细菌代谢产物中小分子有机酸的高效毛细管电泳分析

262 广东药学院学报 JournalofGuangdongPharmaceuticalCollegeJun．2009。25(3) 细菌代谢产物中小分子有机酸的高效 毛细管电泳分析 胡耀华，钟文彬，周林，黄树林 (广东药学院生物科学及生物制药学院，广东广州510006) 摘要：目的建立高效毛细管电泳法测定甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸的分析方法，测定细菌代谢产物中 的小分子有机酸。方法采用毛细管：Beckmancoulter未涂层50I．Lm×60cm(有效长度50cm)；缓冲溶 液：pHlO．5的10mmol／L(含0．5mmoL／LCTAB)的硼砂溶液；检测波长214nm，分离电压一20kV，进样 压力为1．0psi，进样时间为10S。结果4min内甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸得到基线分离。线性范围 分别为：甲酸3．8—30．7ms／L(r=0．9971)；乙酸3．3～52．5mg／L(r=0．9961)；丙酸3．1～49．5mg／L (r=0．9993)；丁酸3—48mg／L(r=O．9925)；乳酸7．5—60．5mg／L(r=0．9995)。平均回收率分别 为：甲酸99．29％(RSD=0．67％)；乙酸98．90％(RSD=1．36％)；丙酸99．65％(RSD=0．65％)；丁酸 99．35％(RSD=0．42％)；乳酸98．06％(RSD=1．44％)。结论该方法简单、快速、准确，可用于细菌发 酵液中代谢产物有机酸的检测。 关键词：细菌代谢产物；小分子有机酸；高效毛细管电泳 中图分类号：Q786文献标识码：A文章编号：1006—8783(2009)03—0262一04 Detectionoftheorganicacidsinbacterialmetabolitesbyhigh-performancecapillary electrophoresis HUYao—hua，ZHONGWen—bin，ZHOULin，HUANGShu。ling (GuangdongPharmaceuticalCollege，Guangzhou，Guangdong510006，China) Abstract：ObjectiveToestablishamethodfordeterminingformicacid，aceticacid，pmpionicacid，butyric acidandlacticacidinbacterialmetabolitesbythehish—performancecapillaryelectrophoresis．Methods SampleswereanalyzedonaBeckmanCoulter(50Ixm×50cm)uncoatedfused—silicacapillaryusing10 mmoL／Lboratebuffer(pH10．5，containing0．5mmol／LCTAB)．TheUVdetectionwavelengthWigs214 am．theseparationvoltage一20I【Vandinjectionpressure1．0psi×10s．ResultsStandardsamplesof formicacid，aceticacid，pmpionicacid，butyricacidandlacticacidwereseparatedwellin4minutes，and theirlinearrangeswere3．8—30．7ms／L(r=0．9971)，3．3—52．5mg／L(r=0．9961)，3．1—49．5 nc／L(r=0．9993)，3．0-48．0mg／L(r=0．9925)，7．5—60．5mg／L(r=0．9995)，respectively，their averagerecoverieswere99．29％，98．90％，99．65％，99．35％and98．06％，respectively．