ab草菌丝体与冬虫夏草有效成分的TLCS分析

I誊萄囡图雷曩!Q塑垒塑!!墨坚型!塑!Q垡型型塑!!型 泰山虫草菌丝体与冬虫夏草有效成分的TLCS。 赵雪梅，毕研平，苏延友，王桂玲，费洪荣 (泰山医学院药学院，山东泰安，271016) 摘要 以腺苷、尿苷、次黄嘌呤核苷、虫草素及次黄曝呤为指标，测定泰山虫草茵丝体与天然冬虫夏草中相应 成分的含量，探索泰山虫草代替天然冬虫夏草开发药物或保健食品的可能性。采用80％乙醇超声提取，在 GF254硅胶板上点样后，以薄层色谱扫描法(TLCS)测定上述各种成分的含量。首次证明泰山虫草菌丝体核苷 类及次黄嘌呤等有效成分含量明显高于冬虫夏草。其腺苷、尿苷、次黄嘌呤核苷、次黄嘌呤含量分另4是冬虫夏草 的8．25倍、3．76倍、11．8倍和1．55倍。2种虫草中有效成分的含量均现为尿苷>次黄嘌呤核苷>腺苷>次 黄嘌呤>虫革素。说明泰山虫草可以作为冬虫夏草代用品进行综合开发利用。TLcs法筒捷快速，重现性、稳 定性良好，能有效地对虫草中的有效成分进行定性定量分析。 关键词泰山虫草菌丝体，尿苷，腺苷，次黄嘌呤核苷，次黄嘌呤，虫草素 冬虫夏草(Cordyf已夕ssi，z跏sis(Berk)．sace)是一 种寄生于昆虫体上的真菌与其寄主昆虫形成的虫菌 复合体，以四川产量最大。至今已知虫草属共137 种，供药用的尚有蝉花菌(CordycP夕s5D60Zi^r口 (Hill)Berk．etBr)、蛹草菌(Cmizi￡口r话(L．)“nk)、 亚香棒(c．k硼惫口siiGray)和凉山虫草 (C．zi口729s^口以P，zsisZhang，Liuethu)等[11。其主要 生物活性成分包括D一甘露醇、多糖、核苷类(包括虫 草素)、多种微量元素和维生素。传统中医认为，虫草 味甘性平，可补肾益肺，止血化痰，与人参、鹿茸并称 “三大补药”。现代药理学研究表明，虫草具有扩张支 气管、控制心跳、镇静催眠、雄性激素样等作用，还具 有抗癌、抑菌和提高机体免疫功能等作用[2]。天然的 冬虫夏草有严格的寄生性和特殊的生长地理环境，因 而产量有限，且不能人工培养，再加上人为的滥采，使 得虫草资源日益匮乏，因此积极寻找其代用品变得越 来越紧迫。泰山虫草生长在海拔1500m的泰山上， 生态环境的不同，使其各成分在含量上势必存在一定 的差异。虫草是一种复型真菌，由有性型(子实体)与 无性型(茵丝体)组成。菌丝体是产生活性物质的基 础，开发利用菌丝体作为药物和保健食品是虫草资源 开发的重要途径。 近些年来，采用薄层扫描法测定虫草中有效成分 的含量的研究已有报道。于振成等最先采用双波长 反射法锯齿扫描测定了金水保胶囊中腺苷的含量嘲； 第一作者：博士。 *泰安市科技攻关项目(20071029)资助，泰山医学院博士启动 基金资助 收稿日期：2007—11—30，改回日期：2008一01一07 2008VoI．34NO．3(TotaI243) 随后，吕武清‘‘。、高道侠等‘53采用薄层扫描法分别测 定了金水保胶囊中腺嘌呤和鸟苷的含量；米莉莉等采 用TLCS对不同产地天然虫草及不同厂家人工菌粉 (丝)共14个样品中的核苷类成分如腺苷、尿苷、鸟苷 进行了含量测定[引，本研究通过采用双波长薄层扫描 法，首次对泰山虫草菌丝体和冬虫夏草的有效成分如 腺苷、尿苷、次黄嘌呤核苷、虫草素及次黄嘌呤做定性 定量研究，以便为泰山虫草作为冬虫夏草代用品及泰 山虫草的进一步综合开发提供理论依据。 1 仪器与试剂 1．1仪器 DESAGA—CD60薄层扫描仪及配套定量点样 毛细管(1／2／5“L)及分析软件(德国DESAGA公 司)；分析天平(奥豪斯公司AR2140，1／1000)；离心 机(常州国华电器有限公司)；高压蒸汽灭菌锅(上海 申安医疗器械厂LDZX一40BI型)；超净工作台(苏 州安泰空气技术有限公司SW—CJ一2F型)；恒温摇 床(太仓市实验设备厂DHZ—DA型)；超声清洗器 (昆山市超声仪器有限公司KQ一250DB型)；恒温干 燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司202—2AB型)。 1．2试剂 样品：冬虫夏草(青海玉树产)；泰山虫草菌丝体 摇瓶发酵制得(菌株由泰山医学院药学院苏延友教授 提供)。