HIV病毒学检测及质量保证指南

HIV-1病毒载量检测及质量保证指南 _____________________________________________________________________ 本指南由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心艾滋病参比实验室组织有关专家撰写，由中国疾病预防控制中心批准执行。 编写主持人：蒋岩 编写人员： 潘品良 蒋岩 李敬云 钟平 尚红 李太生 审核咨询专家及技术人员：邵一鸣 康来仪 朱效科 王佑春 汪宁 朱红 郭志宏 季阳 刘海林 肖瑶 邱茂锋 马春涛 编写单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心 参编单位：中国人民解放军军事医学科学院 上海市疾病预防控制中心 中国医科大学 北京协和医院 技术顾问：Mike Ussery, Hao Zhang 美国国立卫生研究院 过敏及传染病研究所 James W. Bremer 美国Rush 大学医学中心VQA实验室 Trever Peter 克林顿基金中国艾滋病防治项目实验室专家 Donald J. Brambilla 美国华盛顿大学新英格兰研究所 Francis F. Mandy 加拿大公共卫生局疾病预防控制中心国家免疫学实验室 前 言 随着HIV-1病毒载量检测在艾滋病临床辅助诊断和抗病毒治疗监测以及艾滋病科研工作中的广泛应用，我国开展该项检测工作的实验室日益增多。自1997年艾滋病实验室首次引进HIV-1病毒载量检测技术，截至2007年底，全国已经配备了近120台HIV-1病毒载量检测仪，覆盖了疾控、医院、检疫、军队等系统。目前，虽然许多实验室已经将病毒载量检测纳入艾滋病相关辅助诊断和治疗监测工作，但大多数实验室开展工作的时间较短，经验不足，因此，急需加强该领域的培训和质量控制工作，以保证检测结果的准确性和可靠性。 为了加强质控和保证检测质量，并得到国际上的认可，艾滋病参比实验室2004年开始参加美国NIH组织的HIV-1病毒载量检测能力验证工作。在通过考核和积累经验的基础上，2005年启动了国内HIV-1病毒载量检测能力验证工作。在积极组织实验室能力验证的同时，艾滋病参比实验室也对实验室技术人员进行培训，积极开展室内质控。这些工作对提高HIV-1病毒载量的检测技术，保证质量起到了重要作用。为了进一步规范艾滋病实验室HIV-1病毒载量检测，建立标准化质量控制程序，准确开展各项检测及质量控制工作，特制定本指南。 本指南是根据各种HIV-1病毒载量检测的技术要求，结合现行的国内外相关技术规范而制定。本指南针对HIV-1病毒载量检测的实验室设置、样品管理、检测技术、质量控制、生物安全等方面提出指导。 本指南自2006年初正式开始编写，性病艾滋病预防控制中心多次组织了有国内外专家参加的指南编写专项技术咨询会，与会专家对指南提出了很多建设性意见和建议，美国NIH病毒载量检测质量保证实验室专家多次对指南进行认真的审阅和具体指导。指南编写过程中，也认真听取了实验室一线检测人员的具体需求和建议，并补充了大量的实验数据，包括HIV-1病毒载量检测值的稳定性、冻融影响实验与不同检测方法之间比较的实验数据等。在此基础上，经过多次修订、补充和审定，于2007年11月完成《HIV-1病毒载量检测及质量保证指南》的最后定稿。 由于国内外还没有可作为参考的HIV-1病毒载量检测及质量控制的相关指南，因此本指南主要提出一些原则上的参考建议，其中定有不妥之处，希望广大同仁提出意见，以便不断完善。 致 谢 在本指南的编写过程中，世界卫生组织、克林顿基金中国艾滋病防治项目和美国NIH等国际组织与机构给予了大力支持，全国HIV-1病毒载量检测实验室一线操作人员提出了许多建设性的意见和具体需求，艾滋病参比实验室工作人员毛玮、陶晓霞进行了大量的补充实验和文字编辑工作，才保证本指南的编写顺利完成，在此一并向他们表示真诚的感谢。 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心主任吴尊友研究员在本指南编写过程中提出了重要的修改意见，在此特别致谢。 HIV-1病毒载量检测及质量保证指南（2007版） 目录 第1章 总则 第2章 实验室设置 第3章 样品的采集、处理、保存、运输 第4章 常用HIV-1病毒载量检测方法简介 第5章 室内质量控制 第6章 外部质量控制 第7章 实验室生物安全 附表1 常见问题分析和处理 附表2 HIV-1病毒载量检测样品送检及接收单 附表3 HIV-1病毒载量检测能力验证样品接收专用单 附表4 HIV-1病毒载量检测报告单 附表5 HIV-1病毒载量能力验证结果专用报告单（NASBA) 附表6 HIV-1病毒载量能力验证结果专用报告单（RT-PCR) 参考文献 缩略语 第一章 总 则 1.1意义 HIV-1病毒载量是艾滋病防治工作中一项重要的实验室检测指标。