组织细胞培养技术

组织细胞培养技术     一．发展概况     组织培养(Tissue culture)是在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下。使从体内取出的组织生存、生长繁殖和传代，并维持原有的结构和功能特性。广义的组织培养与体外培养同义。体外培养(Invitro)包括所有结构层次的培养，即：组织培养、细胞培养和器官培养。     所谓细胞培养(Cell culture)是指细胞包括单个细胞在体外条件的生长。     组织培养的发展史已有近百年，最初的组织培养是胚胎学和微生物学的引申，建立于无菌原则上，用天然体液（如胎汁、血浆）来维持从整体切下的组织块，对细胞进行形态和功能的观察。     通过许多学者大的改进和革新，培养基由天然动物血浆改为合成培养基，促进细胞生长物质从胎汁改为动物血清。现在全世界贮存的细胞约有万种以上。组织培养不仅是细胞生物学必需的技术，也是分子生物学、肿瘤学、遗传学和免疫学等学科必要的。     二．基本原理和方法     体外培养细胞的生存条件：     (一)营养。     体外培养细胞所需的营养物质与体内相同，主要有糖、氨基酸和维生素三大类。目前市面上销售的合成培养基如1640、199等所含的氨基酸已足够，但在使用合成培养基时，仍需加入一些天然成份，如人或动物的血清、血浆和胎汁等。目前主要使用血清，以牛血清为主。血清的生物效应早已证明，它含有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其它活性物质等。不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁。不同血清对细胞作用不同。以小牛血清最好，成年牛和马血清次之。合成培养基中不加血清也能维持细胞生存，但不能很好生长，加入5%的血清，对大多数细胞来说，能维持细胞不死和缓慢生长，要使细胞正常生长，一般需加10～15%的小牛血清。每个批号血清使用前要加热处理，一般灭活于56℃水浴中30分钟，每个批号血清使用前要加热处理，一般灭活于56℃水浴中30分钟，每5分钟摇一次。10%血清营养液能促进细胞增殖称为生长液，2～5%血清培养液不能使细胞增殖而只能维持其生存称为维持液。添加血清，虽利于细胞生长，但增加了不明成分，给分析实验结果带来了困难。因此，人们正在探索不用血清的无血清液并已取得了一定进展。    （二）环境     1．无菌：无菌是保证培养细胞生存的首要条件。培养液不仅对细胞是高营养物，对细菌和霉菌也是高度营养物，细胞培养中如污染微生物，其繁殖比细胞快且能产生毒素使细胞死亡，因此细胞培养技术的关键之一是防止污染。污染微生物可来源于组织培养液、器皿、组织本身、工作者本身。因此，培养室的空气等要彻底消毒，所有操作均要严格实行无菌操作，各种物品拿入操作台前应消毒，用洒精擦面，用前于紫外线照；操作者洗手、泡手，酒精擦手，打开培养管前须在火焰上烙烧一下瓶口以使灰尘固定，操作时须将瓶、管斜放，吸管注入液体应避免和瓶口接触，操作时禁止讲话。     2.温度：组织培养的最适温度为35-37℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。培养细胞对低温的耐受力比高温强。温度增加2-3℃对细胞产生不良影响，使之在24小时死亡，温度在43℃以上，细胞大多被杀灭，而低温对细胞影响较小，细胞置于25-35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度缓慢，放在4℃数小时之后，再置37℃培养，细胞仍能继续生长。     3.气体：气体也是细胞生存的必需条件之一。所需的气体主要有O2和CO2。O2参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。