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目的基因导入受体细胞

2010-05-13 50页 ppt 5MB 45阅读

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目的基因导入受体细胞null第五章 目的基因导入受体细胞第五章 目的基因导入受体细胞5.1 受体细胞5.1 受体细胞受体细胞(receptor cell) 又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等,从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞;从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。null作为基因工程的宿主细胞必须具备以下特性: 便于重组DNA分子的导入; 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中; 便于重组体的筛选; 遗传性稳定高,易于扩大培养或发酵生长; 安全性高,无致病性,不会对外界环境造成生物污染; 有利于外源基因...
目的基因导入受体细胞
null第五章 目的基因导入受体细胞第五章 目的基因导入受体细胞5.1 受体细胞5.1 受体细胞受体细胞(receptor cell) 又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等,从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞;从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。null作为基因工程的宿主细胞必须具备以下特性: 便于重组DNA分子的导入; 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中; 便于重组体的筛选; 遗传性稳定高,易于扩大培养或发酵生长; 安全性高,无致病性,不会对外界环境造成生物污染; 有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累,或促进外源基因的高效分泌表达。 在遗传密码的应用上无明显偏倚性; 具有较好的翻译后加工机制,便于真核目的基因的高效表达; 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。null基因工程中常用的受体细胞类型: 原核生物细胞 真核生物细胞 真菌细胞 植物细胞 动物细胞 原核生物细胞原核生物细胞优点: 大部分原核生物细胞无纤维素组成的坚硬细胞壁,便于外源DNA的进入。 没有核膜,染色体DNA没有固定结合的蛋白质,为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 原核生物多为单细胞生物,容易获得一致性的实验材料,并且培养简单,繁殖迅速,实验周期短,重复实验快。 基因组小,遗传背景简单,并且不含线粒体和叶绿体基因组,便于对引入的外源基因进行遗传分析。null缺点: 原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统,即使真核生物基因能得到表达,得到的多是无特异性空间结构的多肽链。 原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统,而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。 原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白,造成表达产物不稳定。null至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。 一、大肠杆菌受体细胞 大肠杆菌属革兰氏阴性菌,它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一,也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。 优点:繁殖迅速、培养简便,代谢易于控制。 缺点:大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素,可导致人体热原反应。 null二、枯草杆菌受体细胞 枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌,是一类革兰氏阳性菌。 优点: 枯草杆菌具有胞外酶分泌-调节基因,能将具有表达的产物高效分泌到培养基中,大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等,而且在大多数情况下,真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。 枯草杆菌不产生内毒素,无致病性,是一种安全的基因工程菌。 枯草杆菌具有芽孢形成的能力,易于保存和培养。 枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。 