合我们运用益气活血中药治疗本病的经验和疗效，观察其对凝血酶受体的影响 可能是探讨中药疗效机理的关键途径之一。 （3）以上实验方法学及配套仪器的使用本实验室均已掌握。 4、 本项目的特色与创新之处 4．1 本研究出血在二个部位以上併血小板聚集缺陷的出血性血小板病为对象，应用 现代医学所发展的单克隆抗体、流式细胞术及分子生物学等新技术，拟从凝血酶受体 方面研究本病血小板聚集缺陷的病因病机，目前尚未见于文献资料。 4．2 应用中药益气活血治疗本病而取效，系我们研究组的优势和创新。本项目在上 述基础上，进一步探讨中药对凝血酶受体的影响，有利于发展中药治疗“受体异常性 疾病”的理论和实践。 5、年度研究计划及预期研究结果 5.1 年度研究计划 2006．01～12 病例及对照组选择；实验室检测。积累足够的病例及实验室资料。 2007.01～12 （1）分析上述各组病例存在的差异，其中可能存在的出血、不出血与实验室指标之间 的关系。 （2）中药治疗使患者出血症和血小板聚集缺陷得以纠正，恢复健康。 并设立西药对照 组。各组均在治疗后每 3个月复查 1次实验指标，停药后 1年观察其复发情况，并再次 进行实验室检查。 2008.01～12 （1）继续进行实验研究及观察中药治疗的效果，以验证本研究总结发病机理及中药作 用环节是否合于科学性和重复性。 （2）整理资料，发表高质量论文，为下一步鉴定作准备；在总结中发现的存在问题， 也可作进一步研究的方向。 （3）接受结题验收。 国家自然科学基金申请书 第 11 页 版本 1.003.094 5.2 预期研究成果 通过本项目的系统研究，极有望发现出血性血小板病可能是凝血酶受体的异常所致， 中药的疗效机理亦可能与与调节凝血酶受体的功能有关。故而认为本课题研究会有较 为满意的预期研究结果。计划在本项目实施过程中，培养 2 名博士生，2 名硕士生。 研究成果以发表论文、科研成果鉴定及科技进步奖提供。 （二）研究基础与工作条件 1、工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩） 1.1 1983 年发现“新型血小板聚集缺陷症”，其论文 1984 年在中华内科杂志发表，后 经 5 个省医学院校血液学专家反复验证后，发表论文证实。于 1987 年获国家教委科技进 步一等奖（编号 8732201），继获国家自然科学基金资助（编号 3870716）共发表论 16 篇，他人引用 11 篇，其成果于 1992 年获卫生部科技进步三等奖（编号Ⅲ－17）。1993 年在湖北省卫生厅课题资助下，运用中医辨证治疗本病、共发表有关论文 6 篇，他人引 用 2 篇， 于 2000 年获湖北省卫生厅二等奖。 1.2 1990 年发现在“新型血小板聚集缺陷症”病例中，患者血小板对其他诱导剂也可出 现聚集缺陷的病例，特称为“原因未明血小板病”，于 1993 年获国家自然科学基金资助 （编号 39370322），先后共发表论文 17 篇，他人引用 14 篇， 1.3 2002 年再获国家自然科学基金资助（编号 301194），重点研究了出血性血小板病 膜糖蛋白受体变化及中药对其的影响。并将本研究部分内容与前期研究一并总结成为 “中药治疗多部位出血性血小聚集缺陷临床和相关理论研究”成果，获 2003 年湖北省 科技进步 2等奖。 2、工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径, 包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况。） 2.1 我校中西医结合研究所（包括有 3个国家中医药管理局三级实验室）及血液病 研究所（下有血栓与止血、白血病、血液免疫、遗传及分子生物学、溶血性贫血研究 室及实验室、造血干细胞研究中心）均为湖北省重点学科，拥有开展本项目所需的所 有设备。