治疗性乙肝疫苗研究进展

第一军医大学分校学报 2O04年 12月第 27卷第 2期 J Bran Camp First Mi1 Med uIliv Vol 27 N0 2 December 2OO4 ．195 ． 治疗性乙肝疫苗研究进展 【文章编号】1009—1793(2004)02—0195—05 刘朝霞 ，田泽维 (综述) (1．南方医科大学分校检验教研室，广东省广_州市 510315；2．广空后勤部卫生处，广 东省广州市 510052) 【摘要1 治疗性疫苗是指能打破慢性感染者体内免疫耐受、重建免疫应答的新型疫苗 ，以诱导细胞免疫应答为主，是抗 病毒 、抗肿瘤治疗新手段 。乙肝治疗性疫苗研究在多分子蛋白疫苗、抗原抗体复合物 、表位疫苗及 DNA疫苗方 面均取得一定 进展 ，部分新型疫苗甚至能部分清除肝细胞内 eeeDNA，为治疗慢性乙肝提供 了新的手段 。 【关键词】 乙型肝炎；治疗性疫苗；进展 【中图分类号】 R 512．6 【文献标识码】 A Progress on HBV therapeutic vaccine LIU Zhao—xia，TIAN Ze—wei．(Department of Laboratory Medicine，Southern Campus of Southern Medical Univer． sity，Guangzhou 5 103 15，China) 【Abstract】 Therapeutic vaccine，which can break up immunological tolerance and stimulate specific immune response． is an efficient new technique on treatment of chronic infection disease and tumor This article introduced the progress on the HBV therapeutic peptide vaccine，DNA vaccine and its adjuvant． 【Key words】 hepatitis B；therapeutic vaccine；progress 治疗性疫苗是指能打破慢性感染者体内免疫耐 受、重建或增强免疫应答的新型疫苗 ，以诱导细胞免 疫应答为主，是抗病毒、抗肿瘤新的治疗手段。由于 CTLs和 Thl细胞因子是抑制病毒复制和清除细胞 内病毒的主要因素 ，因此 ，通过增加 HBV结构或非 结构蛋白表位和糖基侧链修饰成分 ，或改变疫苗形 式、辅以不同分子佐剂等方法研制新型乙肝治疗性 疫苗，以打破耐受 、重建免疫应答，激发慢性乙肝患 者体内产生中和抗体和 以 CTL应答为主的细胞免 疫应答，达到清除肝细胞内病毒的 目的。乙肝治疗 性疫苗为治疗慢性乙肝提供 了新的手段，现就其研 究进展作一综述。 l 蛋白或多肽疫苗 1．1 重组蛋白疫苗 重组蛋白疫苗作为预防性疫 苗在降低 HBV感染率方面做出了重要贡献，但市售 乙肝疫苗一般为酵母源 s蛋 白，构象及糖基侧链均 不同于天然状态 ，其无／低应答率高达 5％ ～10％． 【收稿日期】 2004—07一Ol 【作者简介】 刘朝霞(1971一)，女，本科，讲师，主要从事 临 床医学检验教学与研究。 且一般不能诱导细胞免疫应答，尤其 CTL应答，因 此 ，研究者为提高应答率和增强诱导细胞免疫应答 能力而不断探索新型疫苗。 preS含有肝细胞结合序列和高效 rI’h表位，能增 强 s蛋白免疫原性 ，对提高疫苗应答率和打破免疫 耐受具有积极作用。