应用:已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。null三、蓝细菌(蓝藻) 蓝藻——又称蓝绿藻或蓝细菌,它含有叶绿素a(缺乏叶绿素b)和藻胆素,具有光合系统Ⅰ (PS Ⅰ) 和光合系统Ⅱ (PS Ⅱ)、能进行光合作用,但它又具有细菌的特征,无细胞核及双层膜结构的细胞器,染色体裸露,是一种典型的原核生物。 蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点,具体表现在: 基因组为原核型,除了裸露的染色体DNA外,不含叶绿体DNA和线粒体DNA,遗传背景简单,便于基因操作和外源DNA的检测。 细胞壁属G-,主要由肽聚糖组成,便于外源DNA的转化。 营光合自养生长,培养条件简单,只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。 多种蓝藻含内源质粒,为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。 蓝藻富含蛋白质,并且多数蓝藻无毒,早已用作食物或保健品,在此基础上采用转基因技术,把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻,就可达到锦上添花的效果。真核生物细胞真核生物细胞一、真菌受体细胞 真菌是低等的真核生物,其基因结构、表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都具有真核生物的特征,因此利用真菌细胞表达高等动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优点。 酵母菌细胞 是单细胞真核微生物,外源真核基因最理想的表达系统。 优点: 酵母菌是结构最为简单的真核生物之一,其基因表达调控机理比较清楚,遗传操作相对比较简单。 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。 不含有特异性病毒,不产生毒素。 培养简单,利于大规模发酵生产,成本低廉。 能使外源基因表达产物分泌至培养基中,便于产物的提取和加工。null二、植物受体细胞 优点:全能性,即一个分离的活细胞在合适的培养条件下,较容易再分化成植株,这意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。 缺点:植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁,不利于摄取重组DNA分子。 现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、玉米、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。 null三、动物受体细胞: 优点: 能识别和除去外源真核基因中的内含子,剪切和加工成熟的mRNA。 真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰,产物具有较好的蛋白质免疫原性,约为酵母细胞的16~20倍。 易被重组DNA质粒转染,具有遗传稳定性和可重复性。 经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中,便于提纯和加工,成本低。 缺点:组织培养技术要求高,难度较大。 目前用作基因转移的受体动物主要有猪,羊、牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物,主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等。 常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、Hele细胞、猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等。以动物细胞,尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞的优点。 5.2 重组DNA分子转入原核生物细胞5.2 重组DNA分子转入原核生物细胞5.2.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 转化:重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞,并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。 转化现象最早是由Griffith于1928年在肺炎双球菌中发现的。 null目 录null细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片段,即转化因子,并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中,从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。 以革兰氏阳性细菌为例,细菌转化的一种可能机制包括如下基本步骤:以革兰氏阳性细菌为例,细菌转化的一种可能机制包括如下基本步骤:①细菌感受态的形成。当转化因子接近细菌细胞时.