CO2既是细胞代谢产物也是细胞所需成分。它主要与维持培养液pH值有直接关系。     4.pH值：多数细胞的适宜pH值为7.0-7.4，偏离此范围对细胞可产生有害的影响。各种细胞对pH值的要求也不完全相同，但总的来说，细胞耐酸性比耐碱性大一些。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐/ CO2。细胞代谢产生的各种酸使pH下降，而培养液中的NaHCO3产生CO2排入空间又使pH增加。     5.培养器皿的处理：培养器皿处理的好坏与否对于细胞的贴壁生长影响很大，除少数悬浮生长的细胞外，绝大多数细胞属于贴壁依赖性细胞或培养物。它们只有贴附于不起化学作用的物体的表面时，才能生长、生存或维持功能。目前，常用的器皿主要有玻璃及塑料二大类。玻璃器皿一般须用清洁液浸泡1至7天，清水冲洗20次后再用蒸馏水过洗2次，烤干备用。用前160℃高温消毒2小时后使用。96孔或24孔塑料板一般用2%NaOH浸泡4小时后，清水洗净再用1N HCL浸泡4小时，用清水冲洗后再用蒸馏水漂洗，37℃干燥后，紫外线灯照射消毒；新橡皮塞须先用1/2NnaOH煮沸15分钟，冲洗后再用4%HCL煮沸15分钟，清水冲洗后用蒸馏水洗5次，煮沸10分钟灭菌，或送高压灭菌。     总之，细胞在适当的培养条件下可迅速增殖，但若遇到不良环境细胞会变圆，停止生长，甚至死亡，这是细胞的保护机制。综上所述，细胞培养的基本条件主要包括了营养液、无菌条件、PH、温度、气体条件和培养器皿的清洁度。     三．常用的培养方法     根据培养物细胞生物学的特点，组织培养可分为原代培养和传代培养。亦可根据培养条件和器皿的不同而分为静置培养和动态培养。静置培养为最常见的方式，细胞可为贴壁型细胞，亦可为悬浮的不贴壁细胞。    （一） 传代细胞的静置培养     我室现存的细胞均为传代细胞，CNE-2Z是我们80年代从一鼻咽癌病人取组织经过体外原代培养、传代培养、连续传代，生长稳定，并经过一系列的生长特性检测（如生长曲线、分裂指数、细胞群体倍增时间、集落形成率）、染色体分析、异体移植、电镜观察等而建立的，并于83年荣获省高教厅及卫生厅科研成果一等奖，84年卫生部科研成果乙等奖。建系20年来，CNE-2Z已在全世界广泛应用，我室也仍有保存和应用。     培养细胞的观察和传代:所有体外培养细胞，包括原代培养和各种细胞系（株），当生长达到一定的密度后，都需要做传代处理。传代的频率和间隔与接种细胞的数量、细胞生物学特性以及营养性质等有关。接种细胞多则细胞数饱和速度快；肿瘤细胞系比原代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多时，细胞增殖快。一般是在细胞长满瓶壁、营养及PH稍降低时做传代培养，依据细胞特性，将一瓶细胞1：3或1：4传代。在细胞长满时，应尽早传代，否则细胞会中毒，形态发生改变，重则从壁上脱落死亡。传代过晚（若已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态，细胞需要再传一两代，把不健康的细胞除去，才能恢复使用。那么，怎样才能做到及时传代呢？要做到及时传代，每天要仔细观察细胞的生长情况来决定是否要换液或传代。一般是形态观察，用倒置显微镜对活细胞形态、胞浆和胞膜进行观察。生长状态良好的细胞透明度大，细胞内颗粒少，看不见空泡，胞膜清晰，折光性强。培养上清液清晰透明，看不见悬浮的细胞和碎片。细胞机能不良时，胞质中常出现空泡，脂滴和其它颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态可变得不规则，甚至失去原有的特点。只有状态良好的细胞才能用来做实验。一般在细胞接种或传代后，每天或至多间隔1-2天，应观察细胞形态、细胞生长、培养液PH值和污染与否等，随时掌握细胞动态变化，以便于做换液或传代处理。