供心缺血再灌注损伤与心肌细胞凋亡

，心肌细胞的caspase．3水平明显升高。同 时TUNEL染色显示心肌细胞DNA损伤增加[，-81。 Ac—DEVD．CHO为不可逆特异性Caspase一3抑制 剂，能够在细胞水平抑制细胞凋亡蛋白酶级联反 应关键性因子Caspase．3的活性，由此抑制细胞 凋亡而达到减少心肌缺血一再灌注损伤。本实验 在供心长时间保存过程中及围手术期使用Ac． DEVD．CHO干预。探讨在供心长时间低温保存后 缺血再灌注损伤导致的心肌细胞凋亡．明确半胱 天冬酶抑制剂能否在低温下进一步延长供心有 效保存时效，减少细胞凋亡，提高对心脏缺血一再 灌注损伤的保护作用。 1材料与方法 1．1实验动物 健康实验sD雄性大鼠24只，体质量(3504- 15．7)g，由中山大学实验动物中心提供。随机分为 两组：实验组、对照组各12只，每组供体鼠和受体 鼠各6只。建立异位心脏移植模型．对照组试剂： 40％DMSO+PBS。实验组试剂：40％DMSO+PBS+ Ac·DEVD-CHO(0．4mg／mL)。 1．2主要试剂及仪器 HTK心肌保存液及Caspase．3InhibitorAc． DEVD．CHO分别购于德国克勒化学制药和德国 BDPharmingen公司。Caspase．3分光光度法检测 试剂盒和TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒均购 于南京凯基生物科技发展有限公司。TYC染色试 剂购于Sigma公司。 全自动微粒子化学发光免疫分析仪(Beckman Coulter，USA)，生化培养箱(广州医疗器械厂)，显 微镜(日本OLYMPUS公司)。生物信号采集处理 系统(北京微信斯达科技发展有限责任公司)，手 术显微镜(上海医用光学仪器厂)。 1．3实验方法 术前15min实验鼠予氯胺酮(150mg／kg)和 安定(3mg／kg)腹腔内注射麻醉，称重，经尾部静 脉注射试剂O．4mL，腹腔内注射肝素钠200U。接 Pclab生物信号采集处理系统。持续记录心电图。 由剑突沿双侧季肋剪开腹腔，剪开膈肌，由剑突两 侧分别向双腋下剪开胸廓。快速摘取心脏、肺及周 围组织．放于4℃含0．4％肝素钠的生理盐水，用 手指轻轻挤压心肺，使心肺内剩余血液排出。然后 修剪游离升主动脉并横断主动脉，进行主动脉插 管。使用4℃HTK液6mL灌注心脏使之停跳(灌 注压60一70mmHg)，横断肺动脉，用0号丝线经 横窦、上下腔静脉、肺静脉根部远端结扎。使用4 ℃HTK保存液5mL+试剂O．25mL灌洗冠脉 (灌注压60～70mmHg)，距主动脉根部5rain处 横断主动脉，将心脏置人4℃HTK保存液6mL+ 试剂0．5mL，保存9h。受体鼠术前15min实验 鼠予氯胺酮(150mg／kg)和安定(3ms／ks)腹腔内 注射麻醉后，称重，腹腔内注射肝素钠200U。 受体鼠采用腹腔异位心脏移植术[9-lo]：消毒腹 部皮肤，正中开腹。显露肾动静脉水平以下的腹主 动脉和下腔静脉，结扎其间的血管分支。先后阻断 尾、头侧大血管，显微镜下进行供心移植：先做升 主动脉一腹主动脉端侧吻合，后行肺动脉一下腔静 脉端侧吻合。在供心心尖、受体鼠腹壁分别用9．0 无损伤缝线固定心外膜起搏导线两条接Pclab生 物信号采集处理系统，持续记录复跳后供心心电 万方数据 392 中山大学学报(医学科学版) 第30卷 图。血管吻合完成前10min经尾部静脉注射试剂 0．4mL，开放阻断。术后60rain切下供心，快速冷 冻5rain，距心尖6—7mm冠状面横切心脏，切取 1 lain薄片行心肌，ITC染色、下段标本置于40 mol／L甲醛液体中固定，并常规组织学处理、石蜡 包埋后切片行TUNEL染色、HE染色；上段标本放 在一80qc冰箱内冰冻保存检测心肌Caspase．3活 图1心肌TUNEL染色 性。 Fig．1TUNELstainingofcardiaclissue 1．4统计分析TUNELstainingusingallapoptosisdetectionkitshowedall 本实验结果均采用均数±差(孑±s)表 印p龇“‘d8。1i“8i“出。唧”88i”缸TUNEL。p捌n”。刊i。“y”归 t-一l-；,采用sAsforWind。w。8．o社会科学磊计软件：：=awirt。s。怨6‰0mcin。o，f。re．p吮er址fu甜sio=芸￡1。