受体细胞分泌一种小分子质量的激活蛋白,又称为感受因子,能诱导使细菌胞壁部分溶解,局部暴露出细胞膜上的DNA结合蛋白和核酸酶等,此时细菌细胞处于感受态,极易接纳周围环境中转化因子以实现转化。 null②转化因子的吸收。受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构持异性结合,然后激活邻近的核酸酶,将双链DNA分子中的一条链逐步降解,同时将另一条链逐步转移到受体菌内。 null③整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链DNA与另一种游离的蛋白因子结合,形成整合复合物前体,它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解,并将其引导至受体菌染色体DNA处。 null ④单链DNA转化因子的整合。整合复合物前体中的单链DNA片段可以通过同源重组,置换受体细胞染色体DNA的同源区域.形成异源杂合双链DNA结构。 null⑤转化子的形成。受体菌染色体组进行复制,杂合区段亦随之进行半保留复制,当细胞分裂后,该染色体发生分离,形成一个新的转化子。null大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌,自然条件下很难进行转化,其主要原因是转化因子的吸收较为困难。在基因工程研究和应用中,转化受体菌细胞的正是根据人们需要构建的外源重组质粒DNA分子,而非来自供体菌的游离DNA片段(转化因子)。 因此在大肠杆菌的转化实验中,很少采取自然转化的方法,通常的做法是首先采用人工的方法制备感受态细胞,然后进行转化处理,其中代表性的方法之一是Ca2+诱导的大肠杆菌转化法。(1) Ca2+诱导的大肠杆菌转化法(1) Ca2+诱导的大肠杆菌转化法Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化的可能原因: ①在0℃的Cacl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀,同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构,促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态。 ②Ca2+能与加入的DNA分子结合,形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物,并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时,细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞的通道。 nullnull该法重复性好。操作简便快捷,适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化,每μg质粒DNA可以获得5×106~2×l07个转化茵落,完全可以满足质粒的常规克隆的需要。 nullMg2+对DNA分子有很大的稳定性作用,因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞,可以提高DNA的转化效率。如利用二甲基亚砜(DMSO)和二硫苏糖醇(DDT)等进一步处理细胞,能诱导高频感受态细胞的形成,转化效率可提高100~1000倍,且对大小质粒分子均可进行有效的转化。 但该法要求条件高,对外界污染物极为敏感,通常很少采用。 DNA分子进入大肠杆菌受体细胞的机制 DNA分子进入大肠杆菌受体细胞的机制 一般认为只有双链闭环或开环的质粒DNA分子才能转化,而线形DNA分子不能获得转化子。因此,环状DNA分子中混杂线形DNA分子,会影响环状DNA分子的转化效率。 也有人认为吸附在受体细胞表面上的是双链DNA,但却以单链DNA进入细胞,这与革兰氏阳性菌的转化过程相似。null转化处理过程中,可能感染杂菌,导致假阳性转化子的出现,因此须设以下几种对照处理: DNA对照处理。转化处理液中用0.2ml无菌水代替0.2m1感受态细胞,检验DNA溶液是否染菌。 感受态细胞对照处理。转化处理液中用0.1mlNTE缓冲液代替0.1m1DNA溶液,检验感受态细胞是否染菌。 感受态细胞有效性对照处理。在0.2ml感受态细胞中加入0.1ml已知容易转化这种感受态细胞的质粒DNA。 (2)电穿孔转化法(2)电穿孔转化法基本原理:利用高压电脉冲作用,在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔(electro poration).形成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA的有效吸收。 电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响,通过优化这些参数,每ugDNA可以得到109-1010转化子。 研究表明,当电场强度和脉冲时间的组合方式导致50%~70%细菌死亡时,转化水平达到最高。 null用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制备容易得多.