含 preS2、CHO细胞源 M蛋白组 成的 GenHevac B疫苗能迅速诱导保护性抗 preS2和 抗 S抗体，与 IFN—a联用效果更佳，可激发部分低／ 无应答者体内保护性应答n】，约 72％低应答儿童接 种后能激发抗 HBs抗体，并降低部分慢性乙肝患者 血清中病毒 DNA拷贝数[ ，表明 GenHevac B在预防 方面优于 s蛋白疫苗。但 GenHevac B接种不能有 效降低免疫耐受儿童血清中病毒 DNA拷贝数e ，且 无清除或降低肝细胞 内 cccDNA含量的实验证据 ， 因此 ，GenHevac B的治疗效果仍不确定。含 S(adw 和 ayw)、preS~一S(ayw)及新型 preS1一S(preS1 20— 47aa ayw+S adw)4种成分、C1271细胞源新型多分 子疫苗 Hepacare免疫原性更强 ，在小鼠、大猩猩和人 体内均能激发强烈体液和细胞免疫应答 ，低／无应答 者中应答率也 达 70～80％，且激发 的抗体滴度更 高、更持 久HI5 J，预 防效果 优于 GenHevac B。由于 维普资讯 http://www.cqvip.com · 196 · 第一军医大学分校学报 2004年 12月第 27卷 Hepacare在慢性乙肝患者体内激发的细胞免疫应答 以 n 淋巴细胞增殖和 Th2细胞因子分泌为主，特异 性 CD8 T细胞增殖并不明显 ，虽能降低血清病毒负 荷 ，抑制病毒复制 ，但 CTLs活性低 ，仍不能有效清除 肝细胞内 cccDNA，治疗作用仍不理想-6 J。因此 ，增 加 preS成分的新型疫苗虽提高 了应答率和增强 了 预防效果，仍不是理想的治疗性疫苗。 改变抗原提呈方式或增加糖基化修饰成分 ，增 强免疫原性和调控应答类型 ，是治疗性疫苗研究的 另一途径。由 FcR介导的提呈有利于增强 MHC—I 类提呈途径 ，为此闻玉梅 等【7,8 J研究了 HBsAg一抗 HBs抗体复合物(YIC或 HBIG)的治疗作用，结果表 明，该 Ic不仅能打破 HBsAg转基因小 鼠的耐受状 态，且激发 n1型应答 (IFN一7及 IL一12分泌增 加)，使血清 HBsAg转阴，初步显示 了抗原 一抗体复 合物(Ic)的免疫治疗作用。临床研究进一步发现 ， 约 26．1％慢性 HBV感染者接种 HBs一抗 HBs复合 物 6个月后血清病毒 DNA转阴，且另有 17．4％受试 者血清病毒 DNA拷贝数显著降低-9 J，明显高于 HB． sAg自然转阴率(约 7％)，显示了 HBs一抗 HBs复合 物在打破免疫耐受和清 除病毒颗粒上的作用。目 前 ，这种抗原 一抗体复合物疫苗(乙克)已正式批准 进入临床试验，能否有效降低、清除肝细胞内 cccD． NA，达到彻底清除肝细胞内病毒的 目的尚待试验证 实。 1．2 短肽疫苗 相对于抗原抗体复合物制备繁琐 而言，短肽疫苗的合成与修饰则更简便 ，且短肽疫苗 去除了结构蛋 白中的无效序列和免疫抑制性序列， 仅包含免疫有效成分，因此，具有更加高效和针对性 强、副作用低的特点。由于表位锚着基序 、侧翼序列 影响表位亲和力和切割、提呈效率 ，因此，在表位优 化及组合、串连方式等研究取得更多经验基础上 ，多 表位短肽疫苗完全可以实现高提呈效率和应答类型 可控，并在糖基、脂质修饰或辅以适当佐剂基础上克 服其免疫原性弱的固有缺陷 ，成为有实用价值的高 效预防或治疗性疫苗。如表位 3o与 HBc．8～"串连 的脂肽疫苗不仅能打破慢性乙肝患者体内 T细胞耐 受，激发特异性 n 及 CTL应答 ，并使受试者血清病 毒 DNA转阴或拷贝数降低。以 PADRE取代 30的 脂肽疫苗 Theradigm—HBV激 发 HBV env耐受小鼠 CTL应答率更高达 93％[m]，且能激发、增强慢性 乙 肝患者体 内特异性 cTLs活性 ，并表现清除病毒作 用，显示多肽疫苗可能成为治疗性疫苗研究的突破 点。