TheRSDvalues (n=6)offormicacid，aceticacid，propionicacid，butyricacidandlacticacidwere0．67％，1．36％， 0．65％，0．42％，1．44％，respectively．Conclusion11lemethod"issimple，rapidandaccuratefordetecting theorganicacidsinbacterialmetabolitesinfermentationliquor． Keywords：metabolicproduct；organicacid；hiish—performancecapillaryelectrophoresis 收稿日期：2009—05—07；修回日期：2009—06—03 基金项目：广东省科技项目(2006813501001)；教育部财政部2007年度人才培养模式创新实验区 建设项目 作者简介：胡耀华(1980一)，男，硕士，助教，从事环境微生物研究，Email：yaohuahu225@yahoo．tom．cn； 通讯作者：黄树林，男，硕士，教授，从事分子生物学研究，Email：shulhuang@sina．com．en 万方数据 第3期 胡耀华，等．细菌代谢产物中小分子有机酸的高效毛细管电泳分析 263 代谢流量是细胞生理学的一个基本决定因素， 也是代谢途径中最晕要的参数。对细菌进行代谢流 量分析，特别是代谢产物中小分子有机酸的分析，有 助于通过基因工程手段定向地、有目的地改变限制 细胞代谢的关键途径，以更好地理解和利用细胞代 谢进行化学转化、能量转导和活性产物表达⋯。在 发酵过程中，产酸发酵细菌能将有机物转化为以脂 肪酸和醇为主的末端产物，同时生成新的细胞物质。 产酸发酵速率较快，末端产物主要有甲酸、乙酸、丙 酸、丁酸、戊酸、己酸、乳酸等脂肪酸以及醇类(乙醇 等)、二氧化碳、氢气、氨、氮气等旧J。通过分析这些 发酵末端产物可以了解细菌的代谢途径，而代谢通 量的分析可以使所需要的一些关键操作单元协调运 行，从而达到副产物最小而产率最优的目的∞J。 毛细管电泳(CE)是一类以毛细管为分离通 道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析 技术，具有效率高、分离检测样本的速度快、所需要 的样本和试剂少、检测的模式多且可以和其他技术 联用、试剂易得廉价、能够实现自动化的优点，越来 越广泛地被用于有机酸的分析HJ。影响有机酸分 离的主要因素有：缓冲溶液的种类、缓冲溶液的pH 值、电渗流改性剂和添加剂、分离电压等。本研究建 立了CE法(区带电泳分离模式)测定小分子有机酸 的方法，并对缓冲溶液的种类、pH值以及添加剂等 对电泳分离条件进行了研究，从而为研究细菌的代 谢途径提供技术手段。 1材料与方法 1．1仪器和试剂 高效毛细管电泳仪：BeckmanCoulterP／ACE MDQ毛细管电泳系统(32KaratTUSoftwarever5．0) ，毛细管为BeckmanCoulter未涂层50肛m×60cm (有效长度50cm)。甲酸、乙酸(Sigma公司，色谱 纯)，丙酸、丁酸、乳酸(Sigma公司，分析纯)，四硼酸 钠、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(广州市化学试 剂厂，分析纯)。所有溶液均用超纯水配制和稀释， 样品和缓冲液经0．22¨m滤膜过滤后进样。 1．2方法 1．2．1毛细管电泳环境的平衡每次进样前毛细 管先用水洗3min，再用0．1mol／L的NaOH溶液冲 洗3min，水洗3min，然后再用缓冲液冲洗5min。 每次更换试样时均用缓冲液清洗5～10min，所需时 间以基线平稳为准。 1．2．2检测波长的选择以190～250nm为检测 波长，检测各种有机酸和运行缓冲液的紫外吸收特 性，选择各有机酸吸光度相对较大、而缓冲液吸光度 相对较小的波长为检测波长。 1．2．3缓冲液浓度的选择采用214nm检测波 长，分离电压一20kV，进样压力为1．0psi，进样时 间为10s，在pH值为10．5的情况下，10～25 mmol／L的硼砂缓冲体系。 1．