当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心,然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度,并用10%甘油重悬细胞,使其细胞浓度为3×l010个/m1。分装,在干冰上速冻后置于-70℃贮存。这样,每小份细胞融解后即可用于转化,有效期达6个月以上。 电穿孔转化须在低温下(0-4℃)进行,转化效率要比在室温下操作提高约100倍。 (3)三亲本杂交接合转化大肠杆菌(3)三亲本杂交接合转化大肠杆菌简称为三亲本杂交转移法,是基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种DNA转化方式.适用于那些难以采用Ca2+诱导转化法或电穿孔法转化的受体菌。 非接合型质粒分子较小,缺少编码质粒转移体系所须的全部基因,不能象接合型质粒那样在宿主细胞间自我转移。但如果在宿主细胞中存在另外一种溶合性的接合型质粒(即辅助质粒),非接合型质粒通常也会被转移,这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程称为迁移作用。 null接合型质粒分子较大,自我转移的随意性强,转移过程中经常伴随着宿主细胞染色体的高频转移,因此难以作为基因工程载体使用。目前常用的质粒载体多是在非接合型质粒或缺失了接合转移基因的接合型质粒的基础上构建的,故重组质粒DNA分子也不能直接接进行接合转化.而只能通过其迁移作用来完成。 null首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中,然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合,促使两者发生接合转化作用,将重组质粒导入受体细胞。 整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株,即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌,因此称为三亲本杂交接合转化法。null(4)转化率的计算及其影响因素 (4)转化率的计算及其影响因素 转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率,有两种表示方式: 一是以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示; 二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。 用每单位质量的DNA分子获得的转化子数来表示,难以反映分子大小与转化率之间的关系。 null以用于转化处理的受体细胞数为基数来计算转化率,首先必须通过菌液OD值测定或细菌计数,计算出用于制备感受态细胞的受体菌总数。然后计算转化子与受体菌的比率。 影响转化率的因素影响转化率的因素分子质量较小的重组质粒DNA分子转化率较高,分子质量较大的重组质粒DNA分子转化率较低,对于大于30kb的重组质粒则很难进行转化。 组成重组DNA分子的载体类型及其构型。与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体,而处于自然双螺旋闭环结构的质粒载体比开环结构成线性结构的质粒载体有更高的转化率。经体外酶切、酶连操作后的载体DNA或重组DNA分子由于空间构象难以恢复,转化率一般要比具有超螺旋结构的质粒低两个数量级。 重组DNA分子的浓度和纯度。在10ng/100u1以下的DNA浓度范围内,转化效率与DNA分子数成正比关系。 null同一重组质粒DNA分子转化不同的受体菌细胞,转化率不同——受体细胞的选择对于重组DNA分子的转化也是极为重要。 前述三种转化方法中,最佳转化率以电穿孔法最高(108~1010);Ca2+诱导转化法居中(107~108);而三亲本杂交转移法最低(104~105),但它适于前两种方法难以转化的受体菌。 null在转化操作方而,受体细胞的预处理或感受态细胞的制备对转化率影响最大。 如Ca2+诱导大肠杆菌转化法,菌龄、Cacl2处理时间、感受态细胞的保存期以及热激时间均是重要的影响因素。 电穿孔转化法中,对受体细胞进行冰冻甘油预处理后的转化率,要比不经此预处理的转化率高10~100倍。 5.2.2 重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 5.2.2 重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 将重组λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程,称为转染。 将重组λ噬菌体DNA分子导入大肠杆菌受体细胞的常规方法是转导操作。 转导(transduction)是指通过λ噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。 null具有感染能力的λ噬菌体颗粒除含有λ噬菌体DNA分子外,还包括外被蛋白。 以噬菌体颗粒感染受体细胞,首先必须对重组A噬菌体DNA分子进行体外包装 。 