目前，吴玉章等研制的 HBc。8～27表位组成 的 MAP(multi—antigen peptide)短肽疫苗已正式批准 上临床试验 ，其确切的治疗作用尚待试验证实。由 于 MHC限制性及毒株间抗原性差异，单表位疫苗的 保护作用和应答人群均十分有限，多表位疫苗 ，尤其 是高度保守 、免疫原性强、人群应答范围广的，含有 多个结构蛋 白或病原体表位的多特异性表位疫苗可 能是具有实用价值的短肽疫 苗研究关键。Ishioka 等Ll1]研究发现 HBV／HIV多表位基 因疫苗能同时激 活各表位特异性 CTL应答，并增强部分表位免疫原 性，显示了多表位疫苗研究的可行性。 2 DNA疫苗 DNA疫苗是 20世纪 90年代出现的新的疫苗形 式 ，是一种含抗原基因的表达质粒 ，诱导细胞免疫应 答为主的免疫应答 ，尤其是 TCL应答 ，在治疗性疫 苗研究 中占重要位置。 2一 作用机制 作用机制尚未完全 明确 ，一般认 为，DNA疫苗在体 内持续表达抗原并反复刺激免疫 活性细胞，是其诱导强烈免疫应答的关键 ，细胞 内、 尤其局部 APCs细胞 内表达的抗原通过 MHC—I类 途径提呈后诱导 Thl应答 ，激发 CTL应答为主的细 胞应答。如 BALB／c小 鼠肌注接种 pCI／S后激发以 IgG2a型抗体为主的体液应答(IgG1／IgG2a<0．3)和 CTL应答 ，呈 Thl型应答 ，抗体滴度高，维持时间长， 免疫后 4周即达 100～200 mIU／ml，16周后达 10 000 mIU／ml-l 。此外 ，DNA疫苗构建简单、制备方便 ，且 可采用多种方式接种，如肌注、口服和粘膜免疫等， 并均能诱导 Thl极化。如口服接种 pRc／CMV—HBs 也能打破 HBsAg转基 因小鼠耐受状态 ，激发 Thl型 应答 ，诱导高活性 CTLs和高滴度 IgG2抗体，降低肝 组织 HBsAg—mRNA及 HBsAg水平 ，表现出抑制肝 细胞内病毒复制和清除病毒 cccDNA作用[13,14]，因 此 ，DNA疫苗是治疗性疫苗研究重点之一。 2．2 影响因素 研究发现 ，DNA疫苗免疫效果受 多种因素影响，其中，表达抗原的性质、表达方式和 表达水平均影响应答强度及类型。如表达颗粒性抗 原的 pHBc能激发高滴度 [gG2b、IgG2a型抗体和强 烈细胞免疫 ，而表达可溶性抗原的 pC—HBe免疫不 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 2期 刘朝霞 治疗性乙肝疫苗研究进展 ·197 · 仅激发 IgG1抗体为主，且滴度低 ；而非分泌型表达 L 抗原的 HBV基因疫苗 比分泌型表达疫苗更有利于 激发 CTL应答【15 ；另外 ，疫苗表达水平也是影响基 因疫苗免疫效果的重要 因素 ，高表达疫苗 (如 HBV． pA)不仅诱导的抗体滴度和阳性率高，且呈 1’h1型应 答，而低表达疫苗(如 GBHpA)恰恰相反 。Megede Jz等n J通过同意突变优化抗原基因，提高了疫苗表 达水平，结果激发 了更强烈体液 和细胞免疫应答。 可见 ，DNA疫苗经优化后完全可以达到治疗疫苗要 求 ，激发高水平 CTL应答为主的免疫应答。 2．3 突破点 由于可方便的进行基 因改造，DNA 疫苗也是研究多特异性疫苗的有效手段。由于 HBc 能增强慢性乙肝患者体 内 Thl细胞因子分泌，其特 异性 CTLs在抑制和清除病毒中起重要作用 ，因此， HBc是乙肝治疗性疫苗重要组成部分。env和 core 双特异性乙肝治疗性疫苗研究已广泛受到重视，pSC 和 pSS1S2C均能诱导 BALB／c小 鼠多特异性细胞免 疫应答，尤其 CTLs应答【18,19 J。