对照品：腺苷、尿苷、虫草素(天津一方科技有 限公司)；次黄嘌呤核苷(上海伯奥生物科技有限公 司，生化试剂，批号：030208)；次黄嘌呤(Lancaster公 司，批号10061487)。其它试剂：葡萄糖(分析纯，天 津市百世化工有限公司)；蛋白胨(分析纯，天津市凯 万方数据 通化学试剂有限公司)；KH。PO。(分析纯，天津市巴 斯夫化工有限公司)；无水乙醇(分析纯，天津市凯通 化学试剂有限公司)；乙酸乙酯(分析纯，天津市博迪 化工有限公司)；甲醇(分析纯，天津市纵横兴贸有限 公司化工试剂分公司)；氨水(25％～28％，淄博化学 试剂厂)；异丙醇(山东省化学研究所)；三氯甲烷(分 析纯，天津市永大化学试剂开发中心)；GF254硅胶 预制板200mm×70mm(上海信宜仪器厂)。 ‘ 2 方法与结果 2．1泰山虫草菌丝体的制备 采用正交表L。(34)对菌丝体液体发酵培养基进 行优化，得到优化后的培养基：玉米粉3％，黄豆粉 1％，葡萄糖1％，酵母膏o．8％，127℃，1．5Mpa，灭菌 20min，冷却后接种，以发酵2d的液体发酵液为母 种，250mL锥形瓶装量100mL，接种量5％，发酵7 d，离心(5ooOr／min，5min)得菌丝体，菌丝体以100 mL蒸馏水冲洗，重复3次，50℃烘干备用。 2．2 泰山虫草菌丝体供试品溶液的制备 将2．1项下所得干燥泰山虫草菌丝体粉碎后过 60目筛，精密称取菌丝体粉末o．5077g，置具塞试管 中，加入80％乙醇5mL，45℃浸泡O．5h，超声提取 1h(45℃，超声功率100％)，4ooor／min离心10 min，取上清液移入5mL量瓶中，用80％乙醇定容至 刻度，混匀备用。 2．3冬虫夏草供试品溶液的制备 取完整冬虫夏草个体(包括虫体和真菌子座)数 个于50℃烘干24h，取出研碎后过60目筛得菌粉。 精密称取菌粉1．0267g，置具塞试管中，加入80％乙 醇10mL，45℃浸泡0．5h，超声提取1h(45℃，超声功 率100％)，4000r／min离心10min，取上清液减压 浓缩至约2mL转移至5mL量瓶中，并用80％乙醇 洗涤2次，洗涤液一并移人量瓶，再用80％乙醇定容 至刻度，混匀备用。 2．4对照品溶液的制备 精密称取对照品腺苷6．5mg、次黄嘌呤核苷7．9 mg，次黄嘌呤5．2mg，分别置于25mL量瓶中；精密 称取尿苷4．2-mg，置于10mL量瓶中；虫草素4．1 mg，置于50mL量瓶中，分别用70％乙醇溶解，并定 容至刻度，混匀备用。 2．5薄层色谱条件 GF254硅胶板先在105℃活化30min，以定量毛 细管每隔1cm点样，展开剂组成为三氯甲烷一甲醇一 乙酸乙酯一异丙醇一浓氨水(8：3：3：3：O．9)，展开 约7．5cm，取出薄层板吹干残留溶剂，在紫外灯箱内 254nm下观察荧光淬灭色谱图象后，描出欲测斑点 轮廓，用薄层扫描仪在254nm处扫描积分，狭缝宽 度：8．0mm，狭缝高度：核苷类O．1mm，次黄嘌呤 o．2mm。以Rf值定性，以峰高h定量。 2．6精密度试验 称取干燥菌粉样品1份，按2．2项下泰山虫草菌 丝体供试品溶液的制备方法，制得供试品溶液，于同 一薄层板上点样5个点，每个点2“L，按2．5方法进 行扫描，以腺苷斑点峰高为对象进行统计RSD= 1．4％，其它数据及结果见表1。 表1精密度试验(以腺苷峰高计) 2．7 重现性试验 取干燥菌粉样品，分别称取5份，每份0．5g，按 得供试品溶液，均点样于同一块薄层板上，按2．5测 定方法对腺苷斑点进行扫描积分，记录各峰峰高进行 2．2项下泰山虫草菌丝体供试品溶液的制备方法，制 统计，RSD一2．6％，其它数据及结果见表2。 表2重现性试验(以腺苷峰高计) 2．8稳定性试验 对腺苷斑点在不同时间进行扫描，将峰高记录结果进 以人工泰山虫草菌丝体为测定对象，按测定方法 行统计，RSD=2．1％，其它数据及结果见表3。 表3稳定性试验(以腺苷峰高计) 垫塑堡蔓丝堂蔓i塑f星蔓!箜塑!1127 万方数据 2．9回收率试验 O．75mg，制备低、中、高供试品溶液，将峰高记录结 分别精密称定泰山虫草菌丝体o．5g(以腺苷为 果进行统计，平均回收率97．5％，RSD=2．7％，其它 检测指标)3份，分别加入腺苷标准样品0．