体外包装,是指在体外模拟λ噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程,将重组λ噬菌体DNA分子包装为成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒的技术。 null基本原理,根据λ噬菌体DNA体内包装的途径,分别获得缺失D包装蛋白的λ噬菌体突变株和缺失E包装蛋白的λ噬菌体突变株。这两种突变株均不能单独地包装λ噬菌体DNA,但将它们分别感染大肠杆菌,从中提取缺失D蛋白的包装物(含E蛋白)和缺失E蛋白的包装物(含D蛋白),两者混合后就能包装λ噬菌体DNA。 λ噬菌体DNA体外包装的主要过程λ噬菌体DNA体外包装的主要过程①制备包装物。 首先,须培养两种溶原菌 第二,诱导溶菌生长 第三,收集和贮存包装物。 ②体外包装。 制备λ噬菌体DNA混合液。 第一次包装。包装物刚融化时,细胞发生破裂,释放出包装物可立即用于包装。 第二次包装。进行第二次包装,可提高包装效率2-5倍,加入蛋白酶可降低包装反应液的黏度,便于包装反应的进行。 去除细胞屑。第二次包装后,在反应液中加入SM溶液和氯仿,混匀后离心去除碎屑。上清液中含活的噬菌体颗粒。null经过体外包装的噬菌体颗粒可以感染适当的受体菌细胞,并将重组λ噬菌体DNA分子高效导入细胞中。 在良好的体外包装反应条件下,每μg野生型的λ噬菌体DNA可形成108~109的pfu。对于重组的λ噬菌体DNA,包装后的成斑率要比野生型的有所下降,但仍可达到106~107pfu,完全可以满足构建真核基因组基因文库的要求。5.2.3 受体细胞的选择 5.2.3 受体细胞的选择 野生型的大肠杆菌不是理想的受体细胞,因为自身具有的限制和修饰系统,另外还可能存在潜在的致病性。因此必须通过适当的诱变手段对野生型大肠杆菌进行遗传性状改造,以获得适宜作为受体细胞的突变菌株。通常应从以下几个方面加以考虑:①限制与修饰系统①限制与修饰系统这是导致外源重组DNA转化或转导效率低下的主要原因之一。 应选用限制系统缺陷型的突变菌株作为受体细胞,以提高外源DNA分子的转化或转导效率。 进一步使修饰系统也发生缺陷,则受体菌细胞既不能修饰,也不能限制外源DNA分子,更便于重组DNA分子的多种基因操作。 ②重组系统 ②重组系统 进入野生型细胞的外源DNA分子能自发地与染色体DNA发生的体内同源重组反应由rec基因家族的编码产物所控制。RecA蛋白能促进DNA分子之间的同源联会和DNA单链交换,recA基因的突变使大肠杆菌细胞内的遗传重组频率降低至10-6。 recB、recC和recD基因的突变也可以降低遗传重组的发生频率。 因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型,基因型为recA-、recB-或recC-等,有些大肠杆菌突变体菌株则将三个基因同时失活。 ③易于转化或转导③易于转化或转导可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁的通透性及细胞膜的特异吸附性,从而提高其转化效率。还可以选择能够诱导形成感受态细胞的菌株作为受体菌细胞.④有明显的选择性差异④有明显的选择性差异遗传表型差异大,可便于重组子的检测。通常是使受体细胞呈现与载体所携带的选择标记互补的遗传性状。 如在大肠杆菌系统中,重组质粒载体上多含有AMP抗性标记基因,则所选用的受体细胞应对这种抗生素敏感。当重组DNA分子转入受体细胞后,载体上的标记基因赋予受体细胞抗生素的抗性特征,据此可以区分转化子与非转化子。 如果受体细胞具有与外源基因表达产物活性互补的遗传特征.可以直接筛选到外源基因表达的转化细胞。 ⑤感染寄生缺陷型⑤感染寄生缺陷型从安全的角度上考虑,受体细胞不能具有感染寄生性。 5.2.4 重组DNA分子转入真核细胞 5.2.4 重组DNA分子转入真核细胞 5.2.4.1重组DNA分子导入植物细胞 (1)农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 农杆菌是一类土壤习居菌,革兰氏染色呈阴性,能感染双子叶植物和裸子植物,对绝大多数单子叶植物无侵染能力。 具有趋化性的农杆菌移向这类植物受伤细胞,并将其Ti质粒上的T-DNA的转移至细胞内部。根据这一性质,将待转移的目的基因组入Ti质粒载体,通过农杆菌介导进入植物细胞,与染色体DNA整合,得以稳定维持或表达。 null用于植物基因转化操作的受体通常称为外植体。选择适宜的外植体是成功进行遗传转化的首要条件,而外植体的选择主要是依据受体细胞的转化能力来决定的。 目前作为基因转化的外植体材料非常广泛,涉及到植物的各个组织、器官和部位。 选择合适的转化外植体选择合适的转化外植体①优先考虑叶片、子叶、胚轴等作为外植体材料。 ②要注意外植体的年龄,应选择转化能力较强的幼期外植体,同时还要考虑其最佳感受态时期。 ③转化外植体易于组织培养,并有较强的再生能力。 ④应考虑外植体中易被转化的分生组织感受态细胞所在的部位及其数量。切割外植体时应尽可能地暴露分生组织细胞,增加农杆茵与分生组织的接种面积。 农杆菌接种操作 农杆菌接种操作 外植体的农杆菌接种就是把农杆菌接种到外植体的损伤切面。通常采用较低的菌液OD值和较短的浸泡时间来进行外植体的接种。 将接种农杆菌后的外植体培养在诱导愈伤组织或不定芽固体分化培养基上,随着外植体的细胞分裂和生长,农杆菌在外植体切口面也进行着增殖生长,故该培养过程称之为农杆菌与外植体的共培养。 由于农杆菌的附着侵染、T-DNA的转移及整合都是在共培养时期内完成,因此共培养技术条件的掌握是整个转化的关键环节。