抗原抗体反应及应用

1 抗原抗体反应及应用 不论天然的还是人工合成的分子，只要能被机体的免疫系统识别的都可以诱导机体的免疫 应答，产生相应的抗体。大多数抗体和抗原本身是既有免疫原性(诱发产生特异抗体)，又有 反应原性(与特异的抗体相结合)。抗原与抗体的特异性反应不仅可以在体内进行，而且可以 在体外进行。一切利用血清学技术方法所进行的各种测试都是基于这一根本的特性。抗体反 应技术的应用之广泛已经远远超出了免疫学、医学、甚至生命科学的范围，成为—类微量， 灵敏，快速的检测方法。本章着重介绍抗体制备，抗体抗原反应原理及技术方法的应用。 第一节抗体的制备 环境中的大部分生物(包括病原生物)及其产物分子和一些化合物对哺乳动物的免疫 系统而言是外源抗原，这些抗原能通过侵染或其他的途径刺激免疫系统，产生以抗体为主的 体液免疫应答。同样用抗原人工免疫实验动物，可以获得含有特异性抗体的血清，称为抗血 清(antiserum)，因血清中抗体是多个抗原决定簇刺激不同 B 细胞克隆而产生的抗体，所以称 多克隆抗体(polyclonal antibody)。一个 B细胞克隆所分泌的抗体即为单克隆抗体。用免疫动 物的 B细胞与骨髓瘤细胞融合，在体外可以分离出许多单个 B细胞克隆，以此方法可制备单 克隆抗体(monoclonal antibody)。随着分子生物学技术的发展，已经可以用抗体基因文库 (antibody combinatorial library)筛选制备单克隆抗体。应用基因工程技术，根据需要对抗体进 行改造，获得基因工程抗体(engineering antibody)，以及催化性抗体(catalytic antibody 或 abozyme)等的全新的抗体。 一、抗血清的制备 1．免疫动物 (1)抗原：免疫动物是制备抗血清的第—步。免疫所用的抗原可用病毒、细菌或者其他 蛋白质抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必须与大分子载体连接，连接剂见表 7—1。 抗原的用量视抗原种类及动物而异，—次注射小鼠可以少至几个微克，免、羊甚至更大的动 物每次注射的量就相应增加，从几百 μg／次至几 mg／次。 〔2)佐剂及乳化：佐剂可以帮助抗原在注射部位缓慢释放，以增加免疫刺激的效果。佐剂 有完全和不完全佐剂之分。完全佐剂加有灭活的分枝杆菌(如卡介苗)或棒状杆菌。福氏佐剂 可从试剂公司购买，也可用羊毛脂和石蜡油按 1：2—4混合自行制备。佐剂与抗原按 1：1的 比例混合乳化为均匀的乳液，放置后不会发生油水分离。 (3)免疫动物：常用于制备抗血清的动物打豚鼠、家免、小鼠、大鼠等，如果大量生 产可用动物羊、马等，动物接受免疫的乳液量小鼠为 1．0—2．0 mL，家兔为 2—4mL。抗原 免疫动物的途径取决于动物种类、抗原特性和是否使用佐剂。腹腔注射(i．p)，肌肉注射(i．m)， 2 皮内注射(i．d．)和皮下注射(s．c．)适合于任何抗原，这些途径主要刺激局部淋巴结发生免 疫应答，初次免疫和免疫加强注射均可使用。静脉注射(i.v.)则只适合于可溶性抗原及分散的 单细胞悬液，且不能使用佐剂，其诱发的免疫应答主要发生在脾脏。此外，在单克隆抗体制 备时，亦可用脾脏直接注射或体外免疫方法，尤其对微量抗原比较实用。体外免疫方法也常 用于人源单克隆抗体的制备。体外免疫时将脾细胞或外周血淋巴细胞(包括 B细胞，T细胞及 抗原递呈细胞)与抗原一起作体外培养，然后再与骨髓瘤细胞融合。初次免疫后要经过 2—3 次以上的免疫加强以保证能形成较高水平的 IgC 抗体。两次免疫注射之间的时间间隔，一般 3—4周比较适合大部分动物，小动物可间隔 10—14d，大动物则在 2月左右。在免疫加强最 后一次注射后的一周内采集抗血清，可获得高水平的抗体。 2抗血清的纯化与保存 （1）采血：加强免疫的动物 2—3次后，可通过耳静脉或眼球(小鼠)采血，进行抗血 清效价测定。当效价达到理想的高度后，可以采血。采血方式可以从心脏直接取血，也可通 过动脉放血。待血液凝固后用针筒或吸管吸取血清。 (2)抗血清的纯化与保存：除抗体外血清中含有多种其他蛋白成分。为了避免这些蛋 白质干扰抗体(免疫球蛋白)标记反应和抗原抗体反应，抗血清可经过纯化以获得单一的机体 (常为 IgG)组分。常用的纯化 IgG的方法为饱和硫酸胺盐析和层析法。蛋白质在不同的盐浓度 的溶液中，其溶解度不一样，盐离子干扰蛋白质和水分子间氢键形成，因为水—盐结合比水 —蛋白质结合更稳定，蛋白质即可从溶液中沉淀出来。蛋白质分子越大，沉淀时所需盐离子 浓度越低。免疫球蛋白(Mr 1.5×105)比血清中主要蛋白质白蛋白(M r 6.7×104)的分子大得多， 抗体在 30％—50％饱和度的硫酸盐中析出，而白蛋白需在 70％—80％饱和度才析出，因此常 用 33％饱和度的硫酸胺纯化血清中的 IgG。盐析时为了减少抗体变性，需在 4℃进行，同时 用 pH8.0 缓冲液稀释抗血清，以减少蛋白浓度过高而发生共沉淀。铵盐的溶解度不随温度变 化而明显改变，0℃和 25℃仅差 3％，而钠盐则相差 5倍，因此常在低温沉淀时用铵盐，室温 沉淀用钠盐。铵盐对抗体的标记反应(如 FITC和 biotin标记时)有一定的干扰作用。 盐析法只能部分纯化抗体，更高纯度的抗体制剂可用层析法制备。 IgM 五聚体相对 分子质量达 9.7×105，比血清中任何其他蛋白都大，用分子筛层析很容易将其纯化。IgG在 PH 8．0时带负电荷，能与 DEAE纤维素上的阳离子结合，因此可用离子交换层析来纯化 IgG。 IgG纯化最常用的方法为亲和层析。