2．4缓冲液pH的选择分别以pH9．0、pH 9．5、pH10．0、pH10．5、pH11．0的缓冲溶液进行分 离，各有机酸分别进样，以缓冲液pH值对各有机酸 的保留时间作图。 1．2．5分离电压的选择分别以10、15、20、25kV 为分离电压进行分离，各有机酸分别进样，以分离电 压对各有机酸的保留时间作图。 1．2．6分离温度的选择分别以15、20、25、30、35℃ 为分离温度进行分离，各有机酸分别进样，以分离柱 温对各有机酸的保留时间作图。 1．2．7各种有机酸标准样品的定性和定量将各 种单一有机酸液依次进样，各自保留时间。以 上述优化结果为实验条件，5种不同浓度有机酸从 低浓度至高浓度依次进样，计算各自的峰面积(每 个样品平均进样3次)，以有机酸浓度对峰面积作 图，建立标准曲线。 1．2．8有机酸混合样品的分析配制不同浓度的 有机酸标准混合液进行定量分析，积分计算峰面积， 比较计算值与实际值的误差，得出样品回收率和检 测精确度，论证分析方法的准确性和重复性¨J。 2结果 2．1发酵液中小分子有机酸的紫外吸收特性 大多数有机酸在200nm以上无吸收或吸收很 小，用间接紫外检测时其背景电解质吸收要求尽可 能低。缓冲溶液中硼砂的紫外吸收较低，因此试验 了硼砂溶液的紫外吸收特性。图l、图2分别为各 种有机酸标准样品和背景电解质硼砂的紫外吸收光 谱。结果表明：当波长小于220nm时，大多数有机 酸都有紫外吸收；当波长小于210nm时，背景电解 质的紫外吸收增加很快，影响有机酸的测定。综合 考虑，选择214nm作为检测波长，在该检测波长处 常见有机酸都有比较理想的吸收值。 2．2 电渗流改性剂对分离的影响 有机酸阴离子的电泳方向与电渗方向相反，通 常加入阳离子表面活性剂使电渗反向，从而与有机 酸阴离子的电泳方向一致，以缩短分析时间。因此 万方数据 264 广东药学院学报 第25卷 本实验在缓冲液中加入0．5mmoL／L的CTAB作为 电渗流改性剂。实验发现，在未加CTAB之前，5种 有机酸在20min内才能得到分离，加入CTAB后时 间缩短到5min。 图1有机酸的紫外吸收光谱(从左到右依次为乳酸、丁酸、 丙酸、乙酸、甲酸) Figure1 UVabsorptionspectraoftheorganicacids 1．5 1．0 吨 0．5 O 190 210 230 250 A／nm 图2硼砂缓冲液的紫外吸收光谱 Figure2 UVabsorptionspectraoftheboratebuffer 2．3最佳反应体系的建立 2．3．1缓冲液浓度的选择在大多数情况下，随着 缓冲液浓度的增加，离子强度增加，电渗流速度降 低，溶质在毛细管内的迁移速率下降，迁移时间延 长。而且随着缓冲液浓度的增加，导电的离子数增 加，在相同的电场强度下毛细管的电流值增大，焦耳 热增加。实验考察了不同浓度的硼砂对分析物的影 响，分离结果见图3。结果表明，当硼砂浓度从10 mmol／L增加到20mmoL／L时，保留时间呈上升趋 势；当浓度大于20mmol／L时，保留时间有所下降； 在20mmol／L时，保留时间最长。为保证体系的稳 定性，节约分离时间，提高检测灵敏度，选择lO mmol／L为硼砂缓冲液的最佳浓度。 6 5 ．量 {4 3 2 酸 酸 酸 酸 酸 e／(mmol·L-1) 图3硼砂浓度对保留时间的影响 Figure3 Effectofbufferconcentrationontheretentiontime 2．3．2缓冲液pH值的选择缓冲溶液pH值的调 节与控制是优化分离的重要因素。有机酸为弱酸， 其pKa值大多在2～6之间。分析物的电离度依赖 于电解质溶液pH值的变化，电离度的不同引起电 泳淌度和电渗流淌度的差异，进而影响分离效率和 电泳迁移行为。由于在酸性介质中有机酸易被毛细 管壁吸附，因而通常在碱性环境下实现分离。本研 究选择pH9．0一11．0进行实验，分离结果见图4。 从图可见，当pH为10．5时，5种有机酸均可完全分 离；随着pH的增大，分离度进一步得到改善，但同 时使分离时间延长。综合考虑分离度、分离时间和 灵敏度，选定硼砂缓冲液的最佳pH为10．5。 