其中共培养时间对转化率有着很大影响, null与农杆菌共培养后的外植体表面及浅层组织中常常共生有大量农杆菌,对外植体的正常生长会产生不利影响,必须进行脱菌培养以杀死和抑制农杆菌的生长。 脱菌培养是指把共培养后的外植体转移到含有抗生素的培养基上继续培养生长的过程。目前使用最多的是头孢霉素。 最后,还须将外植体转移至筛选培养基上继续培养,筛选出被转化的细胞,经再分化培养成再生植株。 null针对不同的外植体以及不同的转化目的而建立多种转化方法,主要包括叶盘转化法、植株接种共转化法、植物愈伤组织共培养转化法、植物悬浮细胞共培养转化法和原生质体共培养转化法等。null②整体植株接种转化法:人为地在整体植株上造成创伤部位,然后把农杆菌接种在创伤表面,或用针头把农杆菌注射到植株体内、使农杆菌按照天然的感染过程在植株体内进行侵染,获得转化的植物愈伤组织或转基因植株。null③原生质体共培养转化法即取含重组Ti质粒的农杆菌同刚刚再生出新细胞壁的原生质体作短暂的共培养,促使农杆菌与植物细胞之间发生遗传物质的转化。用此方法已成功地实现了植物细胞的体外转化。 ④悬浮细胞共培养转化法。此方法类似于原生质体共培养转化法,主要差别是首先建立悬浮细胞系。 (2)DNA的直接转移 (2)DNA的直接转移 DNA的直接转移是指利用植物细胞的生物学特件、通过物理化学的方法将外源基因转入受体植物细胞的技术。 为克服农杆菌介导法的宿主局限性,巳发展了电击法(电穿孔法)、基因枪法(微弹轰击法)、激光微束穿孔法、显微注射法、脂质体介导法,多聚物介导法、花粉管通导法等DNA直接转移技术。 ①多聚物介导法①多聚物介导法聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等是常用的协助基因转移的多聚物,尤以PEG应用最广。这些多聚物和二价阳离子(如Mg2+、Ca2+、Mn2+)与DNA混合,能在原生质体表面形成沉淀颗粒,通过原生质体的内否噬作用而被吸收进入细胞内。 null聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等都是细胞融合剂。它们可以使细胞膜之间或使DNA与膜形成分子桥,促使相互间的接触和粘连。还可以引起膜表面电荷的紊乱,干扰细胞间的识别,从而有利于细胞膜间的融合和外源DNA进入原生质体。 本法中线性DNA比环形DNA有更高的转化效率,而单链DNA又比双链DNA更为有效。这与质粒DNA分子对大肠杆菌细胞的转化完全相反。 ②电穿孔转化法②电穿孔转化法细胞膜的基本成分是磷脂双分子层,在适当的外加电压作用下,细胞膜有可能被击穿,但不会导致细胞致命的伤害,当移去外加电压后,被击穿的膜孔可被修复。 ③激光微束穿孔转化法③激光微束穿孔转化法此方法是利用直径很小,能量很高的激光微束能引起细胞膜可逆性穿孔的原理,在荧光显微镜下找出合适的细胞,然后用激光光源替代荧光光源,聚焦后发出激光微束脉冲,造成膜穿孔,处于细胞周围的外源DNA分子随之进入细胞。 这种利用激光微束照射受体细胞实现外源DNA直接导入、整合和表达的技术称之为激光微束穿孔转化法。 激光微束穿孔转化法的优点:操作简便快捷;基因转移效率高;无宿主限制,可适用于各种动植物细胞、组织、器官的转化操作,并且由于激光微束直径小于细胞器,可对线粒体和叶绿体等细胞器进行基因操作。 但该法需要昂贵的仪器设备;技术条件要求高;稳定性和安全性等都不如电穿孔法和基因枪法。 ④显微注射法④显微注射法利用显微注射仪,通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。 这一技术的关键是原生质体或具壁细胞或细胞团的固定。由于动物细胞具有独特的贴壁生长待性,因此不存在固定细胞的问题,这为动物细胞的显微注射创造了十分有利条件,也是动物细胞能广泛使用该技术的原因之一。 但是,对植物细胞而言,首先必须建立固定细胞技术,然后才能进行定位显微注射操作。 ⑤超声波介导转化法⑤超声波介导转化法利用低音强脉冲超声波的物理作用,可逆性地击穿细胞膜并形成过膜通道,使外源DNA进入细胞。 利用超声波处理可以避免脉冲高电压对细胞的损伤作用,有利于原生质体存话,是一种有潜力的转化途径。 ⑥基因枪法⑥基因枪法又称微弹轰击法,是利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞内的现象,将包裹在金属颗粒(钨或金颗粒)表面的外源DNA分子随之带入细胞进行表达的基因转化方法。 ⑦脂质体介导法⑦脂质体介导法脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构,可以将DNA包在其内,并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬过程,把外源DNA转运到细胞内。 优点是包在脂质体内的DNA可免受细胞DNA酶降解。 ⑧花粉管通道法⑧花粉管通道法将外源DNA涂于授粉的枝头上,使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊,转化还不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。 这一方法技术简单,一般易于掌握,且能避免体细胞变异等问题,故有一定的应用前景。