IgG与葡萄球菌 A蛋白和链球菌 G蛋白具合高度的亲和 性，可用这两种蛋白质交联亲和层析柱将 IgG纯化。大部分 IgG与蛋白 A结合 PH为 8—9， 洗脱 PH为 2—4；而与蛋白 G的结合 PH为 5—7，洗脱 PH为 9—10。C蛋白更适合于 IgG 的纯化，不但反应条件为温和的弱酸性或弱碱性，并且与 IgG的结合力高于 A蛋白。G蛋自 能与大部分动物种类的 IgG 结合，而 A蛋白对小鼠 IgG1、大鼠 IgG2b、人 IgG3、马和绵羊 IgG结合力弱或不能结合 G蛋白和 A蛋白均不能与鸡 IgG结合。 抗血清或纯化的抗体在低温保存可维持活性数年，反复冻融使抗体很快失活，被细菌 或霉菌污染的抗血清或 IgG制品也易失去活性。稀释的抗血清加入防腐剂叠氮化钠和保护剂 如 BSA 等可于 4℃保存。长期保存常用等量甘油于—20℃以下冷藏。也可置于 50％饱和硫 酸铵中 4℃保存，还可以冷冻干燥保存。 3抗血清的特性鉴定 根据不同目的制备的抗血清，对其中所含抗体的浓度，特异性及免疫球蛋白种类的要 求也不一样。为了获得质量和数量上合符要求的抗血清，在收集动物血清前必须对免疫效果 进行检测，对收获后的抗血清也必须对—些参数进行分析，如效价、亲和力及交叉反应等。 根 据不同的抗原性质选用合适的检测方法。最常用的为免疫沉淀，ELISA，放射免疫等。 效价又称滴度(titer)，是常用于表达抗血清中特异性抗体相对含量的—个半定量指标， 即在给定的条件下，结合—定量抗原的抗血清的稀释度。抗血清经一系列稀释后(如倍比稀释) 与定量的抗原反应，以能检测抗血清最大稀释倍数即为该抗血清的效价。不同的检测方法测 定同一种抗血清的效价，灵敏度不一样，抗血清的效价也不一样，如沉淀反应(琼脂双扩散) 生物秀-专心做生物 www.bbioo.com 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 bbs.bbioo.com 生 物 秀 -专 心 做 生 物 w w w .b bi oo .c om 3 与 ELISA 二者的效价相差甚大，后者远高于前者。放射免疫分析(RIA)常用于标记小分子抗 原来检测抗血清的效价。 亲和力(affinity)表示抗血清与相应抗原的结合强度，是描述抗体持异性的重要指标， 常用亲和常数 K表示。亲和常数 K与抗原抗体反应的平衡常数有关： K+ Ag＋Ab AgAb K－ [AgAb] K+ K= K= [Ag][Ab] K－ 式中 K+为结合速度常数，K－为解离速度常数。亲和常数 K的测定见第二节 抗体特异性与交叉反应：抗体是特异的。只与相应抗原反应。实际制备的抗体却常有 非特异性反应，这是因为抗原不纯造成的。多组分抗原之间存在共同的抗原决定簇，或者两 个抗原决定簇结构类似能与同一抗体结合，均可出现抗体与异源抗原的交叉反应。用琼脂双 扩散能简便直观地反映不同抗原与同一抗血清，或不同抗血清与同一抗原的交叉反应。 二、单克隆抗体的制备 1制备原理 单克隆抗体(MAb)与抗血清(又称多克隆抗体，PAb)最主要的区别是MAb为单一种 B 细胞克隆所产生的一种均一的免疫球蛋白分子。所以 MAb 是 B 细胞克隆的标志，是一种独 特型的抗体，它的特异性是针对一个抗原决定簇的。制备单克隆抗体不能用化学分离的方法 从多克隆抗体中去分离纯化得到它，而是用分离产生抗体的 B细胞克隆的方法得到它。为了 使 B细胞克隆能在体外人工培养下长期存活并产生完全均一的MAb，G．KÖhler合 Milstein 于 1975 年创立了杂交瘤方法。所以制备单克隆抗体的技术又称杂交瘤技术(hybredoma technique)。 杂交瘤技术的基本原理是用分泌抗体但不能长期培养的 B 细胞与能在体外长期培养 并可低温保存的肿瘤细胞进行杂交。筛选得到的杂交瘤细胞应该是既能分泌抗体又有瘤细胞 的特性，可长期传代培养，又可在液氮中保存的细胞。把这些细胞单克隆化，用单克隆化的 杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产（图 7－1）。 生物秀-专心做生物 www.bbioo.com 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 bbs.bbioo.com 生 物 秀 -专 心 做 生 物 w w w .b bi oo .c om 4 2．B细胞与瘤细胞的来源及杂交瘤选择原理 最常用的单克隆抗体是小鼠的单抗，此外也有大鼠的和人源的单抗。人源单抗制备比 较复杂。小鼠单抗的制备通常是使用 Balb／c小鼠的 B细胞和它的骨髓瘤细胞。大鼠的单抗 制备通常用 Lou／c大鼠及其骨髓瘤和 Y3／AO大鼠及其骨髓瘤细胞(表 7—2)。B细胞是从免 疫动物的脾脏中分离出来的。动物免疫方法与抗血清制备相同，只是在制备脾脏前 3d必须进 行一次静脉加强注射以保证得到的 B细胞有旺盛的分泌抗体的活性。骨髓瘤细胞有许多细胞 株是经过诱变和筛选得到的缺陷型。筛选的标准是①瘤细胞本身不产生抗体或者产生抗体的 某种链，但不能分泌；②是次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)的缺 陷型。因为这种缺陷型的瘤细胞正常的核酸合成途径被氨基喋吟(aminopterin)阻断后，由于缺 失这些酶，即使补充它的底物次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)，核酸合成的旁路也不能起到救援 的作用，结果导致瘤细胞死亡(图 7—2)。