嚣9 hA 包处理数据，采用重复测量的方差分析进行 组内比较和组间交差比较．采用单因素方差分析 和LSD．t进行组间比较。以P<0．05为有统计学 差异的标准。 2 结 果 2．1心率恢复率变化 本实验共完成异位心脏移植模型12例。各组 在恢复灌注后均自动复跳，为窦性心率。在恢复灌 注复跳后60min。实验组心率(71．9±6．9)％恢复 率高于对照组(59．6±10．5)％，(P<0．01)。 2．2心肌TTC染色 q’I'C染色标本使用平板扫描仪扫描。图像使 用软件Image．ProPlusV6．0计算缺血区面积百分 比。异位移植开放后60rain取心肌行TTC染色。 实验组的心肌梗死面积(5．29±2．33)％低于对照 组(22．10±3．00)％(P<0．01)。 2．3心肌Caspase．3活性 在异位移植开放后60min，实验组的心肌 Caspase．3活性(0．695±0．040)％低于对照组 (3．4384-0．035)％(P<0．01)。 2．4心肌TUNEL染色 异位移植开放后60min取心肌行TUNEL染 色，实验组的凋亡指数(5．1±2．3)％低于对照组 (13．4±2．5)％(P<0．01；图1)。 2．5心肌组织HE染色 对照组：光镜下见心肌纤维排列紊乱。横纹模 糊，间质肿胀，毛细血管明显充血，较多红细胞漏 出(图2A)。实验组：光镜下见：组织水肿．心肌纤 维排列尚整齐，毛细血管轻度充血。少量红细胞漏 出，内皮细胞轻微损伤(图2B)。 图2心肌liE染色 Fig．2HEstainingofcardiactissue TheCaspase3-treatedgroupforAshowstheleastdisease， comparedwiththeContwlgroupforBafter60minofreperfusion， 40× 3讨论 心脏移植中提高供心的保存时效。减轻缺 血一再灌注损伤，是移植成功的先决条件。对于提 高供心的保存水平采取的措施是多方面的。对灌 注液药物成分的研究是其中一方面，这一研究贯 穿心脏移植的始终。取得了相当的进展．但距临 床的仍有相当的差距，这就促使我们在心脏 移植灌注液及移植过程中药物使用方面进行进 一步深人研究。细胞的凋亡对于在常温和低温条 件下的心肌缺血再灌注损伤所起的作用日益受 到重视。 3．1心肺缺血再灌注损伤机制 目前认为造成心脏缺血一再灌注损伤的原因 是多方面的[¨。s】：其中自由基、钙超载、中性粒细 胞、能量缺乏、游离脂肪酸及脂代谢中间产物等的 损伤作用。最近研究表明心肌缺血一再灌注损伤的 发生与细胞凋亡密切相关，再灌注是心肌细胞凋 亡的因素之一。持续缺血的心肌和缺血后再灌注 万方数据 第4期 张晓慎，等．供心缺血再灌注损伤与心肌细胞凋亡 393 的心肌均有细胞凋亡发生，再灌注可减少凋亡的 心肌细胞数．但却使不可挽救的心肌细胞加速发 生凋亡。心肌磷脂(Cardiolipin，CL)的合成和分解 过程在维持线粒体结构、功能及细胞存活方面起 关键作用．cL与细胞色素C之间的相互作用是凋 亡的起始步骤。同时细胞色素氧化酶和腺嘌呤核 苷酸移位酶均在凋亡中起关键作用。缺血心肌再 灌注后心肌细胞凋亡明显增加．且随缺血及再灌 注时间延长显著增多。提示心肌缺血或再灌注过 程有促进或加速心肌细胞凋亡的作用。这可能是 由于再灌注后虽然心肌得到了血供．但增加了自 由基的形成．也加重了钙超载。从而触发了心肌细 胞的凋亡【1引。研究显示抑制心肌细胞凋亡，可以减 轻心肌缺血一再灌注损伤。 3．2半胱天冬酶抑制剂对心脏移植供心缺血一再 灌注损伤保护作用 细胞凋亡的一个关键性因子是一类独特的天 冬氨酸一半胱氨酸特异的蛋白酶。统称为天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase，半胱天冬酶)。目 前这一蛋白酶至少已确认14个亚型。这些酶以休 眠的酶原状态存在。在特定的条件下经过处理变为 有催化活性的成熟酶。Caspase．3是细胞凋亡蛋白 酶级联反应的必经之路。也是凋亡的关键酶和执行 者。Ac—DEVD．CHO为不可逆特异性Caspase．3抑 制剂，能够在细胞水平抑制其的活性，由此抑制细 胞凋亡而达到保护心肌缺血再灌注损伤。 已有研究发现。Ac—DEVD—CHO能明显抑制缺 氧诱导的心肌细胞凋亡。其作用机制与抑制 caspase一3蛋白酶活性密切相关[17]，在常温急性心 肌缺血模型．Ac．