5.2.4.2 重组DNA分子导入哺乳动物细胞 5.2.4.2 重组DNA分子导入哺乳动物细胞 null病毒种类多样及病毒DNA或RNA构建的载体性质的各异,所以转导的过程各不相同,主要有三种类型: 一,带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞,目的基因随同病毒DNA分子整合到受体细胞染色体DNA上,这样以后不需要再包装成病毒颗粒。 二,带有目的基因的毒病是缺陷性的,须同另一辅助病毒一起感染受体细胞.在受体细胞内包装成新的病毒颗粒。 三,虽然带目的基因的SV40病毒是早期转录缺陷型的,但被感染的COS细胞系的基因组中整合有SV40早期转录区段DNA,所以没有必要用辅助病毒作混合感染。 ①病毒颗粒转导法②磷酸钙转染法②磷酸钙转染法其依据是哺乳动物细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物,使DNA转入细胞。 DNA磷酸钙共沉淀复合物中DNA的数量、共沉淀物与细胞接触的保温时间、以及DMSO和甘油等促进因子作用的持续时间均会影响DNA的转染效率。 ③DEAE-葡聚糖转染法③DEAE-葡聚糖转染法二乙胺乙基葡聚糖(DEAE)是一种高分子质量的多聚阳离子试剂,能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA,实现短时间的有效表达。 目前有关DEAE-葡聚糖的作用机制一般认为DEAE-葡聚糖能与外源DNA形成复合物,保护DNA免受核酸酶的降解;其次是DEAE-葡聚糖可作用于受体细胞膜,增加其通透性,便于DNA进入。 此方法简单、重复性高,并且转染效率高于磷酸钙法。 ④聚阳离子-DMSO转染法④聚阳离子-DMSO转染法采用聚阳离子poly-brene处理哺乳动物细胞,增加细胞表面对DNA的吸附能力、然后再用25%-30%DMSO短暂处理细胞,增加膜的通透性,提高对DNA的捕获量。 ⑤显微注射转基因技术⑤显微注射转基因技术应用显微注射器可以把重组DNA直接注入哺乳动物细胞。 用此方法转基因的效率很高。获得稳定转化子的数量取决于注射的DNA的性质。 ⑥电穿孔DNA转移技术⑥电穿孔DNA转移技术原理同植物的电穿孔转移DNA法。 在电脉冲处理之前,先用乙酰甲基秋水仙碱预处理细胞10h,可提高转化效率3-10倍。这很可能是由于预处理导致中期停顿的细胞中,细胞核处于无膜状态,或者核膜具有较高的通透性所致。 ⑦脂质体介导法⑦脂质体介导法利用脂质体介导法将外源DNA导入哺乳动物细胞具有实用潜力。 由于脂质体具有无毒、无免疫原性的特点,不仅可用于体外受体细胞的基因转化,而且可以在动物体内将基因转入肝细胞、血管内皮细胞等靶细胞或靶组织、靶器官位点,实现瞬间表达或稳定表达,成为基因治疗的一种有效工具。5.3 重组子的筛选5.3 重组子的筛选5.3 克隆子的筛选 概念 克隆子 转化子 重组子null将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称为克隆子。 把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化子(导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子 ),现在这两者有通用的趋向。 含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子,如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子 。 在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中,一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选出期待的克隆子。 经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后,获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。 5.3.1遗传表型直接筛选法5.3.1遗传表型直接筛选法5.3.1.1 根据载体选择标记初步筛选转化子 在构建基因工程载体系统时,通常在载体DNA分子中组装了一种或两种选择标记基因,在受体细胞内进行表达,呈现出特殊的表型或遗传学特性,作为筛选转化子的依据。 一般的做法是将转化处理后的受体细胞接种在合适量选择药物的培养基上,在最适生长温度条件下培养一定时间,根据菌落生长情况挑选出转化子。 常用的选择标记基因主要是抗性基因以及表达产物可以发光或使反应底物显色的基因,相应的选择条件是可以被抗性基因产物分解的抗生素和除草剂,可以使基因产物发光的光线,或者是可以使基因产物显色的试剂。 选择培养基是根据宿主细胞类型配置的培养基,对于细菌受体细胞而言,通常用LB培养基,在LB培养基中加入适量的某种选择物.即为选择培养基。选择物是由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定。null(1)抗药性筛选nullnullnull(2)插入失活筛选法(2)插入失活筛选法nullnull(3)插入表达筛选法(3)插入表达筛选法利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛选标记基因的表达,由此进行转化子的筛选。 