而杂交瘤细胞因带有 B细胞的全套基因，在 HAT存 在的条件下借助于 HGPRT和 TK的作用通过替代的核酸合成途径能正常合成 DNA和 RNA。 所以杂交瘤能正常地生长繁殖而被选择出来。未被融合的游离的 B 细胞只能存活 3d 而后自 行死亡。这就是用 HAT培养基进行选择的原理。 生物秀-专心做生物 www.bbioo.com 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 bbs.bbioo.com 生 物 秀 -专 心 做 生 物 w w w .b bi oo .c om 5 3．细胞杂交与选择培养 (1)融合：细胞杂交之前，要分别准备好脾脏的 B细胞悬液和小鼠骨髓瘤细胞(如 SP2 ／0—Agl4细胞株)。免疫后的小鼠脾脏在无菌条件下破碎，将 B细胞悬浮在没有血清的培养 液中(通常使用 RPMIl640商品配制)，并洗涤 3次去掉小鼠的血清。SP2／0细胞是用加有 10 ％胎牛或小牛血清培养的，每天更换新鲜培养液使成为对数分裂期生长旺盛的细胞。细胞用 RPMIl640洗涤 2—3次，把两种细胞合并在同—试管中，用 50％的聚乙二醇(相对分子质量为 1000—1500)作为融合剂，在 37℃条件下融合 l—2min。然后用 1640 培养液缓慢稀释，然后 除去 PEG，将细胞分散至 HAT选择培养板中。电融合方法也可用于单克隆抗体制备，虽融合 率较高，但一次融合的细胞数少，且需专门设备，故限制了其广泛使用。融合时脾细胞和骨 髓瘤细胞的比例在 5：1—10：1均可获得满意结果，每次融合细胞数量在 107—108较为合适。 融合后的细胞在 40 或 96 孔板上的 HAT 培养液(RPMIl640 含 10％—20％胎牛或小牛血清和 HAT)中 37℃，5％CO2条件下培养。融合后的细胞悬液中只有脾细胞和骨髓瘤细胞形成的杂 交瘤细胞能在 HAT培养基中生长，其他形式的融合细胞均不能生长．未融合的细胞也不能在 HAT培养液中生存(表 7—3)。 生物秀-专心做生物 www.bbioo.com 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 bbs.bbioo.com 生 物 秀 -专 心 做 生 物 w w w .b bi oo .c om 6 在融合后的细胞培养过程中，饲养细胞(feeder cell)有助于杂交瘤细胞的生长。饲养细 胞可用同种动物的腹腔细胞或胸腹细胞。腹腔细胞中的吞噬细胞能清除死亡细胞碎片。使背 景更为清洁“干净”。同时饲养细胞分泌的细胞因子或活性物质有助于杂交瘤细胞的生长。现 有商品“杂交瘤细胞生长因子”可用于替代饲养细胞。 (2)阳性杂交瘤细胞的筛选与单克降化：杂交细胞经约 10—14d 培养后，形成可用的 细胞集落(克隆)。经过几次更换培养液(HT 培养液)后进行抗体活性检测。常用的筛选枪测方 法是 ELISA和凝集试验，前者常用于可溶性抗原，后者适用于细胞、细菌等表面抗原。此外， Dot－ELISA、免疫印迹及免疫荧光试验均可用于杂交瘤细胞的筛选。 使许多细胞克隆混合生长的细胞分离为单个的细胞克隆的过程称克隆化(colonization) 最常用的单克隆化方法是有限稀释法(limited dilution)，即将混合细胞经稀释后分装于培养板 上，使培养板的大部分孔中只出现一个细胞。为了确保抗体分泌细胞来源于单个细胞，克隆 化过程可重复进行，称为亚克隆化(subclonization)。除有限稀释法外，荧光激活细胞分拣法 (FACS)也用于杂交瘤细胞的克隆化过程。 4．单克隆抗体的扩大生产 产生特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株应立即扩大培养，以获得足够的细胞用于保存 和生产可供应用的抗体。生产大量单克隆抗体的方法目前常用的有 3 种：小鼠腹水制备，大 瓶培养和中空纤维反应器，前者多用于实验室制备，后二者适应于工厂化生产。 腹水制备：杂交骨髓瘤细胞在腹腔中定植，并产生大量腹水。选用与单克隆抗体制备 所用相同的动物品系或者含有相同基因的 Fl代杂交品系。杂交 F1代品系更适合于腹水制备， 如果用异源动物制备腹水时可选用无 MHC 限制性的裸鼠。用小鼠制备腹水时，先用矿物油 或 Pristane 致敏，以抑制其免疫功能，利于腹水的形成。腹腔注射 106—107个杂交瘤细胞， 经过 7—10 d后形成腹水。每只小鼠可获得 3—5mL腹水，每 mL含 IgG抗体可达 5—10mg。 腹水中含有较多的杂蛋白和非特异性 IgG，并且含有许多蛋白酶，易使抗体失活，因此腹水 收集后应尽快纯化，以防止降解。 大瓶培养：采用 1000mL或更大的摇瓶培养。大瓶培养上清体积大，但抗体浓度低， 给抗体纯化带来很大困难，消耗人力和培养液，增加生产成本。 中空纤维反应器：是比较经济的单克隆抗体生产方法。该装置由具有半透膜性质的成 束的微孔纤维组成，杂交瘤细胞位于纤维外部的小量培养液中，培养液在纤维的微孔中循环， 供给营养和带走废物，抗体大分子和小分子化合物被隔开。高密度的杂交瘤细胞能在此系统 中维持数月，每天可产生数百毫克的抗体，抗体浓度高，体积小易于纯化。 胎(小)牛血清一直是细胞培养所必须的，在单克隆抗体生产过程中培养液中的血清蛋白 使抗体的纯化增加了困难，近年开发的无血清培养技术已逐渐用于单克隆抗体的生产中。 5．人单克隆抗体的制备 小鼠的单克隆抗体蛋白应用于人体后，作为抗原能引起人的免疫应答，大大降低其生 物活性，并可能导致变态反应。