检测HIV-1病毒载量可以监控和预测病程，指导艾滋病患者的抗病毒治疗，包括确定治疗时机、选择治疗方案、评价治疗效果；结合疾病临床症状和其它实验指标，可作为早期感染诊断的辅助手段；还可用于婴儿早期感染的辅助诊断以及采供血机构样品的窗口期检测。为了准确地检测HIV-1病毒载量，必须对开展HIV-1病毒载量检测的实验室进行规范化管理和质量控制，才能保证检测结果的准确性和可靠性。 1.2目的 指导HIV-1病毒载量检测工作，规范实验室质量控制与管理。 1.3适用范围 适用于我国开展HIV-1病毒载量检测工作的所有实验室。 第二章 实验室设置 各种HIV-1病毒载量检测方法需要相应的辅助设备才能完成检测。以下为HIV-1病毒载量检测实验室不同分区内必备的辅助设备及耗材。 2.1样品处理区： 2.1.1生物安全柜：二级 2.1.2离心机（32000g，可离心1.5mL 管子） 2.1.3冰箱：4℃，-20℃，-80℃ 2.1.4水浴箱：准确度小于0.5℃ 2.1.5加样器1套（20μL、200μL、1000μL），为专用设备 2.1.6有滤芯的一次性吸头（无DNA和RNA酶） 2.1.7计时器 2.1.8旋涡振荡器：震动频率可调 2.1.9 一次性工作服、帽、口罩、无粉手套、鞋套 2.2试剂准备区： 2.2.1超净工作台（或密闭工作台） 2.2.2加样器1套（20μL、200μL、1000μL），为专用设备 2.2.3离心机（18000g，可离心1.5mL 管子） 2.2.4冰箱：4℃，-20℃ 2.2.5 计时器 2.2.6旋涡振荡器，震动频率可调 2.2.7有滤芯的一次性吸头（无DNA、RNA酶） 2.2.8 1.5mL 管子（无DNA和RNA酶）和1.5mL 试管架 2.2.9一次性工作服、帽、口罩、无粉手套、鞋套 2.3扩增产物分析区： 2.3.1 HIV-1病毒载量检测仪 2.3.2加样器1套（20μL、200μL、1000μL） 2.3.3冰箱：4℃，-20℃ 2.3.4水浴箱 ( 41℃ ) 2.3.5旋涡振荡器：震动频率可调 2.3.6有滤芯的一次性吸头（无DNA、RNA酶） 2.3.7一次性工作服、帽、口罩、无粉手套、鞋套 2.4 HIV-1病毒载量检测实验室设备分布示意图 HIV-1病毒载量检测实验室设备分布示意图 扩增产物分析区 冰箱 样品处理区 试剂准备区 2.4.1总体原则：各区独立、控制风向、因地制宜、方便工作。具体来说： 2.4.1.1各区必须是相互独立的，有条件各区内可分别设置缓冲间，以保证不同区之间始终完全分隔开。 2.4.1.2各区的仪器设备以及各种物品必须是专用的。 2.4.1.3 试剂准备区和样品处理区可保持低度正压（或常压）状态，使空气流向始终由室内向外，以避免扩增污染物进入此区域。 2.4.1.4 扩增产物分析区可保持低度负压状态，使空气流向始终由室外向内，以防止扩增产物造成其他区域的交叉污染。可安装排风扇或其他排风装置。 2.4.1.5扩增产物分析区可以设在远离其他各区的地方。 2.4.1.6工作时必须遵循单一工作流向进行，即工作流向只能从试剂准备区开始，到样品处理区，然后再到扩增产物分析区。 第三章 样品的采集、处理、保存和运输 样品采集、处理、保存和运输，按照所使用检测方法的要求严格执行。用于HIV-1病毒载量检测的样品推荐采用抗凝血浆。 3.1 样品的采集 3.1.1 采样器材：一次性抗凝真空采血管、持针器、蝶形针等。 3.1.2 抗凝剂： 通常采用EDTA（乙二胺四乙酸）或ACD（枸橼酸钠） ，并符合不同检测方法对样品的要求。 3.1.3 样品标识：在采血管上贴对应的样品编号，并填写HIV-1病毒载量检测样品送检及接收单（附表2）。 3.1.4 样品采集量：通常采集全血3～5ml, 采集的样品量应尽可能与定量采血管的刻度一致，采集量过多或不足，会造成血液凝固或被稀释。 3.1.5 样品的混匀：采集血液后，立即轻轻上下颠倒抗凝管约10次，使血液与抗凝剂充分混匀。 3.1.6 获取其它信息：包括采集对象的基本信息和流行病学资料，抗病毒药物使用情况，以往的实验室检测结果，在HIV-1病毒载量检测样品送检及接收单（附表2）上备注栏注明。 3.2 样品的处理 3.2.1 一般要求在采血后6小时内进行离心，室温下800-1200xg离心10分钟。 3.2.2 分离后，吸出血浆，分装到无菌的聚丙烯螺口冻存管中，并注明分装时间。在冻存管上贴样品编号。 3.2.3 血浆样品不能灭活。 3.2.4 做好样品处理。 3.3 样品的保存 3.3.1保存条件：根据血浆检测时间而定，4天内可在4℃暂时保存，3个月以内应冻存于-20℃以下，3个月以上应置于-70℃以下。不推荐使用自动除霜冰箱。 3.3.2血浆样品冻融不应超过3次。 3.3.3监控并记录保存温度以及样品状态的变化。 