胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭

二、立论依据 （包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处） 对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义； 对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。 重症肝炎（又称暴发性肝功能衰竭）发生多与肝炎病毒感染、化学药物中毒等因素有关，我国又是病毒性肝炎发生大国，每年都有相当一部分病人患重症肝炎，每年仅重医大附二院传染科收治的重症肝炎病人就近几十例。重症肝炎以起病急、病情进展快、病死率高为特点，目前对它的发生机制仍未搞清，因此它严重威胁着人们的生命健康。国内现主要以综合疗法治疗重症肝炎，此疗法虽对改善疾病的某些症状有一定帮助，但并未从根本上改变该病的预后。国外多以肝移植来治疗本病，其近期疗效明确而肯定，但远期疗效因受免疫排斥反应的制约而不容乐观。近两年国内几家大医院也相继开展了肝移植手术，但受手术复杂性、器官来源以及接受肝移植者需长期服用免疫抑制剂来避免排斥反应发生所造成的高昂药费和长期使用免疫抑制剂可能造成肾损害等因素的制约，仍限制了此疗法的开展。 人和哺乳动物的肝脏具有强大的再生功能，2/3肝切除后的动物在10-15天左右残存肝脏可恢复到术前体积，而重症肝炎患者多表现为缺乏这种再生能力。究其原因除了残存肝细胞不能为机体代谢提供足够的肝功能支持外，激活的免疫细胞及其产生的炎症因子仍不断造成残存肝细胞坏死，甚至杀伤新生肝细胞，从而严重阻碍了肝脏的再生。近年来越来越多的研究证实肝内和浸润的单核巨噬细胞及其产生的炎症因子在造成肝细胞大量坏死、杀伤新生肝细胞方面起了极其重要的作用（1，2）。如果抑制或删除肝内的单核巨噬细胞，或中和炎症因子就能大大改善肝脏的再生能力（3，4，5）。在这些研究中人们多使用相应的单克隆抗体来删除或中和单核巨噬细胞和它们产生的炎症因子。但单克隆抗体多来自小鼠杂交瘤细胞，用于人体治疗受到限制。急性肝功能衰竭时如能提供一定数量的外源性肝细胞和某种能抑制肝内单核巨噬细胞功能的物质，起到既阻止残存肝细胞进一步坏死和杀伤新生肝细胞，又能避免外源性肝细胞遭到排斥，同时还能支撑机体代谢需要，减轻残存肝细胞的负担，使它们有足够时间再生，达到治愈肝功能衰竭的目的。众多的动物实验已证明肝细胞移植加免疫抑制剂可满足这一目的（6，7，8），但免疫抑制剂都是非特异地抑制机体的整个免疫系统，在降低免疫反应的同时也降低了机体的抵抗力，常常引起严重的继发感染，而且免疫抑制剂多有严重的毒副作用，如临床常用的环孢霉素A就有严重的肾毒性，这些在重症肝炎常是导致病人死亡的危险因素。 1994年Hagiya从乳鼠肝脏中分离出一种能促进肝脏再生的物质，并克隆了它的cDNA，为它取名为肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration，ALR）（9）。我们已从人胎肝组织中克隆出人ALR cDNA，成功构建了它的真、原核重组表达质粒，并进行了高效表达（10，11）。新近的研究发现ALR能通过抑制肝内NK细胞的活性来促进肝细胞再生（12，13）。在胎胰岛细胞移植加ALR治疗糖尿病大鼠的研究中也发现，凡在移植细胞部位加注ALR的大鼠血糖都恢复到正常水平，而单独接受胎胰细胞移植治疗的大鼠无一只血糖恢复正常，说明ALR使移植的胎胰细胞避免了排斥反应，能存活并发挥功能（14）。基于这些最新研究成果，我们拟探讨胎肝细胞移植与ALR联合运用治疗急性肝功能衰竭的可行性及其相关机制，期望为临床治疗重症肝炎找到确实有效，又经济可行的治疗方法；同时探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法；并通过本研究观察在急性肝损伤时血和肝组织中ALR和TNF-α、IL-1等炎症因子的变化关系，进一步阐明ALR的作用机理。本课题如获成功必将为重症肝炎患者带来福音，产生巨大的社会效益及经济效益。 1． 顾长海，王宇明。急性肝衰竭。成都；四川科学技术出版社，1997；11-21 2．Nikola LV, Lorenzo P, Alessandro A, et al. Changes of liver-resident NK cells during liver regeneration in rats. J Immunology 1995; 154:6324-6338 3．Blazka ME, Elwell MR, Holladay SD, et al. Histopathology of acetaminophen-induced liver changes: ole of interleukin 1 alpha and tumor necrosis factor alpha. Toxicol Pathol 1996; 24:181-189 4．