因此人源单克隆抗体在临床治疗上有广泛应用前景，引起人 们的普遍兴趣。但是人单克隆抗体制备存在许多技术上和伦理上的障碍，如人杂交瘤细胞系 不稳定，有些抗原不能对人进行人工免疫，人 B细胞只能从外周血中分离而无法从脾脏取得 生物秀-专心做生物 www.bbioo.com 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 bbs.bbioo.com 生 物 秀 -专 心 做 生 物 w w w .b bi oo .c om 7 等。尽管如此，一些人源单克隆抗体已经获得，技术上也在逐步完善起来。 人的瘤细胞株 U—266常用来与人外周血 B细胞融合以获得人源单克隆抗体。另一些 淋巴母细胞抹(LCL)则来源于 EB病毒转化的淋巴细胞，如 GMl500，W1—L2和 ARH77等也 用于杂交瘤细胞的制备。这些细胞系表现 ED病毒核抗原(EBNA)阳性，且形成的杂交瘤细胞 抗体的分泌水平不高。 获得人单克隆抗体的另一方法是用EBV直接转化某些抗体分泌细胞，使之成为“不死” 的细胞在体外培养。EBV感染人 B细胞后，病毒基因插入人 B细胞基因组中，有 1％的细胞 转化为“不死”的细胞。B细胞转化可通过“病毒驱动”和“细胞驱动”两种方法获得。前者是将 B 细胞与分泌 EBV的 B95—8细胞系一同培养，后者则是与 EBNA阳性的 LCL细胞一同培养。 “细胞驱动”转化的 B细胞比较稳定，抗体分泌能力也较强。 人淋巴母细胞系和人杂交瘤细胞较难获得，人单克隆抗体也可以通过异源杂文的办法 制备，即将 EBV 转化的 B 细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，将获得的异源杂交瘤细胞再与免疫 后的 B细胞融合，得到人单克隆抗体分泌细胞，不产生自身免疫球蛋白，EBVA也是阴性。 三、基因工程抗体的制备 1．抗体的化学修饰 抗体 Fc段用双功能连接剂与荧光素，同位素，酶，发光化合物，稀土元素以及药物， 毒素等连接后，并不影响其 Fab 功能区与特异性抗原结合。根据交联物的性质不同，标记的 抗体可用作诊断试剂，也可作为药物的定向载体，引导药物或毒素到达抗原存在部位使药物 或使毒素发挥更有效的作用，即俗称“生物导弹”。从而减少药物、毒素、同位素、酶在肿瘤 治疗过程中引起严重的副作用，大大提高治疗肿瘤的效果。 许多毒素如蓖麻毒素，白喉毒素，天花粉，红豆毒素等均为蛋白质或糖蛋白，可用双 功能剂与抗体相连；吗啡，前列腺素，氨甲喋吟，磷酸酯酶 C等含有羧基能用碳二亚胺(EDC)， 混合酸酐法与抗体的氨基形成酰胺键；同样，含脂肪胺的药物如庆大雷素，阿霉素在水溶性 EDC的作用下与抗体的羧基连接；而含芳香胺的药物则先在低温下与亚硝酸作用形成重氮化 合物，再与抗体分子上的酪氨酸或组氨酸残基形成偶氮键。总之通过抗体的化学修饰把抗体 的特异性用到定向给药和定位检测上。 2．抗体基因文库 抗体基因文库(antibody recombination library)是将不同的重链和轻链基因随机组合，克 隆到合适的表达载体中，在原核细胞表达不同的抗体，形成一个抗体库，从这个抗体库中， 用抗原可以筛选到相应的抗体基因(图 7—3)。抗体基因来源于杂交瘤细胞或动物 B细胞(免疫 或未免疫)的 DNA和 mRNA 。 用质粒作为抗体文库的载体，虽然也可能表达有活性的抗体分子或片段，但由线状噬菌 体表达更为方便有效。M13、fd、F1等噬菌体的外壳蛋白由 5种蛋白组成：pⅢ、pⅥ、pⅦ、 pⅧ和 pⅨ。每种含量不一，其中 pⅧ含量最多，每个噬菌体有 2700个 pⅧ亚基，其余 4种蛋 白仅 5 个拷贝。增加噬菌体外壳蛋白的长度并不影响噬菌体的装配，抗体以融合蛋白的形式 表达于噬菌体表面。噬菌体表达质粒常用的有 fd－CAT1、fd－tet－DOG1、PHEN1、pComb3 和 pComb3H 等。抗体融合蛋白构建多用 pⅢ和 pⅧ，pⅧ拷贝数高，低亲和力的抗体蛋白容 易筛选出来。 在噬菌体表达抗体时，常常不表达完整的抗体分子，（因为 CH2 上不能进行糖基化）。根 据不同的引物得到重链的 VH或 VHCH1区，轻链的 VL或 VLCL区。VL和 VH两个片段用一短 肽作连接片段，形成单链可变区（single－chain fragment variable，scFv）；VHCH1和 VLCL两 片段则形成 Fab片段。另外，单独的 VH和 VL也能结合抗原，如果二者形成同源或异源 生物秀-专心做生物 www.bbioo.com 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 bbs.bbioo.com 生 物 秀 -专 心 做 生 物 w w w .b bi oo .c om 8 二聚体(dAb)，则稳定性和亲和性明显提高(图 7—4)。此外在抗体片段 DNA末端加上一些 功能蛋白(如碱性磷酸酶和蛋白毒素)的基因，则表达的抗体就带有一定生物活性功能片段， 可用于检测或治疗。如果在抗体基因末端加上终止子(TAG)则表达的抗体片段是可溶性的，而 不是结合在噬菌体表面。 用特异性抗原免疫的动物 B 细胞构建抗体的噬菌体文库，抗体亲和性高，用与免疫抗 原不同的抗原筛选得到的抗体亲和性普遍较低。可用模拟天然体细胞突变的方法来提高亲和 力。如混杂重组法，即将己获得的轻链或重链的 V片段切下，再克隆至随机的文库中的 V区 构成二级文库，使 H 链和 L 链混杂，可以使抗体片段的亲和性提高。利用 PCR 错配将随机 突变引人至抗体的抗原结合区，也能提高对抗原的亲和力。