包括血小板聚集仪（Chroano-Log 公司）；流式细胞仪（FACS Calibur）；全 自动血凝检测仪（ACL-200）；分子杂交 PCR 仪（PE-1000）；定量 PCR 仪（AT-9600）； 程控细胞冷冻仪（IceCube1610）；双波长荧光分光光度计（美国 F-2000）；微量超速离 国家自然科学基金申请书 第 12 页 版本 1.003.094 心机（日本 CS150GX）；透射式紫外检测仪（Hitachi－850）；超低温冰箱（FYMA725）； 高效液相色谱层析仪（Gilson715）；全自动酶标测定仪（HUMAREADER）；荧光显微镜 及医学图象处理系统（Nicon Fx-35DX）；全自动凝胶成象分析仪（Vilbel Lourmat）； 全自动核酸蛋白分析仪（Beckman Coulter）；DNA 合成仪（ABI3900）；全自动 DNA 测序 和片段分析系统（ABI3730XL）；核酸提取仪（ABI6700）；多肽合成仪（ABI433）；蛋白 质测序仪（ABI Procise）。 2.2 我校中西医结合研究所中药药理实验室（国家中医药管理局三级实验室）可以 对中药制剂的质量标准进行控制，有利于在本实验研究中尽可能减少该方面的可变因 素。 2.3 所需试剂可以购买。部分国内现难购买的多克隆抗体如 PAR1 及 PAR4 等可由本 课题参加者朱闽博士（我校客座教授，现在美国国立卫生研究院老年研究所工作）提 供。基因组 DNA 及本课题可能发现的定点诱变产物可由朱闽博士提供技术与相关的实 验平台。 3、申请人简历（包括申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期已 发表与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务。论著 目录要求详细列出所有作者、论著题目、期刊名或出版社名、年、卷（期）、起止页码 等；奖励情况也须详细列出全部受奖人员、奖励名称等级、授奖年等。） 3.1 沈霖（申请者） 男，1952 年 12 月出生。1982 年 12 月年毕业于湖北中医学 院中医系，分别于 1994 年 9 月～1996 年 8 月，2000 年 6 月～2001 年 2 月到德国海德 堡大学医学院研修分子生物学技术。现任华中科技大学同济医学院中西医结合研究所 副所长，中西医结合科主任，教授、主任医师、博士生导师。1995 年被授予湖北省有 突出贡献的中青年专家，享受国务院颁布政府特殊津贴。为中华中医药学会亚健康分 会副主任委员、湖北省中西医结合学会副理事长等。先后负责和主要参加了多项国家 和省部级课题，获 7 项湖北省科技进步 2、3 等奖（均为第 1、2 获奖者），发表论文 80 余篇。在前期二项国家自然科学基金资助的“出血性血小板病”研究中，是运用中 药治疗本病的初始意念者和主要设计者。拟定了益气活血方剂及负责进行了中医临床 观察和相关指标测定。2002 年 1 月－200412 月年作为国家自然科学基金课题“出血性 血小板病膜糖蛋白受体研究及益气活血方治疗作用（No:30171194）”的负责人，组织 和参加了该课题全部内容实施。在研究中，发现该病患者 GPⅠb 低于正常，而 GPⅠb cdp 机密 国家自然科学基金申请书 第 13 页 版本 1.003.094 为凝血酶受体，产生了本病发病机制可能与凝血酶受体异常有关，而中药疗效机理之 一可能与调节凝血酶受体有关的假想。为本课题的申请者和设计者。 申请者近期已发表与本项目有关的主要论著目录： （1）Shen Lin, Shen Di, Gao Lan, Liu Zhongping, Yang Yanping, Xie Jing, Zhou Piqi. Effect of Xiaoyu Zhixue tablet on expression of platelet membrane glycoproteins in patients with hemorrhageic thrombopathy. CJIM. 2004, 10(3):170-174 （2）沈霖，沈迪，杨胜兰，范恒，谢晶，王爱莲，高兰. 健脾益气活血方治疗脾不统 血併血小板聚集缺陷症疗效观察. 中国中西医消化杂志. 2005，13（2）：80～82 （3）沈霖，沈迪，范恒，杨胜兰，高兰. 出血性血小板病患者膜糖蛋白表达的研究. 血 栓与止血学，2005，11（2）：54～56 （4）沈霖 ， 沈迪 ， 高兰 ，刘仲萍， 杨艳萍， 谢晶， 周丕琪 . 消瘀止血片对出血 性血小板病患者膜糖蛋白表达的影响. 