Tamura F, Masuhara A, Sakaida I, et al. FK506 promates liver regeneration by suppressing natural killer cell activity. J Gastroenterol Hepatol 1998; 13:703-708 5． Boulton RA, Alison MR, Golding M, et al. Augmentation of the early phase of liver regeneration after 70% partial hepatectomy in rats following selective kuffer cell depletion. J Hepatol 1998; 29:271-280 6． Takeshita K, Ishibashi H, Suzuki M, et al. Hepatocellular transplantation for metabolic support in experimental acute ischemic liver failure in rats. Cell Transplant 1993; 2:319-324 7． Demetriou AA, Reisner A, Sanchez J, et al. Transplantation of microcarrier-attached hepatocytes into 90% partially hepatectomized rats. Hepatology 1988; 8:1006-1009 8． Mito M, Susano M, Sawa M, et al. Hepatocyte transplantation for hepatic failure. Transplant Rev 1993; 7:35-43 9． Michio Hagiya, Antonio Francavilla, Lorenzo Polimeno, et al. Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liver regeneration(ALR) gene: Expression of biologically active recombinant ALR and demonstration of tissue distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91:8142-8146 10. 中华肝脏病杂志。1999; 7(3) 11. 中华肝脏病杂志 2000；8（1） 12. Francavilla A, Vujanovic NL, Polimeno L, et al. The in vivo effect of hepatotrophic factors augmenter of liver regeneration, hepatocyte growth factor, and insulin-like growth factor-II on liver natural killer cell functions. Hepatology 1997; 25:411-415 13. Tanigawa K, Sakaida I, Masuhara M, et al. Augmenter of liver regeneration (ALR) may promote liver regeneration by reducing natural killer (NK) cell activity in human liver diseases. J Gastroenterol 2000; 35:112-119 14. Adams GA, Maestri M, Squiers EC, et al. Augmenter of liver regeneration enhances the success rats of fetal pancreas transplantation in rodents. Transplantation 1998; 65:32-36 －3－ 三、研究 1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 （1） 研究目标： 通过本研究探讨胎肝细胞移植与ALR联合运用治疗急性肝功能衰竭的可行性及其相关机制，期望为临床治疗重症肝炎找到确实有效，又经济可行的治疗方法。同时探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。同时通过观察在急性肝损伤时血和肝组织中ALR和TNF-α、IL-1等炎症因子的变化关系来进一步阐明ALR的作用机理。 （2） 研究内容： a：D-氨基半乳糖制造大鼠急性肝功能衰竭模型； b：Ⅳ型胶原酶灌注消化胎鼠肝脏制备胎肝细胞； c：电转化带有HBV-S基因的重组真核表达质粒pCDNA3.1-S入胎肝细胞； d：ELISA法或免疫组化法检测含pCDNA3.1-S的胎肝细胞体外培养时表达HBsAg的情况； e：比较经不同冻存条件、不同冻存时间处理后，胎肝细胞复苏存活率； f：用ELISA法和免疫组化法检测造模组和正常鼠血及肝组织中的ALR，了解ALR的变化情况； g：用组氨酸亲和层析柱纯化大肠杆菌BL21（DE3）表达的大鼠ALR； h：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间动物存活率的差别； i：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间肝脏生化指标、常规病理变化； j：免疫组化法检测不同治疗组存活动物肝组织内HbsAg的表达及分布，以判断移植细胞的存活情况； k：用ELISA法和Northern blot检测不同处理组动物血中和肝组织内TNF-α、IL-1水平及它们的mRNA表达情况，探讨ALR的作用机理； l：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间肾脏生化指标、常规病理变化。 （3） 拟解决的关键问题： 重症肝炎的高死亡率一直困扰着临床医生，除肝移植外至今仍无有效治疗方法。我们拟通过本研究探明胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭的可行性，希望能为重症肝炎的治疗找到突破性方法。探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。同时可进一步阐明ALR的作用机理、在急性肝损伤时的变化规律以及明确它在肝脏的细胞来源。 －4－ 2. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 （1）研究方法、技术路线、实验方案： D-氨基半乳糖制备 胶原酶消化胎鼠肝 冻存、复苏 大鼠急性肝衰竭模型 制备胎肝细胞 纯化的大鼠ALR 电转化质粒 pCDNA3.1-S 至胎肝细胞 对照组 FLC＋CsA FLC＋ALR FLC ALR 比较各项检测指标 如果FLC＋ALR组有效， 再与冻存细胞进行治疗比较 注：图中FLC为胎肝细胞；CsA为环孢霉素A；ALR为肝再生增强因子。 （2）可行性分析：本课题的难点是消化分离胎肝细胞、胎肝细胞的冻存复苏、获取大量纯品ALR和鉴定移植的胎肝细胞存活状况。对于前两项相信通过反复摸索实验条件一定能获得满意结果。由于本课题是我们前一自然科学基金项目的延续。我们已构建了人和大鼠ALR的真、原核重组表达质粒，并成功地将其在真核和原核表达系统中进行了表达，获得了高效表达菌株，只要将表达产物用带镍离子的层析柱分离就可得到大量纯品ALR。我们研究所已构建了一系列含HBV-S基因的重组真核表达质粒，只要将这些表达质粒转入胎肝细胞再用于移植，就能区判定移植细胞的存活情况。此外我们还完成了人和大鼠ALR的多克隆和单克隆抗体的制备，为检测血和肝组织中的ALR提供了检测手段，要完成本课题研究应不成问题。 3. 本项目的创新之处 （1） 首次探讨胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝功能衰竭的可行性； （2） 首次观察急性肝损伤时血和肝组织内ALR的表达变化情况及它对TNF-α、IL-1等炎症产生的影响； （3） 首次探讨胎肝细胞低温保存和复苏条件，以及作为移植供者细胞的可行性。 －5－ 4. 年度研究计划及预测进展 2002年1－12月：完成动物肝损伤模型建立的预实验、ALR表达的肝内定位； 完成胎肝细胞的制备、胎肝细胞的转化、HbsAg表达的鉴定； 完成大鼠ALR的表达及纯化； 完成不同保存条件、不同保存时间胎肝细胞复苏存活率比较； 2003年1－12月：完成胎肝细胞移植与ALR联合治疗大鼠急性肝衰的疗效评价； 完成新分离与冻存胎肝细胞与ALR联合治疗大鼠急性肝衰的疗效评价； 完成不同处理组动物血及肝组织内TNF-α、IL-1变化的比较； 2004年1－ 6月：完成所有的研究工作。 6－12月：总结资料，发表文章及申报成果。 5． 预期研究成果 通过本研究探明胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭的可行性，如能成功将为临床治疗重症肝炎找到了突破性方法，这必将产生巨大的社会效益和经济效益。同时探索出胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。通过本研究还进一步阐明ALR的作用机理、在急性肝损伤时的变化规律，为重组人ALR今后的临床应用前景作出科学评估并提供实验依据。研究成果将以论文形式发表在中华系列或国际刊物上（预计完成论文4-7篇），并申报相应的科技成果奖。 －6－ 四、研究基础 1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩 本课题为我们前一“自然科学基金项目“的延续。在前一课题中我们已完成人ALR读码框的cDNA克隆及测序，与国外报道的大量鼠ALR读码框的核苷酸及氨基酸序列比较，其同源性分别为86.5%和85.6%，构建了人ALR的真、原核重组表达质粒，并成功地将其在真核和原核表达系统中进行了表达，获得了高效表达菌株和重组的人ALR。此后又完成了大鼠ALR读码框的cDNA克隆和真、原核表达质粒的构建及表达。去年我们又进一步完成了由重庆市卫生局资助的针对人和大鼠ALR的多克隆和单克隆抗体的制备。此外，我们研究所已构建了一系列含HBV-S基因的重组真核表达质粒。这些成果的取得为本课题的研究提供了可靠的物质保障。 课题申请者长期从事病毒性肝炎的发病机理及治疗的研究。作为课题的主研人员之一曾参加过研究所承担的国家“六.五”、“七.五”、“八.五”有关病毒性肝炎防治的攻关课题研究，多次荣获国家科委、卫生部、四川省和重庆市的科技进步奖。90－93年底作为访问学者赴英国伯明翰大学医学院附属医院肝病中心从事免疫抑制药物FK506作用机理的课题研究，回国后又承担了国家教委优秀青年教师基金和国家自然科学基金资助的“肝细胞生长多肽基因克隆及其对免疫系统影响”的课题研究。申请者具有扎实的分子生物学和免疫学理论知识，极强的科研能力和实验技能，课题组主要成员均有长期从事实验研究的工作经历，这为本课题能顺利进行提供了可行的人员和技术力量的保证。 2. 已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况） 我所为国家教委重点学科，我所为卫生部临床药理实验基地和重庆市分子生物学重点实验室，拥有良好的工作条件和许多精密仪器。其主要设备有：超速离心机、液相闪烁计数仪、高速冷冻离心机、台式高速冷冻离心机2台、全波长分光光度仪、γ-射线能谱仪、CO2培养箱3台、PCR仪2台、超净工作台、多功能电泳仪、核酸测序仪、低温冰冻离心机、超低温冰箱、电转化仪、凝胶成像系统、高压和常压层析系统、超声破碎仪、蛋白质电泳装置、荧光显微镜、细胞收集器、倒置显微镜、多功能扫描仪等。 －7－ 3. 申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著目录*和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务；青年科学基金申请者还应注明学位论文名称及导师姓名与工作单位 8篇 * 论文：作者·题目·刊名·年份·卷（期）·页码 专著：作者·名·出版者·年份 －8－ 五、经费预算 支 出 科 目 金 额 （万元） 计 算 根 据 及 理 由 1. 合 计 20．0 （一）科研业务费 2．5 实验动物 0.8 大白鼠、胎鼠各200只(15元/只)及饲料等 文献检索,资料复印 0.3 论文发表,会议,成果鉴定 0.8 临工费 0.6 300元/月×20月 (二)实验材料费 15．8 生化试剂 4．0 D-氨基半乳糖、IV胶原酶、组氨酸亲和柱等 免疫学试剂 2．5 IL-1、TNF-α检测Kit，ELISA和免疫组化检测试剂 分子生物学试剂 4．5 DIG-标记、总RNA提取Kit，引物合成, Taq酶, dNTP, 细胞培养 2．5 DEME、RPMI-1640培养基、胎牛血清、液氮、CO2等 其他常用试剂 1．5 细菌培养基、Hank氏液、常用试剂等 低值易耗物品 0．8 细胞培养板、酶标检测板、细菌培养瓶、培养皿等 （三）协作费 0．7 病理切片制作、病理诊断等 （四）项目组织实施费 1．0 占总经费的5% 注: 预算支出科目按下列顺序填写: 1. 科研业务费 2. 实验材料费 3. 仪器设备费 4. 实验室改装费 5. 协作费 6. 项目组织实施费。开支范围详见《国家自然科学基金资助项目财务》第二章。 －9－ 六、申请者正在承担的其它研究项目 （攀登计划、863计划、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号、任务来源、起止年月、负责或参加以及与本申请项目的关系等情况） 作为课题负责人正在执行教育部骨干教师基金[教技司（2000）65文]资助的研究。起止日期：2000.1—2002.12。此研究属ALR系列研究之一。 七、申请者承担（负责或参加）国家自然科学基金资助项目的情况 批准号 项目名称 起止年月 负责或参加 进展或完成情况 1996年1月－1998年12月 负责 已完成 －10－ 对申请者负责的前一个已结题科学基金资助项目（项目名称及批准号）完成情况，后继研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目《研究摘要》（300字）及已发表主要相关论文首页复印件（限三篇）。 申请者负责的由自然科学基金资助的已于98年12月结题。