先用低亲和力的载体在噬菌体的 PⅧ表达，筛选后、将抗体基因片段 PCR扩增转至 PⅢ上表达，可获得高亲和力的抗体片段。 生物秀-专心做生物 www.bbioo.com 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 bbs.bbioo.com 生 物 秀 -专 心 做 生 物 w w w .b bi oo .c om 9 抗体基因文库有两个优点，一是从不适合进行人工免疫的物种获得单克隆抗体，如人 源单克隆抗体；二是可快速方便获得单克隆抗体。 3．抗体基因的改造 将鼠源抗体的 V 区基因与人源抗体 C 区基因重组，获得的嵌合抗体(chimerical antibody)，可保留鼠抗体对抗原的高亲和性，又减弱鼠源抗体对人的免疫原性，提高治疗性 抗体的效果。 重组的嵌合抗体基因转化骨髓瘤细胞或中国地鼠卵细胞(CH0)，可在其中表达。为了进一 步地消除鼠抗体 V区框架区(FW)的异源性，可实行 CDR移植(CDR grafting)，以获得与鼠 FW 类似的人 FW结构的嵌合抗体。 噬菌体表达的抗体仅含 V 区(scFv)或 Fab 片段，缺乏 Fc 区，使抗体的稳定性下降， 半衰期缩短，与 Fc 受体结合功能也消失。因此在抗体功能片段的末端连接 A 蛋白、酶、细 胞因子、CD4和毒素等分子，既可增加抗体片段的稳定性，又可发挥某些生物学活性功能。 用抗体基因工程方法获得的抗体与效应分子交联物比用化学交联法具有优点：可以大 量生产，不会因修饰作用影响抗体及效应分子的活性，效应分子还可根据需要进行改造。 此外在抗体片段的末端连接一段特异的双亲性螺旋(amphiphilic helixes)结构，如亮氨 酸拉链结构(leucine zipper)，可使单价的 scFv或 Fab片段在体内或体外形成稳定的双分子聚 合体，从而提高抗体片段的亲和力。此法也可用于制备双特异性抗体。 4．基因工程抗体在真核细胞中的表达 噬菌体表达的抗体片段常常是在原核细胞(E.coli)中完成。原核系统表达抗体片段产量 高，成本低，快速易于操作。但抗体片段在原核表达系统中不能进行 CH2糖基化，从而影响 生物秀-专心做生物 www.bbioo.com 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 bbs.bbioo.com 生 物 秀 -专 心 做 生 物 w w w .b bi oo .c om 10 抗体的活性。因此重组抗体基因片段可转移至适合的骨髓瘤细胞系或哺乳动物细胞系(如 CHO)，甚至于植物细胞中表达，可以得到与淋巴细胞表达相同的抗体分子。免疫球蛋白 IgA 的重链和轻链及分泌片基因可以分别转化不同的植株，将表达这些蛋白的植株进行有性杂交， 在杂交后代中可以装配成完整的 IgA双分子。以植物作为生物反应器进行抗体的表达已有许 多成功的研究报道，与动物细胞相比更为经济，具有广泛的应用前景。 四、催化性抗体的制备 1．抗体催化的原理 1986年，由 P．G．schultz和 R．A．Lerner 分别领导的两个小组同时证明抗体具有 催化活性。针对一个四面体带电荷的磷酸酯半抗原产生的抗体，能有选择性地催化相应的碳 酸脂和羧酸脂的水解反应。他们将这种有催化活性的抗体称为催化性抗体(catalytic antibody)， 又称抗体酶(abozyme)。催化抗体的作用取决于底物分子水解时的转换态(transition state)(图 7—5)。转换态的分子结构是分子活化后的一种结构状态，处于转换态的分子具有最高的活化 能，分子表现极性。处于这种状态的分子也是最不稳定的，能与这种分子结合的酶或者抗体 会使某些化学键发生断裂(如酯键，碳键，胺键等)起到酶解作用。可见抗体酶的作用与天然 的蛋白质酶非常相似。抗体酶也表现出对底物的专一性，对立体结构的专一性。在饱和动力 学与竞争性抑制方面都与常规酶相似。所以抗体酶的发现打破了只有常规酶才有的分子识别 和加速催化反应的传统概念，为酶工程学开创了新的领域。 2．抗体催化的化学反应 由抗体催化的化学反应特异性高于酶，但催化速率低于常规的酶，只有 l03—106倍。 但有一些未发现催化剂的反应，如 Diels—Alder 反应也能被抗体催化。常规酶一般不能催化 胺键水解，抗体酶能使胺键水解的速度增加 25万倍。讫今为止，已发现和证明的由抗体催化 的化学反应不下 40种。 3．催化性抗体的制备 抗体酶是抗原决定簇处于转换态结构的抗体。因为转换态分子极不稳定无法制备抗 体，所以催化性抗体的获得主要是通过稳定的转换态的类似物作为半抗原，与载体蛋白 交联后，免疫动物，获得针对半抗原的抗体，从中筛选具有催化活性的抗体。筛选催化性单 克隆抗体所用的 ELISA与筛选一般抗体的方法不完全一样，应根据催化反应的特点而进行适 当的修改。经典的方法是先筛选出与底物或半抗原结合的抗体，然后从中再筛选出有催化活 生物秀-专心做生物 www.bbioo.com 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 bbs.bbioo.com 生 物 秀 -专 心 做 生 物 w w w .b bi oo .c om 11 力的抗体，这种方法费时费力。利用催化性抗体对底物的催化活性，对底物进行适当修饰， 使催化反应的产物可直接表现抗体的催化活性，这样可以简化检测步骤。 转换态类似物半抗原的设计，必须了解催化反应的转换态模型的结构特点。催化抗体 的抗原结合位点上与转换态互补的某些催化基团的形成，能稳定转换态分子。