中医杂志，2005，（4）（已有录用通知） 申请者近期获得与本项目有关的学术奖励情况： （1）沈迪，沈霖，王爱莲，高兰，邹萍，魏文宁.中医辨证治疗新型血小板功能缺陷症 的研究”成果，获 2000 年湖北省卫生厅科技进步二等奖。 （2）沈迪，沈霖，邹萍，王爱莲，杨锐，张玉金，魏文宁.中药治疗出血性血小板聚集 缺陷临床及相关理论研究”成果，获 2003 年湖北省科技进步 2等奖。 3.2 沈迪（主要参加者），男，1922 年 7 月 1 日出生。1949 年毕业于前国立 中正医学院医疗系，曾任同济医科大学血液病研究所所长，内科主任，教授、主任医师、 博士生导师。1988 年卫生部授予全国文明建设先进工作者称号，享受国务院颁发的政 府特殊津贴。1983 年应用国内新提取的刺参酸性粘多糖作试剂，在皮肤粘膜出血和月 经过多者中，发现一组“新型血小板聚集功能缺陷症”，获 1987 年国家教委科技进步一 等奖（编号 8732201）。继之在国家自然科学基金（No:3870716）资助下研究其发病机 理，又获 1992 年卫生部科技进步三等奖（编号Ⅲ－17）。1990 年出血性血小板病研究 再次获国家自然科学基金（No:39370322）的资助。在 2002 年国家自然科学基金资助的 （No:39370322）课题中，主要负责指导和协调实验研究及部分临床病例的收集和观察。 已发表与本项目有关的主要论著目录： cdp 机密 cdp 机密 cdp 机密 国家自然科学基金申请书 第 14 页 版本 1.003.094 （1） 沈迪，沈霖，王爱莲，杨锐，魏文宁.消瘀片治疗新型血小板聚集功能缺陷症的 临床研究.中国中西医结合杂志.1994，14（10）：589-591 （2）沈迪，沈霖，王爱莲，刘仲萍，杨锐，魏文宁.消瘀止血片治疗未明原因多部位出 血伴血小板聚集缺陷 104 例临床观察.中国中西医结合杂志 1997，17（5）：280-282 （3）Shen Di，Shen Lin,Wang Ailian,Liu Zhongping,Yang Rei,Wei Wenning,Yang Yan.Clinical Observation on effect of Xiaoyu Zhixue tablet on 104 patients with idiopathic multifocal bleeding and platelet aggregation defect.CJIM.1998,4(4):247-250 （4）沈迪，沈霖，王爱莲，杨锐，杨焰，魏文宁. 脾不统血证 146 例血小板聚集功能 的研究.中国中西医结合消化杂志.2001，9（1）：8-10 近期获得与本项目有关的学术奖励情况： （1）沈迪，沈霖，王爱莲，高兰，邹萍，魏文宁.中医辨证治疗新型血小板功能缺陷 症的研究”成果，获 2000 年湖北省卫生厅科技进步二等奖。 （2）沈迪，沈霖，邹萍，王爱莲，杨锐，张玉金，杨焰，魏文宁.中药治疗出血性血 小板聚集缺陷临床及相关理论研究”成果，获 2003 年湖北省科技进步 2等奖。 3.3 朱闽（主要参加者），女，1957 年 12 月 31 日出生。1982 年毕业于同济医科 大学，1990 年在同济医科大学获得医学硕士，1996 年在 Tokushima 大学获得博士学 位。现为美国国立卫生研究院国立老年研究所研究员。2003 年被聘为我校客座教授 （每年回国工作 4 个月）。参加了先期的 2 个有关“出血性血小板病”国家自然科学 基金课题项目。现主要主要研究方向为有关胰岛细胞生长、分化的转录控制的分子 机制的研究；蛋白酪氨酸磷酸酶受体类型的作用；生物衰老过程的调控研究，热限 制及其与抗衰老有关的信号通道和潜在的分子机制研究。在本课题中主要承担凝血 酶受体蛋白和分子生物学实验的技术指导和协调工作。并提供部分凝血酶受体单抗 和有关试剂盒。 已发表与本项目有关的主要论著目录： （1）朱闽，沈迪，沈延春，王爱莲. 一组新型 ADP 诱导的正常血小板聚集图像参数. 血栓与止血杂志，1996，3（4）：147－149 （2）沈迪，朱闽，王爱莲，魏文宁，杨锐，刘仲萍. 未明原因多部位出血者血小板 cdp 机密 cdp 机密 cdp 机密 国家自然科学基金申请书 第 15 页 版本 1.003.094 聚集功能的研究. 