3.3.4防止样品变质、泄漏及污染。 3.4 样品的运输 根据《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》的要求运输，并严格控制运输的冷冻状态，防止样品冻融。 3.5 样品的发送和接收 3.5.1发送样品时必须填写样品HIV-1病毒载量检测样品送检及接收单（附表2）。 3.5.2接收样品时，核对样品数量，检查样品状况，按HIV-1病毒载量检测样品送检及接收单（附表2）核对。 3.5.3 样品管破损造成样品溢出、出现明显溶血、凝血的样品，不宜作HIV-1病毒载量检测；如果样品已经融化， 4℃保存并尽快检测，记录冻融一次。 第四章 常用HIV-1病毒载量检测方法简介 目前常用的HIV RNA测定方法为核酸序列依赖性扩增(NASBA) 技术，代表产品为NucliSens ECL 及其升级产品荧光实时PCR技术NucliSens EasyQ仪；逆转录PCR系统（RT-PCR）技术，代表产品为AMPLICOR HIV-1 MONITOR assay；分枝DNA信号放大系统（bDNA）技术，代表产品为bDNA 340分析仪；实时荧光定量PCR扩增技术（real-time PCR），M2000与国产试剂盒均属此类技术。 4．1 核酸序列依赖性扩增(NASBA)技术 最早产品为NucliSens ECL定量RNA测定方法，最近被NucliSens EasyQ新一代荧光实时定量PCR所取代。NASBA技术是一种等温扩增系统，其扩增基础在于系统内的混合酶系统，此系统内含有逆转录酶AMV-RT和T7-DNA多聚酶在体外模拟逆转录病毒体内复制过程。 此方法可分成四个步骤：核酸释放、提取、扩增和测定。扩增后的产物使用NASBA QR电化学发光（ECL）系统进行检测和定量，此系统包括亲和素标记的磁珠、生物素标记的核苷酸片段（此片段可与新合成的RNA产物的一端互补结合）及可特异与四种产物结合的探针（探针上标记有铷元素），这四种探针可分别与不同的RNA产物结合。将四种探针分别置于不同的反应管内，在适当的条件下（410C）几种成分将结合在一起，形成复合体。这些复合体可在ECL读数仪中被分别读取铷元素的激发信号，根据野生型病毒核酸测定值与其他三个内标物测定值的比较可得到野生型病毒的拷贝数。 Nuclisens EasyQ 结合NASBA（核酸序列基础分析）技术与分子荧光探针技术（Molecular Beacon）检测血浆中的HIV RNA水平。这种结合的方法使用了实时扩增分析（real-time amplification assay），提高了对诊断质量的要求。 4．2 逆转录PCR系统技术 目前用得最广泛的仪器为COBAS AMPLICOR和相应的检测试剂COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITORTM 1.5版。 聚合酶链反应人类免疫缺陷病毒HIV-1定量检测试剂盒1.5版是在聚合酶链反应全自动诊断仪上定量测定人血浆中人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）RNA水平的体外核酸扩增检测试剂盒。该检测试剂盒可以通过两种样品处理程序进行检测，即标准的和超敏感的操作步骤，定量测定含量为50-750,000拷贝/毫升 HIV-1 RNA。标准的样品处理程序中，HIV-1 RNA通过应用裂解液裂解病毒颗粒从而直接从血浆中分离出来，然后用乙醇沉淀RNA。采用超敏感的制备方法，血浆中HIV-1病毒颗粒首先通过高速离心浓缩，然后用裂解试剂裂解病毒颗粒。再用乙醇沉淀RNA。 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITORTM试剂盒1.5版包括5个主要步骤：试剂准备；样品制备；靶RNA的逆转录产生cDNA；用HIV-1特异互补引物进行靶cDNA PCR扩增；通过比色与探针结合的扩增产物的测定。HIV-1病毒RNA的定量检测是采用HIV-1定量标准品来完成的。HIV-1定量标准品是包括作为HIV-1 靶RNA引物结合部位和HIV-1扩增子单一探针结合区的非感染性RNA 转录物。将已知拷贝数的HIV-1定量标准品加到每一个样品中和HIV-1靶序列一起共同进行样品制备、逆转录、PCR扩增、杂交和检测并和HIV-1靶序列一起扩增。COBAS AMPLICOR 分析仪根据HIV-1定量标准品的数据计算每一个样品的HIV-1 RNA的含量。该定量标准品补偿了抑制因素的影响并且扩增过程的质控使每一个样品的HIV–1 RNA得以准确定量。 4．3 分枝DNA（bDNA）技术 分枝DNA测定技术基于其独特的信号放大系统，即分枝DNA信号放大系统，这是一个人工合成的分枝DNA，分枝DNA的分枝可结合多个酶标记物，从而将病毒的信号放大，以便进行检测。