此外有人把单 克隆抗体分子用化学修饰方法引入一些活性基团，提高催化性抗体的催化与亲和效率。应用 噬菌体抗体文库也可以筛选催化性抗体，可省去制备转换态类似物的复杂过程，直接用底物 从文库中筛选有催化活性的抗体片段。如用半抗原免疫后制备的文库或文库经过多次混杂重 组，则可以得到更高的亲和力的催化性抗体。抗独特型抗体也用于催化性抗体的制备，用酶 作为抗原免疫小鼠获得能够封闭酶活性位点的单克隆抗体，将这个抗体用蛋白酶除去 Fc 片 段，用 Fab免疫其他品系的小鼠或家兔，得到的抗体具有相应的酶催化活性。 从理论上看，B细胞具有全套免疫球蛋白的多样性的胚系基因，当然也包括有催化作 用的自身抗体在内。然而 1989年 Paul W.首次报道了人体的一种能催化蛋白质水解的免疫球 蛋白。它是—种自身抗体，能水解血管活性肠肽 (vasoactive intenstinal peptide，VIP)的 Glnl6—Met17键。用 VIP作为抗原能得到有催化作用的单克隆抗体，也能催化 Glnl6—Met17 键。大约有 17％的人有这种自身抗体酶，但患有气喘的病人中该抗体与 VIP的亲和力比健康 人高 50 倍。由于 VIP 是一种气管松弛剂，因此有人认为这种 VIP 自身抗体的长期作用可能 与气喘的过敏应答有一定关系。由此推测除了人工设计催化抗体以及发现的自身催化抗体外， 用筛选单抗的方法，也有可能找到所需要的催化抗体。 第二节 抗原抗体反应原理 抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种结合在体外也能发生，这种特性 就是许多免疫检测方法的基础。抗原与抗体相互作用是非共价的，可逆的，其特性符合许多 化学反应的基本原理。但因为抗体分子的结构特点，以及抗原分子结构的多样性，使抗原抗 体结合反应表现出复杂性。 一、抗原抗体作用的热力学与动力学 1．溶液中抗原抗体的化学平衡 抗体与抗原的结合是非共价结合，二者在结构互补适应的基础上通过范德华力(van der Waals force)、静电引力、氢键和疏水作用等次级键相互作用。因为结合是可逆的，结合与 解离的强度在—定条件下取决于抗原与抗体的亲和力。如果以 S 代表抗体结合位，即互补位 (paratope)；以 L 代表抗原决定簇；以 SL 代表抗原与抗体的复合物，则抗原(Ag)与抗体(Ab) 在溶液中的反应如下： K+ K+ Ag＋Ab AgAb 即 S＋L SL K－ K－ Kα＝[SL]/[S][L]＝K+/ K－ 抗原抗体结合形成的复合物的浓度为[SL]，游离的抗体结合位的浓度为[S]，抗原决定簇的 浓度为[L]。在反应早期复合物形成很快，一定时间后逐渐慢下来，直至复合物的形成与解离 达到平衡(图 7—6)。此时抗原抗体复合物的浓度[SL]与游离抗原表位的浓度[S]和游离抗体结 合位的浓度[L]之比 Kα是平衡常数，又称为内在结合常数，或称内在亲和力(intrinsic affinity)。 K+和 K－分别为结合和解离反应速度常数。 在恒定的条件下，如温度、pH、离子强度等一定时，Kα是一个常数。改变抗原或抗 12 体的浓度，复合物的浓度也相应改变以达到新的平衡，在一定范围内如果[S]与[L]增加 2倍， 则[SL]应该增加 4倍，但实际上会少于 4倍，因为 Ag—Ab复合物的浓度[SL]是抗原抗体的一 部分。如果上述浓度都以摩尔浓度 mol／L 表示，则是 Kα的单位为浓度的倒数(L／mol)。如 抗体的 Kα在 107—1012 L／mol为高亲和力抗体，Kα低于 107 L／mol为低亲和力抗体。 如果以解离常数(Kα)描述抗体的亲和力，比Kα更简单方便，Kd为Kα的倒数，即Kd＝1/Kα， 单位为 mol/L。Kd值越大亲和力越小，Kd越小亲和力越大。 2．抗原抗体反应的自由能变化 抗原抗体反应的自由能改变与 Kα相关：ΔF0＝—RTln Kα，Kα＝e－ΔF /RTˊ ，这里 R＝摩尔气 体常数[8.31J／(mol·K)]；T＝绝对温度；ln＝自然对数；e＝自然对数的底数；ΔF0＝标准的自 由能变化，规定 ΔF0＝1molS与 1mol L形成 1mol S—L时自由能的变化。负号表示自由能为 负的变化。 从上式可以估计：当抗原抗体结合亲和力增加 l0倍，则 1n10＝2．303，37 (3l0℃ ．15K) 时的 ΔF0＝5.94KJ／mol，温度低于 37℃时 ΔF0更小。这种自由能变化还不足单个氢键的能量 (约 18．81KJ／mol的 1／3。即使亲和力非常高，Kα＝1010L／mol，ΔF0只有 5．94KJ／mol， 仅相当于 3 个氢键的结合能。当抗原与抗体间形成氢键时，水的氢键被破坏，因此每个氢键 的净能接近于 4.18KJ／mol。由此可见抗体与抗原结合时，吸力与斥力几乎相等，即使在很 高亲和力下，也只有几个千卡的微小差别。因而 ΔF 的轻微增加会导致抗原抗体结合的亲和 力增高，这就不难理解当抗原结构发生某些微小改变(如化学修饰)时，会引起抗原抗体的亲 和力的很大变化。 自由能对 Kα的影响取决于温度，然而自由能本身也受温度的影响： ΔF 0＝ΔH 0－TΔS 0 ΔH 0 为焓变，ΔS 0为熵变，T为绝对温度。Kα随温度的变化如下: dlnKα /dT=ΔH 0 / RT2 或 dlnKα/d(1/T)= ΔH 0 /R 当氢键和极性键形成时，较大的负焓变驱动放热，亲和力会随温度的增加而下降。因此 抗原抗体相互作用在 4℃比在 25℃或 37℃有更高的亲和力，可见在给定的浓度下，最大眼度 的结合在较低温度下达到的。