血栓与止血杂志，1996，3（4）：145－146 （3）沈迪，朱闽，王爱莲，沈延春. 出血性血小板病患者血小板超微结构的研究. 华 中医学杂志，1997，21（2）：75～76 （4）Zhu M, Mizuno A, Kuwajima M, Ogino T, Murakami T, Noma Y, Sano T, Shima K. Ovarian hormone-induced pancreatic beta-cell hypertrophy contributes to the homeostatic control of beta-cell mass in OLETF female rat, a model of NIDDM. Diabetologia. 1998，41:799-805 （5）Zhu M, Mizuno A, Noma Y, Murakami T, Kuwajima M, Shima K, Lan MS. Defective morphogenesis and functional maturation in fetal islet-like cell clusters from the OLETF rat, a model of Type II diabetes. Int J Exp Diabetes Res. 2001，1:289-98 （6）Zhu M, Breslin MB, Lan MS. A novel zinc-finger binding cDNA, IA-1, is associated with rat AR42J cell conversing into insulin-producing cells. Pancreas. 2002， 24:139-14 （7）Zhu M, deCabo R, Lane MA, Ingram DK. Caloric restriction modulates early events in insulin signaling in liver and skeletal muscle of rat. Ann NY Acad Sci. 2004， 1019: 458-462 （8） Zhu M, Miura J, Lu LX, Bernier M, deCabo R, Lane MA, Roth GS, Ingram DK. Circulating adiponectin levels increase in rats on caloric restriction: the potential for insulin sensitization.Exp Gerontology. 2004 39:1049-1059 3.4 李蕾（主要参加者），女，1966 年 1 月 21 日出生。 1989 年－1999 年先后在 湖北中医学院，获学士、硕士、博士学位。现为华中科技大学同济医学院附属协和 医院中西医结合科主治医生。1999 申请的《针刺抗帕金森氏病脑细胞凋亡实验研究》 课题获德国 1999 年度 DAAD 科研基金课题资助。在德国罗施托克大学分子遗传学实 验室工作 3 年，参加国际课题合作，负责帕金森氏病 Synphilin-1 基因多态性和突 变筛选的研究工作。现负责湖北省卫生厅中医药中西医结合科研课题《针刺调节 缺血血管内皮细胞凋亡相关基因的差异筛选》及华中科技大学科研基金《帕金森病 Synphilin-1 基因突变筛选及银杏对 PD 鼠脑内 Synphilin-1 表达的实验研究》课题 的研究工作。主编和参编了 8 本著作。在本课题种主要承担相关分子生物学实验工 作。 已发表与本项目有关的主要论著目录： (1) Frank P.,Carsten H.,Karsten M., Lei Li, Olaf R. and Rejko Krugerl. Identification and functional characterization of a novel R621C mutation in cdp 机密 cdp 机密 国家自然科学基金申请书 第 16 页 版本 1.003.094 the synphilin-1gene in Parkinson’ s disease. Human Molecular Genetic, 2003,Vol, No.11 1223-123 4、承担科研项目情况（申请者和项目组主要成员正在承担的科研项目情况， 包括自然科学基金的项目，要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、负责的内 容等。） 