此检测系统不涉及核酸扩增反应。本方法定量系统中没有内标记物，每次实验设置一系列外部标记，通过实验样品反应强度与外部标记样品强度的比较确定实验样品的病毒拷贝数。 每一种bDNA检测都有各自的步骤或试剂。bDNA检测通常包括以下步骤：（1）将患者血清或血浆连同含有特异的合成寡聚核苷酸靶探针的裂解液加到微孔中；（2）孵育。此步骤可释放病毒核酸，降解RNA酶或使DNA变性, 然后靶探针结合到靶RNA或DNA并固定在固相板上；（3）冷却洗板；（4）加信号放大探针(bDNA)到各孔内；（5）孵育. 此步骤使bDNA杂交到靶探针的相应部位；（6）冷却洗板；（7）加标记探针到各孔内；（8）孵育，此步骤使酶标记的探针杂交到bDNA上；（9）冷却洗板；（10）加化学发光底物到各孔中；（11）孵育，此步骤让酶和底物相互作用，产生化学发光信号。发射的光强以相对光量值(RLUs)表示。产生的光强直接与各样品中病毒RNA或DNA的载量成正比。各样品中病毒核酸的含量由与样品一同处理的标准所制作的标准曲线计算获得。 4．4 实时（real-time）荧光定量PCR扩增 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 实时荧光定量PCR扩增的实验检测过程可分为：（1）样品制备,抽提和浓缩目标RNA分子，并除去可能存在的抑制因子。（2）Real-time PCR，检测PCR的产物使用荧光标记的寡核苷酸探针。检测的原理基于荧光信号增长曲线与循环数相关。（3）RT-PCR反应，病毒RNA利用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，然后通过DNA聚合酶对特定片段进行扩增。（4）扩增产物的检测，基于检测阈值的设定，当病毒载量高时，低循环数即能检测到荧光信号，当病毒载量低时，高循环数时才能检测到荧光。循环数与样品载量成线性关系。利用标准品制作循环数与载量的标准曲线就能对样品载量进行定量检测。 第五章 室内质量控制 内部质量控制是在良好实验室整体环境支持下，从样品接收到发出报告整个过程每个环节的管理过程，包括：（1）人员；（2）实验室分区和环境；（3）仪器；（4）检测过程（试剂、操作过程，质控品使用）；（5）数据。 5.1人员 HIV-1病毒载量检测人员分为检验人、复核人、签发人。 5.1.1 所有相关检验人员需经操作培训，能独立熟练地操作，并经考核合格，持证上岗。 5.1.2复核人、签发人应具备对检测过程进行分析、解决问题的能力。 5.2实验室分区和环境 5.2.1实验室分区的功能 HIV-1病毒载量检测实验室原则上应分为三个独立工作区：试剂准备区、样品处理区、扩增产物分析区，并设在不同房间。不同检测方法的分区功能和要求可有所不同。 5.2.1.1 试剂准备区：扩增试剂的配制、分装和保存； 5.2.1.2 样品处理区：样品登记、分装，核酸提取、保存和加样； 5.2.1.3 扩增产物分析区：产物扩增的测定、结果分析、登记及报告。 严格要求三区的空气流向：从试剂准备区到样品处理区，然后到扩增产物分析区，不能逆向流动。实验室的设置及辅助设备的具体要求参见第二章。 5.2.2 实验室环境的要求 5.2.2.1实验室有足够的空间； 5.2.2.2采光好，应避免阳光直射设备； 5.2.2.3室温控制在18~25℃； 5.2.2.4室内相对湿度控制在50~70%； 5.2.2.5电源稳定，HIV-1病毒载量检测仪应配备稳压电源； 5.2.2.6室内保持干净整洁，无灰尘。 5.2.2.7实验前后，用75%乙醇或0.1%次氯酸钠及时处理操作台面。 5.3 仪器设备质控 5.3.1加样器、温湿度计须经计量部门校准，每年一次。每季度期间核查一次。 5.3.2 HIV-1病毒载量检测仪、离心机可以委托公司校准，每年一次。 5.3.3冰箱、水浴箱用校准合格的温度计测量温度，并做好记录。 5.4检测过程质控 5.4.1试剂质控 5.4.1.1 所有试剂盒须严格按要求条件保存。 5.4.1.2试剂盒拆封时，要记录拆封时间，所有试剂严格控制在有效期内使用。 5.4.1.3使用经中国食品药品监督管理局注册的试剂。 5.4.2 实验用水：要求使用无DNA和RNA酶的水。 5.4.3 操作过程质控 严格执行仪器和试剂的标准操作程序（SOP），不得擅自修改。 5.4.4质控品的使用 每次实验需同时使用试剂盒内的质控品以及一个HIV-1 RNA为5000-15000拷贝/毫升的外部质控品。 5.4.4.1外部质控品的制备 按实际使用量的要求配制大样品量的血浆（推荐每次配置量可使用两年），用0.2μm滤膜过滤除菌，充分混匀。用无菌冻存管定量分装，标记，封口，冻存于-80℃以下非自动除霜冰箱内。 5.4.4.2外部质控品的定值 随机选出10管外部质控品，按照实验室的检测条件进行HIV-1病毒载量检测，将拷贝值换算成Log10值，计算算术平均值（m）和标准偏差（s）。 