现已构建大鼠ALR的原核表达系统，为进一步研究ALR的生物学功能和作用机理打下基础。ALR是近年才发现并克隆的一种新的促肝细胞生长因子，人ALR是最近两年由国内学者率先克隆成功的，所以对它的生物学功能才刚刚起步。从在体内的广泛分布来看，它的生物学功能应远不止限于促肝细胞生长，其作用部位也不应限于肝脏。目前即使是它在肝脏损伤后再生时的作用机理的研究也少有报道。我们希望通过本课题研究进一步阐明它的作用机理以及与临床肝损伤后肝再生的关系，为它今后的临床应用提供切实可靠的实验依据。 结题项目≤研究工作总结摘要≥： 以人胎肝总RNA为模板，用RT-PCR和基因重组技术克隆了人ALR阅读框cDNA，它全长378个核苷酸，编码125个氨基酸。与大鼠ALR和人ALR阅读框的核苷酸序列同源性分别为86.5％和99.2％。将克隆片段分别装入pET-11a和pcDNA3质粒中，构建了原核表达质粒pET-11a-hALR和真核表达质粒pcDNA3-hALR，并在大肠杆菌BL21（DE3）和COS-7细胞中进行了表达。在BL21（DE3）中的表达量占菌体蛋白量的20%，分子量约为15KD，用转染的COS-7细胞培养上清和细胞匀浆测活，仅细胞匀浆有刺激活性。在体外它能刺激HepG2、QGY等肝源性细胞增殖，不能使L929细胞增殖。首次观察了重组人ALR在体外对人外周血淋巴细胞在PHA刺激下产生IL-2和T13细胞（NK细胞系瘤株）在LPS刺激下产生IL​-1、TNF-α的影响，发现它对以上两种细胞产生的细胞因子均无影响。 八、申请者承诺 我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助，我与本项目组成员将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，按计划认真开展研究工作，按时报送有关材料。 申请者（签章） 年 月 日 －11－ 九、推荐意见 （不具有高级专业技术职务的申请者，须有两名具有高级专业技术职务的同行专家推荐。推荐时，请认真负责地介绍申请者及其项目组成员的业务基础、研究能力、科研态度及研究条件等。项目组成员不能做推荐者） 推荐者（签章） 专业技术职务 专长 所在单位： 推荐者（签章） 专业技术职务 专长 所在单位： －12－ 十、申请者所在单位及合作单位的审查与保证 1. 申请者所在单位学术委员会的审查意见（包括：对项目的意义、特色和创新之处及申请者的研究水平与学风签署具体意见） 重症肝炎的高死亡率一直困扰着临床医生，除肝移植外至今仍无有效治疗方法。申请者拟通过本研究探明胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭的可行性，希望能为重症肝炎的治疗找到突破性方法。并探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。同时进一步阐明ALR的作用机理、在急性肝损伤时的变化规律以及明确了ALR在肝内的细胞来源，为重组人ALR今后的临床应用前景作出科学评估并提供实验依据。 肝再生增强因子（ALR）是近年从新生大鼠肝脏内发现和克隆的一种新的促肝细胞生长因子。而人ALR又是最近两年才克隆成功，对它的生物学功能的研究才刚刚起步。它与临床各种肝脏疾病关系的报道尚少见。本研究通过探讨免疫性肝损伤时ALR对肝内免疫细胞的功能及炎症因子产生的影响、观察与乙型肝炎病情及预后的关系，进一步阐明ALR的作用机理，并为重组人ALR今后的临床应用前景提供很有价值的实验依据。制备的人ALR抗体除可供临床检测用外，还能广泛应用于其它有关ALR的研究中。 申请者已完成了人ALR的cDNA、真核和原核表达及活性的初步研究，并已完成大鼠ALR原核表达质粒构建和表达，以及制备了相应的多克隆和单克隆抗体，这些都为本课题的完成提供了可靠的物质物质保障。本课题是上一课题的延续，选题新颖，将基础研究与临床应用很好地结合起来，为临床疑难病的治疗寻找新疗法，研究方案可行，预算合理。 课题申请者思维活跃，学风严谨，具有相关学科扎实的理论基础和极强的研究能力。由他负责本课题可行、可靠，建议给予资助。 主任或副主任（签章） 年 月 日 －13－ 2. 合作单位的审查意见与保证 同意参加合作研究，保证对参加合作研究人员时间及工作条件的支持、督促其按计划完成所承担的任务（及需要说明的其它问题） 合作单位1（公章） 合作单位2（公章） 合作单位3（公章） 3. 申请者所在单位领导的审查意见与保证 已按填报说明对申请人进行了资格审查，对内容进行了审核，同意学术委员会的审查意见，并保证在项目获得资助后做到以下几点： (1) 保证对研究计划实施所需的人力、物力和工作时间等条件给予支持。 (2) 严格遵守科学基金委员会有关资助项目管理、财务等各项规定。 (3) 督促项目负责人和本单位项目管理部门按科学基金委员会的规定及时报送有关报表和材料。 需要说明的其它问题： 单位负责人 （签章） 单位（公章） 年 月 日 －14－