5 3 一甲酸 一乙酸 一丙酸 一丁酸 一乳酸 pH 图4缓冲液pH值对保留时间的影响 Figure4 EffectofpHofboratebufferontheretentiontime 2．3．3分离电压的选择电压是控制柱效、分离度 和分析时间的重要因素。分离电压的变化会引起电 场强度的改变，进而影响组分的分离。本研究分别 考察了电压在10～25kV范围内的分离效果，结果 见图5。结果表明，随着电压的增大，柱效提高，因 而有机酸的分析时间缩短。但过高的电压会产生较 大的焦耳热，导致区带展宽，峰面积下降，从而影响 分离效率和分离度。综合比较不同电压下的分离图 谱，发现在20kV条件下各种有机酸均得到良好的 分离而且保留时间适合，峰形也最好。 7 口5 { - 3 l 删kV 酸 酸 酸 酸 酸 图5分离电压对保留时间的影响 Figure5 Effectofvoltageontheretentiontime 2．3．4分离柱温的选择柱温对电解质溶液的黏 度、谱带扩展、离子淌度等有直接的影响。柱温试验 发现：15～35℃区间的不同柱温下分离时间变化不 大，但对各种有机酸的分离度有较大影响。在柱温 万方数据 第3期 胡耀华，等．细菌代谢产物中小分子有机酸的高效毛细管电泳分析 265 为30℃时，各种有机酸的分离都能较好满足工作需 要，因此选择30℃作为实验柱温。 2．3．5最佳反应体系综合以上各个优化条件，最 终选用的毛细管分析体系为：214nm为检测波长， 10mmol／L(含0．5mmol／LCTAB)的硼砂作为缓冲 溶液，pH值为10．5，分离电压为一20kV，进样压力 为1．0psi，进样时间为10s。 2．4各种有机酸标准样品的定性与定量 将各种单一有机酸液依次进样，记录各自的保 留时间：甲酸为2．68min，乙酸为3．02min，丙酸为 3．13min，丁酸为3．25min，乳酸为3．47min。 以上述优化结果为实验条件，5种不同浓度有 机酸从低浓度至高浓度依次进样，计算各自的峰面 积(同一批次每个样品平均进样3次取平均值，系 列实验重复6次)，以有机酸浓度为横坐标、峰面积 为纵坐标作图，建立标准曲线，计算相关系数并建立 回归方程，见表l。从表1中的线性回归方程可知， 在实验样品的浓度范围内，各种有机酸的线性关系 良好，用该种方法定量准确度可以得到保证。 2．5有机酸混合样品的分析 配制有机酸标准品混合液，根据已确定的各项 实验参数进行分析，电泳分析图谱见图6。通过积 分计算峰面积，再返回标准曲线对照，得出各种有机 酸的含量及样品回收率和检测精密度，见表2。 表1有机酸工作曲线的特征参数 Table1 Characteristicparametersoftllestandardcurveoffive organicacids 表2有机酸标准品混合液中各有机酸的含量及回收率 Table2 Contentsoforganicacidsinthemixturesolution 0· a ≤ §0． 1 j 《O． 0 l 2 3 4 5 tlmin 图6有机酸标准品混合液电泳分析图谱 Figure6 Electrophoretogramofstandardmixturesolutionof thefiveorganicacids 3讨论 毛细管电泳自问世以来，主要用于药品、氨基 酸、核酸等物质的分离检测。从本文结果可见，在利 用毛细管电泳进行分离分析时，缓冲液的种类、浓 度、pH值和分离电压、柱温都对分离有重要的影响。 适量电渗流改性剂CTAB的加入明显增进电迁移速 率，缩短分离的时间。缓冲液的pH值对分离的影 响最大，pH值不仅影响色谱峰的形状和有机酸样品 的保留时间，更重要的是，不适合的pH条件根本不 能使各有机酸得到分离。分离电压的提高主要是影 响到有机酸的保留时间，同时如果过高电压导致产 生的焦耳热也会影响峰形。实验表明所建立的方法 简单、快速、准确、重复性好，适用于发酵过程中代谢 产物的监控及发酵过程工艺参数的优化。 参考文献： [1]STEPHANOPOULOSGN，ARISllDOUAA，NIELSENJ， 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