5.4.4.3质控图的绘制和使用 根据外部质控品的定值，绘制质控图。在质控图上显示所有10次质控品检测值的Log10值、平均值以及1.5s 值范围。每次检测都应带1个外部对照，将得到的外部对照Log10值标在质控图上，根据是否在1.5s 值范围判断实验结果是否有效，每次测得值在平均值±1.5S内方为有效。 使用新批次的外部对照质控品时，必须重新绘制质控图。 5.4.5 试剂盒质控品的使用 每次实验按照试剂盒说明书的要求使用试剂盒提供的质控品，并满足质控品的要求。 5.5 数据分析、结果报告 5.5.1 在试剂盒及外部质控品结果满足要求的前提下，对样品进行分析。 5.5.2 外部质控品不合格，样品需要重新检测。 5.5.3 结果超过检测上限的样品应稀释以后重新检测。 5.5.4 复核人对检测结果进行仔细复核并对结果提出结论、签字。 5.5.5 签发人对结果的结论进行审核、分析、总结、签字。 5.5.6 按不同方法的要求，以拷贝/毫升或国际单位/毫升为单位报告样品的HIV-1病毒载量值。 第六章 外部质量控制 HIV-1病毒载量检测的外部质量控制可以通过参加外部质量评价，提高实验结果的可比性，发现系统误差，改进实验室工作，提高检测质量。艾滋病参比实验室自2004年开始参加由美国国立卫生研究院（NIH）组织的HIV-1病毒载量检测考核工作，考核盘有5个样品组成，分别考核实验室检测的灵敏度、特异性、稳定性和准确性，通过将结果与国际上参与考核的所有实验室结果进行比对评估，给出综合评估结果。通过参加考核，保证艾滋病参比实验室的不同HIV-1病毒载量检测系统的有效性。 目前，艾滋病检测实验室通过参加艾滋病参比实验室组织的HIV-1病毒载量检测能力验证来实施外部质量控制。 6.1 HIV-1病毒载量检测能力验证（PT）的组织 艾滋病参比实验室为HIV-1病毒载量检测能力验证（PT）的组织者，负责制定国内HIV-1病毒载量检测能力验证的计划并组织实施。 建议国内所有从事HIV-1病毒载量检测的实验室参加该PT项目，在规定时间内使用有效试剂与实验样品一起检测，填写HIV-1病毒载量实验结果报告单（附表4-6），上报艾滋病参比实验室。 鼓励有条件的实验室参加国际组织的PT活动。 6.2 HIV-1病毒载量检测能力验证（PT）的实施 6.2.1 PT样品组成：每次5份。包括阴性、不同拷贝数的阳性样品。 6.2.2 PT频率：一年2次，分别为3月和9月。 6.2.3 PT样品的接收与保存：要求参加PT的实验室收到考核样品后，立即进行核对、检查，填写HIV-1病毒载量检测能力验证样品接收专用单（附表3），3天内将接收专用单传回艾滋病参比实验室。如发现考核样品缺失、量不足、空管等情况，及时书面回报，艾滋病参比实验室负责补寄或更换。收到样品后应及时检测或在-70度以下保存。 6.2.4 PT样品的检测：要求将考核样品同实验室常规样品一起检测，由常规检测人员进行，不应作为特殊样品处理。 6.2.5 PT结果的报告和处理：参加PT的实验室必须在规定的时间内（收到样品3个月内），用电子邮件报告实验结果，并将HIV-1病毒载量实验结果报告单（附表4-6）和打印的仪器原始记录一起上报给艾滋病参比实验室，后者将负责结果录入和处理。 评分原则：比n呢体要求参加考核装和保存。及抗病毒治疗 6.2.6评分原则：没有任何问题者为优秀；出现6.2.6.1中的一条为良好；出现至少6.2.6.1中的两条或至少6.2.6.2中的一条为不合格。 6.2.6.1次要问题：一个样品结果在±1.5~2.0S内；一个假阳性；一个无效结果；一个抄写错误。 6.2.6.2主要问题：两个样品结果超过±2.0S；两个及以上假阳性；两个及以上无效结果；两个及以上抄写错误。 6.2.7 评估结果反馈：艾滋病参比实验室根据各实验室的两次考核结果，每年反馈最后的评估结果。 6.2.8抱怨和申诉：参评实验室如对评估结果或其它方面存有异议，可以在收到结果后10天内向艾滋病参比实验室提出异议，后者在核实情况后予以答复。 6.2.9 现场督导：根据考核情况的需要，艾滋病参比实验室组成技术专家组对不合格实验室进行现场检查。检查内容包括：实验原始数据、实验室布局、仪器运行状况、辅助设备校准状况、实验耗材质量、样品保存、试剂盒使用状态、人员培训状况、质量保证和质量控制等。 第七章 实验室生物安全 7.1相关依据 《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《实验室生物安全通用要求》、《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样品运输管理规定》、《人间传染的高致病性病原微生物实验室和实验活动生物安全审批管理办法》和《全国艾滋病检测技术规范》。 