总大肠菌群数量测定

总大肠菌群 在饮用水的微生物安全监测中，普遍采用正常的肠道细菌作为粪便污染指标，而不是直接测定肠道致病菌。 总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革氏阴性无芽胞杆菌。总大肠菌群系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。 总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。 一 多管发酵法 1 应用范围 1.1 本法适用于饮用水、水源水，特别是浑浊度含量高的水质中总大肠菌群的测定。 1.2 水样中总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在。 2 原理 根据总大肠菌群应具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在37℃24h内能发酵乳糖并产酸产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。 3 仪器 3.1 显微镜 3.2 革兰氏染色用有关器材。 3.3 高压蒸汽灭菌器。 3.4 干热灭菌箱。 3.5 恒温箱。 3.6 冰箱。 3.7 放大镜。 3.8 试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中160℃灭菌2h 4 培养基 4.1乳糖蛋白胨培养液 4.1.1 成分 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 乳糖 5g 氯化钠 5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 蒸馏水 1000ml 4.1.2 制法 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热溶解，调整pH为7.2~7.4，再加入1ml 1.6% 溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置高压蒸汽灭菌器中，以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4.2 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。 4.3 品红亚硫酸钠培养基（供多管发酵法用） 4.3.1 成分 蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 3.5g 琼脂 15~30g 蒸馏水 1000ml 无水亚硫酸钠 5g左右 5%碱性品红乙醇溶液 20ml 4.3.2 储备培养基的制备 先将琼脂加至900蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整PH值为7.2~7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌中以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4.3.3 平皿培养基的配制 将上法制备的储备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10min以灭菌。 用灭菌吸管吸取已灭菌的严硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色褪成淡粉红色为止。将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入于已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。 4.4 伊红美蓝培养基 4.4.1 成分 蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 2g 琼脂 20~30g 蒸馏水 1000ml 2%伊红水溶液 20ml 0.5 %美蓝水溶液 13ml 4.4.2 储备培养基的制备 先将琼脂加至900ml蒸馏水，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整PH为7.2~7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器内以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4.4.3 平皿培养基的制备 将上法制备的储备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液及一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液，加入已融化的储备琼脂内，并充分混匀（防止产生气泡）立即将此种培养基适量倾入于已灭菌和空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。 5 步骤 5.1 生活饮用水 5.1.1 初发酵试验：在2个各装有已灭菌50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（4.2）的大试管或烧瓶中（内有倒管）内，以无菌操作各加入水样100ml；在10支装有已灭菌5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作各加入水样10ml，混匀后置于37℃恒温箱内培养24h。 5.1.2 平板分离：经培养24h后，将产酸产气及只产酸的发酵管，分别接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上，再置于37℃恒温箱内培养18~24h，挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏试验、镜检。 品红亚硫酸钠培养基上的菌落： 紫红色，具有金属光泽的菌落。 深红色，不带或略带金属光泽的菌落。 淡红色，中心色较深的菌落。 伊红美蓝培养基上的菌落： 深紫黑色，具有金属光泽的菌落。 紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落。 淡紫红色，中心色较深的菌落。 5.1.3 复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽胞杆菌，则挑取该菌落的另一部分再接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养液中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管的最典型的菌落1~3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有总大肠菌群存在。 5.1.4 根据证实有总大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查表1，每升水样中的总大肠菌群数。 表1 总大肠菌群数检数表 （接种水样总量300ml—100ml 2份，10ml 10份） 100ml水量的阳性 管（瓶）数 10ml水量的阳性管数 0 1 2 每升水样中 总大肠菌群数 每升水样中 总大肠菌群数 每升水样中 总大肠菌群数 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ＜3 3 7 11 14 18 22 27 31 36 40 4 8 13 18 24 30 36 43 51 60 69 11 18 27 38 52 70 92 120 161 230 ＞230 5.2 水源水 5.2.1 将水样作1：10稀释。 5.2.2 于各装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（4.2）的5个试管中（内有倒管），各加入10ml水样；于各装有10ml乳糖蛋白胨培养液（4.1）的5个试管中（内有倒管），各加入1ml水样，于各装有10ml乳糖蛋白胨培养液（4.1）的5个试管中（内有倒管），各加入1ml1：10稀释水样。共计15管，三个稀释度。以后的检验步骤同上述生活饮用水的检验方法。 5.2.3 根据证实有总大肠菌群存在的阳性管数查表2报告每升水样中的总大肠菌群数。 表2 总大肠菌群检数表 （接种水样总量55.5ml ，其中5份10ml水样，5份1ml水样，5份0.1ml水样）