DEVD—CHO通过抑制心肌及血管 内皮细胞凋亡而减少心肌缺血一再灌注损伤【18]。 因此，我们在大鼠心脏异位移植模型上。使用 Ac．DEVD．CHO作为心肌细胞凋亡阻断因子．对心 脏移植供心低温长时间保存后在体的缺血一再灌 注损伤进行了研究。本实验研究观察到：①在恢 复灌注复跳后60min，实验组的心率的恢复百分 比均高于对照组。②在恢复灌注复跳后60min取 左室心肌Trc染色，实验组的心肌梗死面积低于 对照组．提示Ac．DEVD．CHO可能从减少微血管 损伤及心肌凋亡两方面减少了实验组的心肌细胞 梗死。③实验结果发现缺血再灌注后对照组的心 肌结构损伤较实验组严重。④在恢复灌注复跳后 60min取左室心肌TUNEL染色，实验组及对照组 均发现凋亡细胞，证实在供心长时间低温保存再 灌注后，心肌细胞出现凋亡现象．实验组的凋亡指 数低于对照组，提示实验组的细胞凋亡减少。⑤在 恢复灌注复跳后60min．实验组的心肌Caspase．3 活性低于对照组．提示实验组Ac—DEVD．CHO有 效地抑制了Caspase．3活性，结果和实验组的细胞 凋亡减少结果一致．提示Ac．DEVD．CHO抑制了 心脏缺血再灌注后的细胞凋亡。 综合TUNEL染色及Caspase．3活性检测结 果。证实供心在长时间低温保存后出现了明显细 胞凋亡。抑制了Caspase一3活性。可以抑制相当数 量心肌细胞的凋亡，但是未能抑制全部细胞的凋 亡。其可能因素包括：存在另外的凋亡通路以及 和Ac．DEVD．CHO的药效、剂量有关。 3．3小结 综合上述结果，可以得出以下结论：①供心长 时间低温保存再灌注后细胞出现明显凋亡．心肌 细胞凋亡是心脏移植供心长时间保存缺血再灌注 后心功能下降的主要机制之一。②使用半胱天冬 酶抑制剂能明显抑制心肌细胞凋亡。减轻供心缺 血再灌注损伤．改善供心心功能，是提高供心保存 时效的良好方法。③半胱天冬酶抑制剂3可以抑 制相当数量心肌细胞的凋亡．但是未能抑制全部 细胞的凋亡，其可能因素包括：存在另外的凋亡通 路以及和Ac．DEVD．CHO的药效、剂量有关。综合 细胞凋亡的调控机制．采用多位点的抗细胞凋亡 方法可能会进一步减少因缺血再灌注损伤导致的 供心细胞凋亡。 参考文献： [1]KatoriM。BuelowR，KeB，eta1．Hemeoxygenase一1 overexpressionprotectsratheartsfromcoldischemia／ reperfusioninjuryviaanantiapoptoticpathway[J]． Transplantation。2002，73(2)：287-292． [2]BeranekJT． Apoptosisis themainmechanismof eardiomyocytedeathin thehyperaeuterejectionof heartxeno．andallografts[J]．Transplantation，1997， 64(11)：1632-1633． 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文章编号：1672—3554(2009)04一0394一Ol 男性乳腺癌发病率较低，国内男性乳癌约占 全部乳腺癌患者的l％。而男性分泌型乳腺癌患者 更为少见。我院2008年接收1例幼年男性分泌型 乳腺癌，现报告如下：患儿男性，4岁，2006年12 月因碰撞右侧胸壁后发现右乳腺外下象限肿块， 约1．0cm×1．0cm．家长考虑血肿而未予治疗，但 肿块渐增大。遂于6个月后在当地医院检查：右胸 壁肿块约为2．0cm×2．0cm×1．0cm大小，质 中，活动度可。无压痛．右侧腋窝可触及两枚直径 约0．7～0．8cm肿大淋巴结，质硬，活动度差。 2007年6月23日在当地医院行乳腺肿块切除术， 术后标本送四川华西医院病理科诊断为：倾向幼 年性乳腺癌。遂行右乳腺癌改良根治术。蜡块经我 院病理科诊断为：右乳腺浸润型癌(倾向为分泌型 癌／幼年性乳腺癌，男性乳腺癌)，腋窝淋巴结2／ ll枚转移；免疫组化雌孕激素受体ER(一)，PR(+)， 原癌基因CerbB2’：分期为pT2NIMOlIb期。术后 外院行CMF方案(环磷酰胺400mg，第l天加甲 氨蝶呤25mg和5一氟尿嘧啶400mg)化疗6周 期，化疗后予他莫昔酚5mg(2次／d)未行放射治 疗，随访至今患儿身体健康，发育良好。 (编辑孙慧兰) 万方数据