7.2安全细则 7.2.1进入实验室应穿工作服、戴口罩、戴一次性乳胶手套。严禁在实验室内进食、饮水和吸烟以及使用化妆品。 7.2.2所有样品包括试剂盒中的人源性成份（如阴、阳性对照）都应在生物安全柜内进行处理。 7.2.3样品应盛装在有螺旋盖的管子中，以防样品溅出或产生交叉污染。当具有潜在传染性的物质溢出时，立即用0.1%次氯酸钠溶液或其它消毒剂处理污染区及器材；接触过标本的器材应置有专用消毒剂的容器，与一次性物品一起在丢弃前进行高压灭菌处理。 7.2.4避免试剂盒中各种有毒有害化学成分（如叠氮钠、二甲基亚砜、异硫氰酸胍）对人体或环境可能造成的危害。 7.3生物安全培训 7.3.1所有涉及HIV-1病毒载量检测的人员都应经过严格的技术培训，要掌握生物安全保障的原则、。每个人的安全教育均应记录在实验室和人事档案中。 7.3.2省级及以上疾控中心艾滋病实验室负责HIV/AIDS检测生物安全培训及HIV-1病毒载量检测培训。 7.3.3检测相关人员应主动接受实验室生物安全员以及安全负责人的监督。所有实验室意外事件均应进行记录和报告。 7.3.4所有人员要保护自身和环境的安全。 7.3.5参照实验室安全指南和标准操作程序的有关规定执行具体操作。 7.4职业暴露处理 7.4.1实验室应建立完善的艾滋病职业暴露后的预防机制。 7.4.2发生职业暴露后，首先进行应急处理，然后根据暴露级别和暴露源头严重程度，评估风险级别，并决定是否进行预防性用药和用药程序，如需要时，尽早开始服用抗病毒药物。 7.4.3按规定进行职业暴露登记、检测和报告，注意做好保密工作。 附表1 常见问题分析 （一）NASBA 问题 原因 处理方法 血清或血浆样品中有特殊物质 化冻缓慢引起的细胞裂解 离心至上清清亮 硅胶难以重新悬浮 样品中核酸水平太高 剧烈震荡混悬，由于洗涤/洗脱效率不高可影响敏感度。样品最多带有相当于106个细胞的DNA。 硅胶干燥不佳 丙酮剩余太多 用100-1000 μl枪头吸干净 干燥温度太低 干燥时间最多延长2分钟 检查加热模块的温度 加入硅胶的样品离心后难以溶解 硅胶孵育时间太长 (> 12 min) 增加震荡时间和强度 无效结果；信号太低 酶未完全溶解 保证酶稀释和使用前平衡至室温，充分溶解并在一小时内使用 磁珠未充分混匀或加入的量太少 每次加入前先震荡混匀，保证磁珠快速沉在管底 样品浓度太高 检查检测稀释液、样品及已稀释样品加入的量 扩增时温度偏差 调整加热温度，应该在41±0.5°C. （二）RT-PCR 问题 原因 处理方法 QS_无效 （QS_INVALID） QS稀释系列的A660数值未在检测的吸光度范围内。 该样品检测的结果无效。结果无效的样品应从样品和质控的制备开始重新进行逆转录、扩增和检测。 靶序列吸光度偏低 (TARGETOD LO) 所有HIV-1的稀释度的A660数值低于检测的线性范围。 报告结果根据所采取的标准的或极度敏感的提取方法可以是“HIV-1 RNA 没有检测到（HIV-1 RNA低于400拷贝/毫升）”或“HIV-1 RNA 没有检测到（低于50拷贝/毫升）”。 靶序列吸光度偏高 (TARGETOD HI) 所有HIV-1的稀释度的A660数值高于检测的线性范围。 报告结果形式为“不能确定”。（1）如果采用标准样品处理程序，用HIV阴性的人血浆稀释原始样品并用标准的样品处理程序重新检测。报告的结果应乘以稀释因子。（2）如果采用极度敏感的样品处理程序，稀释原始血浆样品，用标准的样品处理程序重新检测。报告的结果应乘以稀释因子。 结果偏低 （RESULT_LO） 计算的拷贝数低于测定下限。 对于标准的样品处理程序，结果可以报告为“检测到HIV-1 RNA, 含量低于400拷贝/毫升”。如果需要定量的结果，原始样品应该使用极度敏感的样品处理程序重新检测。对于极度敏感的样品处理程序，可以报告为“检测到HIV-1 RNA, 含量低于50拷贝/毫升”。 结果偏高 （RESULT_HI） 计算的拷贝数高于测定上限。 对于标准的样品处理程序，结果可以报告为“HIV-1 RNA含量高于7.5(105拷贝/毫升”。如果需要定量的结果，原始样品可以用HIV-1阴性的人血浆稀释并重新检测。报告的结果应乘以稀释因子。对于极度敏感的样品处理程序，重新检测。对于极度敏感的样品处理程序，结果可以报告为“HIV-1 RNA含量高于1.0(105拷贝/毫升”。如果需要定量的结果，稀释原始样品用标准的样品处理程序重新检测。 TARG_GANGE 所有靶模板的A660数值都不在线性测定范围之内。 可以报告为“未检出。”重新检测原始样品，重复样品和质控制备、逆转录、扩增和检测步骤。 OD_SEQUENCE 提示有不合乎稀释顺序的A660值出现。 重复整个实验步骤包括样品和质控的制备、扩增和检测。 QS_SEQUENCE 提示QS有不合乎稀释顺序的A660值出现。 