如发现异常情况，及时采取措施。正常情况下，培养液呈桃红色，用一般温箱培养时，随细胞生长时间的延长，二氧化碳积累增多，由于培养基内有PH指示剂的存在，其颜色可间接反映细胞的生长状态。呈橙黄色时，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色则可能是培养时间过长，营养不足，死亡细胞过多；呈紫红色则可能是细胞生长状态不好或已死亡。    （二） 培养细胞的保存和复苏     做实验前要先学会冻存，以备自己在后面的实验中能保持同一来源、稳定可靠的细胞，且可减少污染或其它不利影响。     1.影响冻存细胞活性的因素    （1）细胞冻存保护剂：常用的有二甲基亚砜（DMSO）和甘油，常用的浓度为5%-10%（90%小牛血清）。DMSO对二倍体细胞的毒性较甘油小。    （2）细胞悬液的冻结速度：慢冻时冰冻在细胞外形成，因此不致损害细胞。多数细胞以每分钟下降1℃的速度，降至-20℃冻结。均可获得满意效果。    （3）保存温度：液氮罐，可达到-196℃，此时所有的物理化学活动均降至最低限度，以保证细胞长期保存。 （4）复苏：急速融化复苏可防止损害细胞。冻结细胞从液氮中取出后，应立即放入37℃～43℃的水浴中，30秒至一分钟内融化。     2.冻存与复苏方法     适用于原始组织、原代细胞和细胞系（株）。A.细胞用胰蛋白酶+EDTA消化后用冻存液稀至2～5X106/ml。B.分装于2ml冻存管中，装量1ml，封口，作好标记，用几层纱布扎好。C.冻存管进入液氮前应有一个渐降温的过程，以1℃/min的速度降温，一般挂在液氮上空8小时后，投入液氮贮存罐中长期保存。D.为使冻存的细胞复苏，将冻存管置于37℃～43℃水浴中，充分摇动使其急速融化，30秒至1分钟内完成。E.细胞悬液低速离心，去除上清中的保护添加剂，加入原来使用的生长液，置37℃培养。     四．基本设备和试剂     设备（略），环境要求清洁、空气干燥和无烟尘。     基本试剂     培养液：①1640溶于新蒸的三次蒸馏水中，搅拌使其充分溶解，过滤除菌即可。②小牛血清用前56℃X30分钟灭活（破坏补体）分装置-20℃保存备用。③青链双抗液将100万单位的青霉素钠盐和硫酸链霉素用高压2次后的三蒸水100ml充分溶解，分装冻存于-20℃，使用前融化，每100ml生长液中加1ml，即使用终浓度为含P.S 100μg/ml。（注：P.S不能冻融多次，应少量分装，一次用完）。④NaHCO3液，用于调整pH值，常用浓度为5～6%，配制用三蒸水溶解后过滤除菌或高压灭菌，分装4℃保存。⑤胰蛋白酶  在pH 8.0，温度37℃时作用力最强（详见配方）。⑥EDTA液（详见配方）。 附： 胰酶消化液配方（500ml） NaCL          4 g KCL（19%）    1 ml Na2HPO4       0.126g(12H2O) Tris          1.5g(三羟甲基氨基甲烷)     以上药物充分溶解后加水至500 ml，然后再加胰蛋白酶5g，最后用1N HCL调pH至7.7，过滤除菌分装，然后-20℃保存备用。 EDTA液配方（0.2% 1000ml） EDTA(versene)    2 g NaCL             8 g KCL              0.2g Na2HPO4(12H2O)   2.9g KH2PO4           0.2g     以上药物同样充分溶解后，加新鲜的三蒸水至1000 ml，分装然后高压15磅30分钟灭菌，最后4℃保存备用。     细胞冻存液：小牛血清90℅与二甲基亚砜（DMSO）10℅混合; -20℃冰箱保存备用。或小牛血清30℅，1640培养液60℅，DMSO10℅混合; - 20℃冰箱保存备用。 参考《组织培养和分子细胞学技术》.北京出版社.主编：鄂征.1995,第二版 作者：邓惠华（鸣谢唐泽立、陈燕、陈速输入）