但 多个结构基 因串 联往往影响基因表达效率和产物构象 ，削弱免疫效 果，而多表位基因疫苗则 由于基因操作方便 、应答类 型可控等固有优点而在多特异性疫苗研究中具有独 特优势。Ishioka等 构建 了 HBV／HIV多表位串连 基因疫苗 ，并激活 HLA—A2转基因小 鼠体内各表位 特异性 CTLs，且 明显增强部分表位免疫原性，显示 了多表位基 因疫苗在治疗性疫苗研究 中的应用潜 力。在对锚着基序、侧翼序列研究更加深人 ，对表位 优化、间隔串联等取得更多经验基础上 ，多表位基因 疫苗的控制表位提呈效率和调控应答类型方面的作 用会 日益凸现 ，使多特异性、多表位疫苗可能成为乙 肝治疗性疫苗研究突破点。 3 免疫佐剂 细胞因子、共刺激分 子及免 疫刺激 DNA序列 (CpG motif)等具有激活、调节免疫局部 APCs作用， 能调控应答类型和强度 ，具有明显佐剂作用，是新型 疫苗研究的重要组成部分。 3．1 细胞因子 重组细胞 因子或其表达质粒为佐 剂在免疫局部形成有利于 APCs活化微环境，促进 其按预定、可控方式提呈抗原，调节免疫应答强度和 类型。如 GM—CSF、IL一2、IL一12及其表达质粒均 可用作佐剂。GM—CSF能促进 APCs表达 MHC—II 类抗原和 ，增强 APCs与 T细胞相互作用和 Thl 型细胞因子分泌 ，与 HBV疫苗共用可激发免疫功能 低下 的血 透患者 产生特 异性抗体 ，且滴 度达 500 mlU／ml，阳性率高达 83％(5／6) J，同时，GM—CSF 一 抗原串连基因免疫也能增强 CD4 T细胞增殖，表 明 GM—CSF佐剂具有全面增强体液和细胞免疫应 答作用。由于 Thl型细胞 因子作为佐剂可诱导 Thl 极化 ，尤其 IL一2、IL一12、IFN一 、TNF—a更能激活 并增强 CTLs活性，增强抗病毒免疫应答。IL一2可 激活 T、B细胞、巨噬细胞和 NK细胞等多种免疫细 胞，广泛增强体液和细胞免疫应答 ，ps分别与 IL一 2、GM—CSF、IL一12、IFN一 表达质粒共同免疫后 ， 特异性 T细胞免疫应答和抗 HBs抗体滴度均提高 2 — 3倍，且 IL一12、IFN一 表达质粒主要增强 IgG2a 抗体和 1’h1型细胞因子分泌【 ，IL一12和 TNFR信 号甚至可刺激 CD4剔除小 鼠起始 T细胞活化【23 J。 3．2 共刺激分子 T细胞活化除了需要细胞因子 提供辅助信号外 ，还需要共刺激分子提供协调刺激 信号，其 中，B7一CD28信号是 T细胞起始活化的关 键因素。CD40L能上调 APCsB7分子表达，使 CD40／ CD40L成为活化 APCs、起始 CTL应答的重要信号， 抗 CD40与 DNA疫苗共免疫可激发 CD4 T细胞缺 陷小 鼠 CTL应答。但 抑制 实 验 表 明，抗体 封 闭 CD80、CD86与 CD28相互作用后，即可阻断 T细胞 起始活化 ，表 明 B7一CD28信号才是 T细胞起始活 化的关键 ，以 B7表达质粒为佐剂 ，提高 APCs B7表 达水平能直接启动 T细胞活化[22,23]。 3．3 CpG基序 广泛存在于细菌 DNA中的以非甲 基化 c、G为基元 的寡核苷酸(CpG OND)，可激活多 种免疫效应细胞 ，如激活天然免疫系统的单核细胞、 NK细胞等，促进 B细胞增殖和 Ig分泌，诱导 1’h1型 细胞因子(IFN一 、TNF—a、IL一12等)分泌，故又名 免疫刺激序列(ISS)。CpG不仅激活天然免疫，且其 刺激释放 的 IL一12、TNF—a、IFN一 等 Thl型细胞 因子创造 APCs活化微环境 ，增强了 APCs MHC—I 途径提呈抗原能力，诱导 Th0或 Th2向 Thl极化，激 发细胞免疫为主的应答 ，在预接种或与抗原合用时 选择性诱导以 Thl为主的免疫应答 ，且常不依赖 IL 一 12途径，表现 出抗感染、抗过敏及肿瘤免疫 中的 潜在应用前景，是 目前 Thl激活佐剂研究的新热点 之一。