相反，非极性或者疏水的相互作用受到熵的影响，TΔS 0和 ΔH 0接近于零，所以这时温度对亲和力影响较小。 3.抗原抗体反应的动力学 抗原抗体反应达到平衡时的参数测定在实际操作时是困堆的。反应完成 90％，只需几分 生物秀-专心做生物 www.bbioo.com 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 bbs.bbioo.com 生 物 秀 -专 心 做 生 物 w w w .b bi oo .c om 13 钟或几小时，而从 90％至 99％则需几倍的时间，而欲达到 99．9％完成时所费时则更长，因 为此时的[Ag]和[Ab]已减少到极低的水平。测定一些参数在反应的早期或者未到平衡时是可 行的，利用动力学可以计算出抗原抗体反应的特征性参数，用以描述抗原抗体反应的规律： K+ Ag（S）＋Ab(L) AgAb （SL） K－ 结合反应速度＝K＋·[S]·[L]·M-1·S-1 解离反应速度=K-·[SL]·S-1 达到平衡时，则 K+·[S]·[L]＝K-·[SL] Kα＝K+／K- Kα＝K+／K-表明相同亲和力的抗体，其结合速度常数和解高速率常数并不一致。如果 K+和 K-均很大则抗原抗体复合物形成很快，但不稳定；而 K+和 K-均小时抗原抗体复合物 形成较慢，但很稳定。前者适合于亲和层析，后者适合于标记分析。 抗原抗体结合成复合物后解离的速度常数(K-)取决于结合键的强度。已知抗体的亲和 力和结合速度常数 K+，根据动力学基本公式 Kα＝K+／K-可以计算解离常速度数 K-。 例如抗葡萄球菌核酸酶的抗体对酶蛋白抗原的亲和力是 8.3×l08L／mol，结合速度常数 K+＝ 4．1×l05 L／(mol·s)，比对半抗原的结合常数低。由公式 Kα＝K+／K-计算得到 K-＝4.9×10-4 L ／(mol·s)。然后根据公式 t1/2＝1n2／K-，计算半解离期(half－time for dissociation)，得到该抗 体与抗原复合物的半解离期为 23min。了解抗原抗体复合物的半解离期便可知道结合物在多 大的时间范围内稀释而不影响结合物的解离，这对在免疫亲和层析等许多其他免疫方法的应 用中有重要意义。 抗原抗体反应的速度在很大程度上取决于抗原分子和抗体分子的扩散速率及碰撞的机 率。扩散速度常数用下式表示： Kdl＝4∏αD(6×1020) α为抗原和抗体分子半经之和(单位为 cm)；D为反应系统中抗原和抗体分子的扩散常数 之和(单位为 cm2／s)；6×1020为转换函数，为了把单位转换为 L／(mol·s)。例如 α＝10-6cm， D＝10—7cm2／s，Kdl=7.5×108L／(mol·s)。通常大的蛋白抗原比半抗原与抗体结合的速率要慢， 大部分蛋白质的结合速度在 105—106L／(mol·s)，而理论上限为 109 L／(mol·s)。 二、抗体与单价抗原的作用 1．抗体亲和力的测定 抗体亲和力的测定的方法常采用作图法。抗原抗体反应最简单的情况是单克隆抗体与单 价抗原的反应，如半抗原与单克隆抗体或单克隆抗体与大分子抗原上单一的非重复的位点(抗 原决定簇)的作用。以最简单的单克隆抗体与半抗原反应为例的作图法，首先用平衡透析 (equilibrium dialysis)(图 7—7A)来测定—系列游离抗原及结合抗原的浓度。根据不向抗原浓 度进行平衡透析所获得的结合抗原，游离抗原。抗体浓度是已知的。根据这些数据，进行 Scatchard分析，即可计算出 Ka的值(图 7—7B)。 Scatchart分析方法是将 Ka＝[SL]/[S][L]分子和分母都除以抗体的浓度，[SL]/[Ah]=r,r 代表每个抗体分子结合的抗原(单价)分子数[S][L]/[Ab]=[S]/[Ab].[L]＝(n—r)C，[S]/[Ab];表示每 个抗体分子上未被抗原占有的游离抗体结合位的浓度。这—浓度实际上是抗体分子上等于全 部抗体结合位(n)减去以被抗原占据了的结合位数。因为用的是单价抗原，因此也就是减去结 合的抗原分子数 r，即(n—r)。这里的 n实际上代表抗体的价数。C在这里代表抗原的浓度[L]。 由此得到公式： 当固定抗体的浓度用不同浓度的抗原进行一系列的平衡透析实验，得到一系列相应的 r数据， 生物秀-专心做生物 www.bbioo.com 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 bbs.bbioo.com 生 物 秀 -专 心 做 生 物 w w w .b bi oo .c om 14 然后根据以 r/C对 r作图。如果所用抗体是均质的（单克隆抗体），r/C与 r的关系为线性关系， 它的斜率即为亲和力 Ka（图 7－7B）。从公式可见，当抗原的浓度很大的 r/C≈0， 所以 Ka（n－r）＝0或 Ka·n=Ka·r,由图 7－7B可见横坐标 r的截距就等于抗体价 n。 2．亲和力的异质性 当与单价抗原结合的抗体是多克隆抗体时，其 Scatchard图呈非线性关系(图 7—7B)。由 于多克隆抗体来源于多个细胞克隆，其内在亲和力不同。内在亲和力的平均值 Ko常用于表 示异质的多克隆抗体的亲和力，Ko为抗体结合位点 1／2被占据时的游离抗原浓度。 3．抗体结合抗原的特异性——半抗原反应 抗体与单价半抗原反应的特异性极强，半抗原上化学基团的细小差别或位置的改变，则 与抗体的反应性会表现明显的差别(图 7—8)。抗体与同源抗原(homologous antigen)反应最强， 与异源抗原(heterologous antigen)反应相对较弱。