重复整个实验步骤包括样品和质控的制备、扩增和检测。 （三）Easy Q 问题 原因 处理方法 分子信标没有检测 绝对信号水平太低 用洗脱液重新检测 Q值设定（）的大小不同于WT值设定（）的大小 内参照数据设定的大小不同于WT数据设定的大小 重新设定内参照数据 测定的曲线不连续 所测定曲线不连续性 用洗脱液重新检测 没有扩增 内参照和WT最大/最小信号的比值都低于阈值 用洗脱液或者样品再开始测 扩增弱 曲线斜率太低 用洗脱液重新检测 计算错误 曲线拟合程序产生错误 用洗脱液重新检测 不正确的扩增动力学 拟合曲线没有正确地描述所观察的数据 用洗脱液重新检测 延迟时间太短 起始荧光增加的速度太快 用洗脱液重新检测。确信加入酶和开始此轮运行之间的时间少于8分钟。 扩增弱 内参照值和WT值都没有达到一个平台值 用洗脱液重新检测 没有测到内参照。 没加内参照或者样品的加入水平太高 没有测到内参照的信号，可能是因为在核酸的分离物中没有加内参照或者WT的加入太高 用（稀释过的）样品重新检测 （四）bDNA 问题 原因 处理方法 注射器含有气泡 洗液瓶, 水瓶, 漂白液瓶是空的或管道连接松弛。 加适量的溶液在空瓶里；管路都在各自的瓶内液面下。 分析仪底部的加热托盘上有液体 管路连接松弛或一洗头的分液或吸液针管堵塞。 检查管路连接。 管路有堵塞或细菌滋生 管路和试剂瓶没有正确保养。 每次实验后清洗并晾干洗液瓶和水瓶，倒空废液瓶；每周清洗洗液瓶, 水瓶和废液瓶，管路系统。 分析仪不能从孔内吸取足够的液体 洗头中有堵塞, 洗头针头弯曲, 废液管连接松弛, 吸液泵损坏。 检查废液管连接头 RLU值低 试剂漏掉, 用错试剂, 某种试剂配制错误, 漂白液污染, 孵育时间或温度不正确, 或检测板冷却不足。 在实验前确定盛水试剂瓶已满。 确定按产品要求储存、配制试剂；环境温度在18-30℃；试剂盒没有过期；实验中所使用的试剂来自同一批次；每周清洗过程中在管道和试剂瓶中没有残留。 RLU值高 实验被污染, 清洗不充分, 或有光泄露。 确定全使用干净的一次性无菌实验材料；使用防气溶胶的加样枪头；残留的底物没有倒回原瓶；用70%乙醇定期擦洗微量加样器；盛洗液的试剂瓶内有足够量的洗液；检查分液、吸液操作；每周进行保养；分析仓门关闭严实；检查背景RLU值。 变异系数(CV)高 移液操作错误,样品质量差, 孔有污染, 清洗不充分, 试剂没有预热充分, 试剂没有充分混匀, 孔内样液蒸发, 孔内样液溅洒, 有光漏。 确定微量加样器经校准；使用防气溶胶的枪头；枪头紧密套在加样器上；加试剂时枪头位置在孔的中部；样品凝块或残渣没有被吸取；样品加的位置与样品ID和DMS规定的位置一致；样品按产品说明收集,处理和储存；只使用干净的一次性无菌实验材料；检查分液吸液操作；盛洗液的试剂瓶内已装有足够量的洗液；每种试剂在实验开始前被轻轻混匀；每种试剂预热充分,以防有沉淀；封闭垫组装正确；孔内样液没有溅洒；分析仓门关闭严实；检查RLU背景。 标准曲线平坦或不正常 加标准时板的缺口在右边,或标准加入顺序有误。 加标准时板的缺口在左边 强或弱对照定量高 强阳性对照受污染, 吸取误差, 或标准曲线有问题。 确定各孔仔细加样, 未触及邻孔；使用无菌枪头；封闭垫组装无误；加样器定期校准；使用防气溶胶的枪头；标准和对照加样位置正确；按产品说明要求储存, 配制。 强或弱对照定量低 对照降解, 对照溅洒, 对照孔液蒸发, 对照加样有误, 或对照没有充分混匀。 确定试剂盒在运输和到货后储存在正确的温度；使用无菌枪头；没有吸取气泡；封闭垫组装无误；加样器经校准；小心处理测试板,防止溅洒；标准和对照加样位置正确；按产品说明要求储存, 配制；样品,标准,对照在吸取前至少震荡5秒。 附表2 HIV-1病毒载量检测样品送检/接收单 送检单位 送检日期 接收单位 接收时间 采样时间 采样管抗凝剂 样品保存温度 样品运输条件 姓 名 性 别 年龄 职业 国籍或民族 户籍所在地 既往病史 使用药物 抗HIV病毒药物 样品编号 样品性质 样品量（ml） 备 注 送样人 接收人 附表3 HIV-1病毒载量检测能力验证样品接收专用单 实验室名称 接收日期 收到样品量 编号 体积（ul） 样品状态 外包装是否完整 是 否 冰块是否融化 是 否 样品是否融化 是 否 计划检测日期 检测方法 接收样品后存放温度 4℃ -20℃ -80℃ 其它 接收人 实验室 负责人 填表日期： 附表4 HIV-1病毒载量检测报告单 送检单位 姓 名 性 别 年 龄 国籍或民族 职 业 户籍所在地 送检日期 送 检 样 品 编 号 HIV-1病 毒 载 量 （copies/ml） 检测人 签发人 报告日期 年 月 日 复核人 检测单位或实验室（公章） 备注 1、检测方法： 2、检测限： 附表5 HIV-1病毒载量能力验证结果专用报告单（NASBA) 病毒载量实验结果报告单（NASBA) 样品准备试剂批号 　 