1、川脊片治疗颈椎病的新药开发研究 湖北省科技攻关课题 经费来源：湖北省科技厅； 起止年月：2005.01～2007.12；主持人：沈霖 2、补肾健骨方含药血清对成骨细胞 OPG mRNA 表达的影响 湖北省卫生厅课题（编号：鄂卫发〔2004〕79 号） 经费来源：湖北省科技厅； 起止年月：2004.01～2005.12；主持人：沈霖 5、完成自然科学基金项目情况（对申请者负责的前一个已结题科学基金项 目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。 另附该已结题项目研究摘要（限 500 字）和相关成果的详细目录。） 申请者负责 2002 年 1 月－2004 年 12 月的国家自然科学基金项目完成情况如下： 5.1 项目名称：出血性血小板病膜糖蛋白受体研究及益气活血方治疗作用 5.2 批准号：30171194 5.3 完成情况：已完成并结题。研究部分内容获 2003 年湖北省科技进步 2 等奖。在 中国中西医结合杂志（英文板版）、中医杂志等发表或已录用论文 4 篇；另有 6 篇论文 （2005 年待答辩的 2 名博士研究生，1 名硕士研究生论文）近期已投稿。 5.4 研究进展及与本申请项目的关系：本研究发现，出血性血小板病患者 GPⅠb 、 GPⅠb/Ⅸ、GPⅢa、GPⅡb/Ⅲa 及 P-选择素表达水平明显低于正常人。由此分析，本组 病例血小板膜 GPⅠ降低、引起 GPⅠb/Ⅸ降低，vWF 及凝血酶不能与之有效结合；GP Ⅲa 降低、引起 GPⅡb/Ⅲa 降低，在不可逆的血小板聚集过程中，使之与纤维蛋白原识 别和结合的位点减少，导致临床出血，血小板聚集不良或异常。P-选择素水平下降，可 反映患者在出血期间，血小板活化状况低于正常。 由于 GPⅠb 是血小板膜上一种重要的凝血酶受体，很多研究资料表明，凝血酶活 国家自然科学基金申请书 第 17 页 版本 1.003.094 化血小板时涉及两种细胞膜成份：G 蛋白偶联的七个穿膜区受体和 GPⅠb-Ⅳ -Ⅴ复合 物，通过两种不同的途径活化血小板。GPⅠ b 为血小板高亲和力凝血酶受体，GP-Ⅴ是 血小板表面的凝血酶底物，对凝血酶高亲和力结合位点 GPⅠ bα形成有重要功能；而 七个穿膜区受体为中亲和力凝血酶受体。这就启迪我们，本病的部分发病机理是否与患 者凝血酶受体功能或结构异常有关。因此，进一步研究本病患者出血过程中，其凝血酶 和 GPⅠb-Ⅳ -Ⅴ复合物的结合与七个穿膜区蛋白酶受体 PARl， PAR4 活化之间的关系 具有重要的理论和临床意义。 本研究拟定的益气活血方在控制本病出血，对血小板聚集缺陷的纠正及停药 1 年 后复发率等疗效方面均明显优于常规西药。用该药治疗半年后，能有效的提高患者低于 正常的 GPⅠb 、GPⅠb/Ⅸ、GPⅢa、 GPⅡb/Ⅲa 及 P-选择素表达，从而改善血小板活 化状态，以达到控制出血症状，恢复血小板聚集功能之功。表明：中药治疗出血性血小 板病的疗效机理之一，是能够在受体蛋白水平上调节部分血小板膜糖蛋白的表达。同时 也提示，中药疗效机理还可能与调节 GPⅠb 等凝血酶受体有关。确有深入研究价值。 由此可见，本申请的课题是在近期结题的自然科学基金项目研究发现基础上的进一步拓 开的思路、方向及后续研究。 5.3 已结题项目研究工作总结摘要（限 500 字）和相关成果的详细目录 研究工作总结摘要： 本项目观察了益气活血方对出血性血小板病患者血小板膜糖 蛋白表达的影响，探讨了其治疗该病的可能机制。148 例出血性血小板病患者随机分为 两组，中药组 98 例用自拟益气活血方消瘀片治疗；西药组 50 例用安络血、维生素 C、 K、P 治疗，两组均治疗 6 个月。观察两组治疗后止血疗效及血小板聚集恢复率。采用 流式细胞术检测了两组治疗前后及 34 例健康人的血小板膜糖蛋白 GPⅠb/Ⅸ、GPⅡb