25、0．5、数据及结果见表4。 裹4回收率试验(以腺苷峰高计) 2．10泰山虫草菌丝体及冬虫夏草中有效成分含量 的测定 分别用定量毛细管精密吸取腺苷、尿苷、次黄嘌 呤核苷、次黄嘌呤和虫草素对照品溶液1弘L、2肛L、3 弘L、4弘L、5pL，泰山虫草菌丝体及冬虫夏草提取液 适量(见表5)，从左至右依次点于同一块薄层板上， 放入层析缸中饱和30min后上行展开，薄层扫描后 记录各峰峰高，以峰高一对照品含量作标准曲线进行 定量。各成分的标准曲线、线性范围及含量测定结果 见表5。 表5冬虫夏草与泰山虫草菌丝体核苷类成分含量测定结果 由表5可见，泰山虫草菌丝体中腺苷、尿苷、次黄 嘌呤核苷、次黄嘌呤和虫草素含量分别是冬虫夏草的 8．21倍、3．75倍、11．7倍、5．7倍和1倍。2种虫草 中3种核苷的含量均表现为尿苷>次黄嘌呤核苷> 腺苷。 3 讨论与结论 3．1扫描波长的选择 根据文献报道，虫草中核苷类成分的检测波长， 除254nm[73外，还有260nm[8J、265nm[9。、270 nm[6]，通过对样品进行全波长扫描，可知其最大吸收 峰在254nm处，所以实验中采用254nm的检测波 长。 3．2提取溶剂的选择 文献中关于对核苷类成分的提取方法报道不一， 主要是以不同浓度的乙醇提取‘“7．9]，本试验通过对 70％、80％乙醇提取进行对比，发现后者提取效率明 显高于前者，故采用80％乙醇进行提取，但最优提取 条件还有待进一步研究。 2008VoI．34No．3(Total243) 3．3测定方法的选择 薄层扫描(TLCS)法具有快速、经济可靠、操作 简单、分离效果较好、时间较短等优点，是一种重要的 分析分离手段与方法，除低沸点物质外，各种无机和 有机化合物都可进行分离；它既可以用于少量物质的 分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备，因此， 被广泛应用于石油、化工、医药卫生、生物科学、环境 科学、农业科学等领域，尤其对中药材中复杂天然产 物的组分分离及定性、定量分析可提供丰富直观的色 谱图谱，同时完成多个样品的薄层色谱图比较，反映 各中药的相似程度，为鉴别真伪提供最直接的指纹信 息，《中国药典》2000年版一部采用薄层色谱法作鉴 别的品种已达602种，占一部中已收载中药材、中药 成方制剂的60．7％，是目前成分分析方面首选的技 术之一。本实验采用TLCS法检测泰山虫草菌丝体 及冬虫夏草中有效成分的含量，为深入研究泰山虫草 菌丝体的指纹图谱和药用价值提供有用的数据参考。 通过本研究首次证明泰山虫草菌丝体中核苷类 等有效成分含量明显高于冬虫夏草，由于核苷类成分 万方数据 是虫草的主要有效成分之一，且药典中多以腺苷含量 来控制虫草质量m]，另外还具有培养条件易控制等 优点，因此泰山虫草菌丝体可以作为冬虫夏草代用 品，开发利用潜力更大。 参考文献 1郑汉臣，蔡少青．药用植物与生药学(第四版)[M]．北京： 人民卫生出版社，2003 2赵余庆，于明，陈立君，等．冬虫夏草属真菌化学研究概 况[J]．中草药，1999，30(12)：950～953 3于振成，赵仁庚．薄层扫描法测定金水保胶囊中腺苷含量 [J]．中国药学杂志，1995，30(6)：380 4吕武清，颜华荣．胶囊中腺嘌呤的含量[J]．药物分析杂志， 1996，16(3)：197～198 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personiceXtractiveof80％ethanol，measuredbyTLC—scanninginordertodeterminethecontentsofthese fivecomponentsResultsThecontentsoftheseeffectivecomponentsintheculturedTais^口咒∞rdycP户smyce— liawerefoundhigherthanthatofnaturalCDrdycP夕豇Theadenosine，uridine，inosine，andhypoxanthine fromculturedTais^口竹∞rdycP夕smyceliaare8．25times，3．