维生素D测定法

1 附录 VII K 维生素 D 测定法 本法系用高效液相色谱法(附录 V D)测定维生素 D(包括维生素 D2和 D3，下 同)及其制剂、维生素 AD制剂或鱼肝油中所含维生素 D及前维生素 D经折算成 维生素 D的总量，以单位表示，每单位相当于维生素 D 0.025μg。 测定应在半暗室中及避免氧化的情况下进行。 无维生素 A醇及其他杂质干扰的供试品可用第一法测定，否则应按第二法 处理后测定；如果按第二法处理后，前维生素 D峰仍受杂质干扰，仅有维生素 D 峰可以分离时，则可按第三法测定。 第一法 对照品贮备溶液的制备 根据各制剂中所含维生素 D的成分,精密称取相应 的维生素 D2或 D3对照品 25mg,置 100ml棕色量瓶中，加异辛烷 80ml，避免加热， 用超声处理助溶 1分钟使完全溶解，加异辛烷至刻度，摇匀，作为贮备溶液（1）； 精密量取 5.0ml至 50mL棕色量瓶中，加异辛烷稀释至刻度，摇匀，充氮密塞， 避光，0℃以下保存，作为贮备溶液（2）。 测定维生素 D2时，应另取维生素 D3对照品 25mg，同法制成维生素 D3对照 品贮备溶液，供系统适用性试验用。 色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂，正己烷-正戊醇(997:3)为流 动相，检测波长为 254nm。量取维生素 D3对照品贮备溶液（1）5ml，置具塞玻 璃容器中，通氮后密塞，置 90℃水浴中加热 1 小时，取出迅速冷却，加正己烷 5ml， 摇匀，置 1cm具塞石英吸收池中，在 2支 8W主波长分别为 254nm和 365nm 的紫外光灯下， 将石英吸收池斜放成 45°,并距灯管 5～6cm,照射 5分钟,使溶液 中含有前维生素 D3、反式维生素 D3、维生素 D3 和速甾醇 D3；取此溶液注入 液相色谱仪，测定维生素 D3的峰值，先后进样 5次,相对标准偏差应不大于 2.0 ％；前维生素 D3(与维生素 D3 的比保留时间约为 0.5)与反式维生素 D3(与维生 素D3的比保留时间约为 0.6)以及维生素D3与速甾醇D3(与维生素D3的比保留 时间约为 1.1)的峰分离度均应大于 1.0。 2 校正因子测定 精密量取对照品贮备溶液（2）5ml，置 50ml 量瓶中，加正 己烷至刻度，摇匀，作为对照品溶液；取一定量注入液相色谱仪，计算维生素 D 的响应因子 f1。 f1＝C1/A1 式中：C1 为维生素 D对照品溶液的浓度（µg/mL） A1 为对照品溶液所得色谱图中维生素 D峰的峰面积 另精密量取对照品贮备溶液 5ml置 50ml量瓶中，加入 2，6-二叔丁基对甲 酚结晶 1粒，通氮排除空气后，密塞，置 90℃水浴中加热 1．5小时，取出迅 速冷却至室温，加正己烷至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液；取一定量注入液 相色谱仪，计算前维生素 D的响应因子 f2。 f2＝(C1－f1A1)／A2 式中 C1 为 f1测定项下维生素 D对照品溶液的浓度（µg/mL） f1为维生素 D的校正因子； A1为混合对照品溶液所得色谱图中维生素 D的峰值； A2为混合对照品溶液所得色谱图中前维生素 D的峰值。 含量测定 取该制剂项下制备的供试品溶液进行测定,按下列公式计算维生 素 D及前维生素 D折算成维生素 D后的总浓度 (Ci)。 Ci＝f1Ai1＋f2Ai2 式中 Ai1为维生素 D的峰值； Ai2为前维生素 D的峰值； 第二法 精密称取供试品适量(相当于维生素D总量 600单位以上，重量不超过 2.0g)， 置皂化瓶中，加乙醇 30ml、抗坏血酸 0.2g与 50％(g／g)氢氧化钾溶液 3ml[若供 试量为 3g，则加 50％(g／g)氢氧化钾溶液 4ml]，置水浴上加热回流 30分钟，冷 却后，自冷凝管顶端加水 10ml冲洗冷凝管内壁，将皂化液移至分液漏斗中，皂 化瓶用水 60～100ml分数次洗涤，洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醚 3 振摇提取 3次，第一次 60ml，以后每次 40ml，合并乙醚液，用水洗涤数次，每 次约 100ml，洗涤时应缓缓旋动，避免乳化，直至水层遇酚酞指示液不再显红色， 静置，分取乙醚提取液，加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分， 分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤，洗液与提取液合并，置具塞圆底烧瓶中， 在水浴上低温蒸发至约 5ml，再用氮气流吹干，迅速精密加入甲醇 3ml，密塞， 超声处理助溶后，移入离心管中，离心，取上清液作为供试品溶液 A。 净化用色谱柱系统分离收集维生素 D 精密量取上述供试品溶液 A 500μl， 注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，以甲醇-乙腈-水(50:50:2) 为流动相进行分离，检测波长为 254nm，从计录仪上观察色谱图，要求维生素 D 与前维生素 D为叠峰，并能与维生素 A及其他干扰含量测定的杂质分开；准确 收集含有维生素 D及前维生素 D混合物的全部流出液，置具塞圆底烧瓶中，用 氮气流迅速吹干,精密加入正己烷溶液适量使每 1ml中含维生素 D为 50～140单 位，密塞，超声处理助溶，即为供试品溶液 B。 取供试品溶液 B，按第一法进行含量测定，进样量为 100～200μl。 第三法 供试品溶液的制备 取该制剂项下制备的供试品溶液 A,按上述第二法净化 用色谱柱系统分离维生素 D项下的方法处理,至“用氮气流迅速吹干”后， 加入 异辛烷 2ml溶解，通氮排除空气后，密塞，置 90℃水浴中，加热 1.5小时后，立 即通氮在 2分钟内吹干，迅速精密加入正己烷 2ml，溶解后，即为供试品溶液 C。 对照品溶液的制备 精密量取对照品贮备溶液适量,加异辛烷定量稀释制成 每 1ml中约含维生素 D 50单位，精密量取 2ml置具塞圆底烧瓶中，照供试品溶 液制备项下的方法，自“通氮排除空气后”起，依法操作，得对照品溶液。 含量测定 在上述第一法的色谱条件下，取对照品溶液与供试品溶液 C，交替 精密进样 200μl，量取维生素 D的峰值，按外标法计算含量。