有些抗体与异源抗原的反应比同源强，称为 变态抗体(heteroclitic antibody)。抗原分子表面或末端的一些突出的基团，具有免疫优势，是 抗原决定簇的主要结构，影响决定簇的特异性。抗体的抗原结合部位是疏水的，微溶于水的 三硝基苯半抗原与相应抗体形成亲和力很高的复合物，而水溶性很高的糖类、有机离子(如苯 甲酸盐)只能与抗体结合形成低亲和力的复合物。 生物秀-专心做生物 www.bbioo.com 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 bbs.bbioo.com 生 物 秀 -专 心 做 生 物 w w w .b bi oo .c om 15 三、抗体与大分子多价抗原的反应 1．多抗原决定簇——大分子抗原的特征 能与一个抗体结合的大分子抗原的特异性部分称为抗原决定簇 (antigen determinants)。一个大分子抗原常常有多个抗原决定簇而成为多价抗原。抗原决定簇的序列结 构已清楚的称为抗原表位(epitope)。半抗原相当于一个抗原决定簇。大分子抗原上含有多个抗 原决定簇能与相应的特异抗体结合。在一些情况下，决定簇之间相距较远的各自与抗体结合 而互不影响，这种决定簇是不重叠的决定簇。当一个抗体与某一决定簇结合后，在空间上干 扰了其他抗体与相应决定簇的结合，这些靠得较近的决定簇称为重叠决定簇。在少数情况下， 前一抗体的结合导致抗原结构的空间变化，影响了另外抗体的结合，称为变构效应(allosteric effect)。 许多大分子如蛋白质、核酸、复合多糖常常形成重复结构，因而每个分子内有多个 相同的抗原决定簇。颗粒性抗原细胞、细菌及病毒等还可形成多亚基聚合物，也可产生重复 的抗原决定簇，成为多价的(multivalent)抗原。单抗原决定簇的分子即半抗原可吸附在固相载 体上，其结构也类似多价抗原，如 ELISA中的包被抗原，其结合特性和溶液中单价抗原有所 不同。 2．抗原抗体的亲和力和亲合力 单价抗原与抗体反应取决于亲和力(affinity)的大小，而天然多价抗原与小分子半抗原 不同，含有 1个以上的抗原决定簇，因此能与 1个以上的抗体结合。如果没有空间限制，对 重复的多价抗原分子，一个 IgG或 IgE分子有两个结合位点，而—个 IgM有 10个结合位点。 对任何一个位点的亲和力是不变的，总的结合强度包括抗体上所有的结合位的亲和力，抗体 对抗原分子总的结合强度，称为亲合力(avidity)。亲合力大大强于每一位点的亲和力，其强度 增加不仅仅是亲和力的简单相加，而是呈几何级数上升的。因此，一个低亲和力的 IgM分子， 生物秀-专心做生物 www.bbioo.com 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 bbs.bbioo.com 生 物 秀 -专 心 做 生 物 w w w .b bi oo .c om 16 或者多个低亲和力的 IgG分子对一个多价抗原的结合是相当紧密的。 3．抗体与多价抗原结合的浓度带现象 抗体与单价抗原形成的复合物都是可溶性的，但抗体与多价抗原形成的复合物大多 数能形成沉淀。沉淀反应可用于研究抗体与大分子抗原结合的特性。用非蛋白大分子(如多糖) 抗原与相应抗体形成的沉淀，其中只有抗体是蛋白质，为抗体的定量测定提供了方便。在一 定量的抗体中，逐渐增加抗原浓度，沉淀的形成与抗原抗体的比例密切相关。图 7—9是典型 的单特异性沉淀曲线。沉淀反应的曲线分为 3 个区：抗体过量区，抗原与抗体形成小分子复 合物，不形成沉淀或沉淀很少，称为前带(pro－zone)现象；抗原过量区，虽然没有游离的抗 体，但沉淀仍很少，称为后带(post—zone)现象；在抗原抗体等带区(equi—zone)形成大量沉淀， 也没有游离的抗原和抗体存在。如果抗原是多抗原决定簇的多价抗原如细菌、细胞、乳胶颗 粒等表面，则形成凝集反应。 抗原抗体相遇时，不管二者比例如何，很快发生特异性结合，一般在几秒钟内完成， 称为初级反应阶段。初级反应没有可见的沉淀。从特异性结合到可见沉淀形成称为次级反应 阶段。这阶段通常需要更长的时间，从几分钟到几小时甚至几天，才能看见沉淀。次级反应 除受抗原抗体浓度比例影响外，pH值、离子强度和补体的存在也影响沉淀的形成。 抗原抗体形成沉淀的机理，用 Marrack 等人提出的网格理论可得到合理的解释。抗 原—抗体的结合包括许多抗原与许多抗体相互连接形成网格。当这些聚合物达到一定大小时， 便从溶液中沉淀出来。抗体分子大多为二价(1gG)，而大分子抗原一般是多价的，一个抗体可 以与两个抗原上相同的决定簇结合，一个抗原分子也能与多个抗体分子结合，从而形成相互 交联的网格发生沉淀。而抗原或抗体过量时，不能形成网格，故不发生沉淀。反应系统中存 在多种抗原抗体反应称为多特异性系统，它与单特异性反应不同，在沉淀最多时．悬液中仍 有过量的抗原或抗体，这是因为一个独立的反应中，过量抗原会与另—个独立的反应的过量 抗体重叠的结果。此外，在一些反应系统中，即使抗原抗体比例合适，也不形成可见的沉淀、 这是因为抗体的亲和力很低，或者抗体的双价结合位点只结合一个大分子抗原，称为单配双 价结合(monogamous bivalent binding)，或者抗体的双价结合位结合了同一个抗原分子的重复 的决定簇。在上述这些情况下无法形成网格结构，这类抗体称为不完全抗体(incomplete antibody)。 4．交叉反应 大分子抗原常常含有多个抗原决定簇，部分抗原决定簇与另一大分子上的抗原决定 簇