扩增日期 　　 试验方法: BioMerieux NucliSens 扩增试剂盒批号 　 检测日期 　　 RNA 血清盘NARL-VQA： 检测试剂盒批号 　 病毒载量试验质控试剂批号 　　 血清盘样品号 提取日期 加样量(uL) 有效或无效 Qa Qb Qc 样品 重复 拷贝量 信号值 拷贝量 信号值 拷贝量 信号值 信号值 拷贝量 是/否 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 附表6 HIV-1病毒载量能力验证结果专用报告单（RT-PCR) 病毒载量实验结果报告单(RT-PCR) 试剂盒批号 　 试剂盒版本 　 试验类型: 标准的罗氏检测器检测 内对照拷贝量 　 内对照试剂批号 　 RNA 血清盘NARL-VQA： 扩增日期 　 　 对照试剂范围 (低) 　 对照试剂（低）批号 　 　 　 对照试剂范围（高) 　 对照试剂（高）批号 　 病毒载量试验质控范围 　 病毒载量试验质控试剂批号 　 血清盘号 提取日期 加样量 (uL) 样品不同稀释度对应OD值 内对照不同稀释度对应OD值 样品拷贝量 是否重复 　 　 　 1 9 81 729 1 9 对照 ** 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 对照（阴） 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 对照（低阳） 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 对照（高阳） 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 参考文献 1. 《全国艾滋病检测技术规范》，中国疾病预防控制中心， 2004。 2. 《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测质量控制指南》，中国疾病预防控制中心，2006。 3. 郑家齐等，医学检验质量控制，人民卫生出版社，1998。 4. Virology mannul,1997. http://www.niaid.nih.gov/daids/vir_manual/full_vir_manual.pdf. 5. Guidelines for the Use of Antiretroviral HIV-Infected Adults and Adolescents， MMWR Recommendations and Reports，April 24, 1998/47(RR-5); 42-82. 6. Susan J. Best, Anthony P. Gust, Elizabeth I. M. Johnson, et al. Quality of human immunodeficiency virus viral load testing in Australia. JCM, 2000, 38(11):4015-020. 7. 《病原微生物实验室生物安全管理条例》，国务院第424号令，2004年11月12日起实施。 8. 《实验室生物安全通用要求》GB 19498-2004,2004年10月1日起实施。 9. 《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样品运输管理规定》，卫生部第45号令，2006年2月1日起实施。 10. 《人间传染的高致病性病原微生物实验室和实验活动生物安全审批管理办法》，卫生部第50号令，2006年8月15日起实施。 11. Guidelines for HIV Diagnosis and Monitoring of Antiretroviral Therapy,2005, WHO. 12. HIV-1病毒载量稳定性实验，艾滋病参比实验室内部实验数据（

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待发表）。 13. 试剂盒说明书:Roche Amplicor RT-PCR, NucliSens Easy Q HIV-1, bDNA 340。 缩略语 HIV 人类免疫缺陷病毒 AIDS 获得性免疫缺陷综合征 ART 抗病毒治疗 PCR 聚合酶链反应 RT 逆转录 bDNA 分枝DNA信号放大系统 NASBA 核酸序列扩增系统 VL 病毒载量 PT 能力验证 PBMC外周血单个核细胞 VQA 病毒载量质量保证 洗 手 池 紫外灯 超净工作台加样器 漩涡振荡器 冰箱-20，4℃ 实验台 紫外灯 水浴箱 冰箱-80，-20℃ 离心机 生物安全柜 � 加样器 紫外灯 洗 手 池 水浴箱 冰箱-20，4℃ 离心机 病毒载量仪,加样器 PAGE 10