局部预先注射 CpG后 ，接种低剂量 pCI／S即 维普资讯 http://www.cqvip.com · 198 · 第一军医大学分校学报 2004年 12月第27卷 可诱导小鼠 l型应答，而单用低剂量 pCI／S免疫 则只能诱导 Th2应答；且 CpG与 HBsAg共免疫还能 激发幼龄 BALB／c小 鼠 Thl型 应答 (CTL应答 及 IgG2a>IgG1)[24 J和诱导 CD4 T细胞缺失 BALB／c小 鼠 CTL应答，克服外源性抗原诱 导 CTL应答时 的 CD4 T细胞依赖性【25 J，作为佐剂已在动物实验 中取 得了满意效果。 4 结语 慢性 HBV感染者或携带者具有发生肝细胞癌 (HCC)的潜在危险，目前尚无有效药物治疗。治疗 性疫苗具有费用低、安全 、疗效好的特点，是一种很 有前途的慢性乙肝治疗手段，使乙肝治疗性疫苗研 究成为当前 乙肝疫苗研究热点。DNA疫苗能诱导 强烈的细胞和体液免疫应答，可打破特异性 CTL耐 受，但其安全性和化问题 尚待深入研究。多表 位基因疫苗或多表位短肽疫苗为多价疫苗研究提供 了新的途径，并以独特优点成为疫苗研究新的热点， 可能是乙肝治疗性疫苗研究新的突破点 ，但在表位 选择、疫苗等诸多领域尚处于探索阶段 ，无成熟 的理论支撑，且需克服表位疫苗固有的免疫原性弱 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或浸湿时，应随时立即更换。痰管盒每天更换 ，更换 后的痰管盒清洗后高温消毒备用。 2．5．3 负压吸引装置的消毒 (1)压力表不与病人 直接接触 ，一般只在病人出院时进行 1次终末消毒， 用 75％乙醇擦试即可。(2)负压吸引管 ，每天早晨 用 75％酒精擦拭 ，每周更换吸引管。(3)负压吸引 瓶 ，每天早晨倒净瓶 内吸引物，清水冲洗干净后，倒 人 0．3％的碘伏 100 rrd，防止痰液粘附于瓶底。每周 更换吸引瓶 ，更换后的吸引瓶用 1：1．5氯消净浸泡 消毒 40 min(按氯消净使用说明)后滤干待用。 2．6 环境护理 2．6．1 病房空气应流通，每 日开窗通风 3次，每次 (本文编辑：周侠君) 30～60 min，使室温保持在 18～22 cI=，每 日紫外线消 毒 1～2次 ，每次 40～60 min。 2．6．2 空气湿度稳定 ，相对湿度保持在 50％ ～70％ 为宜。减少空调开放 ，空调开放时可于房间摆一盆 水，保持空气湿度。 2．6．3 严格病房#管理#，减少探视，减少不必要 人员进人病房 ，每次探视人员不能超过 2人 ，时间少 于 30 rnjn。 【参考文献】 [1]刘则杨，侯军华．气管切开护理与康复手册[M]．北京： 人民军医出版社 ，2001．70． [2]金锦华 ．气管套管外口纱布覆盖法的改进[J]．中国实用 护理杂志，2004，20(5)：37． [3]劳永聪，杨 丽等 ．三 种气管套管消毒方法的效果观察 [J]．广西医学 ，2003，25(2)：238～239． [4]高晓篇 ．84消毒液在气管套管消毒中的应用[J]．中原 医 刊 ，1997，24(9)：29—30． [5]吴 玺 ．过氧化氢溶液消毒气管内套管的临床应用[J]． 齐齐哈尔医学报 ，2003，24(3)：327． [6]胡细春，赵玉玲 ，蔡碧华 ．戊二醛对 胃镜消毒效果的观察 [J]．实用护理杂志 ，2000，(11)：3O． (本文编辑 ：何尚宽) 维普资讯 http://www.cqvip.com