76times，11．8timesand1．55timesasthenatural (、0，．dyce夕s．Thecontentsoftheseeffectivecomponentsinthetwosamplesareuridine二>inosine>adenosine ：>hypoxanthine：>cordycepin．Thismethodisconvenientandrapid，itcaneffectivelyevaluatenucleotides andsomeothercomponentsinnaturalandculturedC10rdycP夕s．This^口雄cordyfP户scansubstitutethenatural CD，．dyfPp5andmanufacturingapplicationshouldbefurtherexplored． Keywords了、口is|}l口ncDrdycP户icⅣ【ycelia，uridine，adenosine，inosine，hypoxanthine，cordycepin l≯j孰ii謦 I巧 互 陟政7答 陟摹。≥ 螭绿萘国际标准援术撬标原碾妒获得通迪 侈汝荔 l；i苎《 从在杭州举行的国际标准化组织(Iso)茶叶标准化技术委员会第22届年会上获悉，倍受关注的“绿茶国际标准技 p糅i 隆蓑荔术指标原则”已经获得通过。 l荔棼罄蹴荔 来自中国、英国、德国、日本、印度等国家和地区的50多位茶叶专家及代表出席了会议，并对有关茶叶国际标准进 I行讨论和表决。其中，倍受关注的“绿茶国际标准技术指标原则”获得通过。会议还决定建立特种茶国际标准工作组，秘书处设 I在中国，并由中国负责筹建。 l 杭州是中国绿茶的主要产茶区，拥有西湖龙井茶等历史悠久、驰名中外的茶叶品牌。本次会议也是国际标准化组织在杭州 I召开的第三次国际茶叶标准化会议。 l 本次会议由国际标准化组织农产品食品技术委员会茶叶分技术委员会(Is0／Tc34／sc8)主办，中国国家标准化管理委员 I会承办，中华全国供销合作总社、中国茶叶流通协会协办，浙江省质量技术监督局、杭州茶叶研究院、浙江省茶叶集团公司等单 l位提供支持。 至塑堡蔓丝查蔓i塑(璺蔓丝塑!1129 万方数据 泰山虫草菌丝体与冬虫夏草有效成分的TLCS分析 作者： 赵雪梅， 毕研平， 苏延友， 王桂玲， 费洪荣， Zhao Xuemei， Bi Yanping， Su Yanyou， Wang Guiling， Fei Hongrong 作者单位： 泰山医学院药学院,山东,泰安,271016 刊名： 食品与发酵工业 英文刊名： FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES 年，卷(期)： 2008，34(3) 引用次数： 0次 参考文献(10条) 1.郑汉臣.蔡少青 药用植物与生药学X 2003 2.赵余庆.于明.陈立君.高越文.高志 冬虫夏草属真菌化学研究概况[期刊]-中草药 1999(12) 3.于振成.赵仁庚 薄层扫描法测定金水保胶囊中腺苷含量 1995(6) 4.吕武清.颜华荣 胶囊中腺嘌呤的含量 1996(3) 5.高道侠.许敏 薄层扫描法测定金水宝胶囊中鸟苷的含量[期刊论文]-江西中医学院学报 1998(3) 6.米莉莉.张素文.孙家进.王智华.洪筱坤 冬虫夏草及人工虫草核苷类成分的TLCS研究[期刊论文]-中成药 2003(5) 7.李绍平.李萍.季晖.董婷霞.詹华强 毛细管电泳法测定冬虫夏草中核苷类的含量[期刊论文]-药物分析杂志 2001(2) 8.袁永生.张莉.许效枫.周玉新.魏璐雪 反相高效液相法测定虫草菌粉中核苷类成分的含量[期刊论文]-中国药学杂 志 2002(10) 9.丁振成.赵仁庚 薄层扫描法测定金水宝胶囊中腺苷含量 1995(6) 10.李绍平.李萍.季晖.朱荃.董婷霞.詹华强 天然与发酵培养冬虫夏草中核苷类成分的含量及其变化[期刊论文]-中 国药学(英文版) 2001(4) 相似文献(0条) 本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_spyfx200803030.aspx 下载时间：2010年3月8日