有些载体在设计时,在筛选标记基因前面连接上一段负调控序列,当插入失活该负调控序列时,其下游的筛选标记基因才能表达。 例如pTR262质粒载体,它由pBR322衍生而来,其Tcr基因的上游含有一段λ噬菌体DNA的CI阻遏蛋白编码基因及其调控序列,CI基因表达的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因的表达。当外源DNA片段插入CI基因的Hin dⅢ或Bgl Ⅰ位点上时,CI基因失活.Tcr基因因阻碍解除而得以表达,故阳性重组子为Tcr表型.而质粒本身为Tcs表型,当转化细菌涂布在Tc平板上时,只有含有外源DNA插入片段的阳性重组子的转化菌才能生长成菌落。 (4)显色互补筛选法(4)显色互补筛选法nullnulllacZ 基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补,这种互补现象称为α-互补。 具有完整乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶(Z)、IPTG和X-gal时,产生兰色沉淀物,使菌落成为蓝色。如果在载体DNA上组入β-半乳糖苷酶基因(lacZ)部分缺失的片段(lacZ’).则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌落,会在含有X-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。nulllac Z’是β-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段,含lac Z’的重组载体转化lac Z’互补型菌株,可转译β-半乳糖苷酶,在含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基-β-硫代半乳糖苷)的培养基上使转化子成为蓝色菌落,而lac Z’互补型菌株本身为白色菌落。当lac Z’区插入外源基因后,再转化lac Z’互补型菌株,由于不能翻译β-半乳糖苷酶,转化子即使在含有X-gal和IPTG的培养基上也只能长成白色菌落。这样可以区分含外源基因和不含外源基因的转化子。 此方法主要用于原核生物。null α 互补的检测 nullnull以显色剂x-gal作为选择物时,DNA对照组不应出现任何菌落,感受态细胞对照组长出的菌落应全是蓝色的,感受态细胞有效性对照组长出的菌落中应有白色的,其中一项不符,就有可能挑出假的转化子菌落。 (5)利用报告基因筛选植物转化细胞(5)利用报告基因筛选植物转化细胞报告基因:系指其编码产物能够被快速地测定,常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞(器官或组织)并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。 在植物转基因研究中,在有选择压力的情况下,可利用报告基因在受体细胞内的表达,从大量非转化克隆中选择出转化细胞;同时,报告基因可以和某些目的基因构成嵌合基因,从报告基因的表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序列。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他持殊产物的基因等。 null①新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素,成为筛选动植物转化子的选择标记基因。 ②潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)赋予转化子能抗潮霉素,作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。潮霉素是致癌物质,操作时应慎重。 ③氯霉素乙酰转移酶基因(cat)也被用于筛选动植物转化子的标记基因。 ④β-葡萄糖酸酶基因(gus)④β-葡萄糖酸酶基因(gus)gus的基因产物β-葡萄糖酸酶(GUS)能够催化4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸,产生荧光物质4-甲基伞形花酮,以此筛选含gus基因的转化子。 由于植物细胞GUS本底非常低,因此广泛地应用于筛选植物转化子。 尤其是gus基因的3’端与其他结构基因连接产生的嵌合基因仍能正常表达,产生的融合蛋白中仍有GUS活性,可用于外源基因在转化生物体中的定位分析。⑤萤火虫荧光素酶基因(luc)⑤萤火虫荧光素酶基因(luc)luc表达产物萤火虫荧光素酶(LUC)在Mg2+的作用下,可以与荧光素和ATP底物发生反应,形成与酶结合的腺苷酸荧光素酰化复合物,经过氧化脱羧作用后,该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素,可以用荧光测定仪快速灵敏地检测出产生的荧光,是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因。 Luc基因检测十分迅速,灵敏度高,成本低,不存在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造成的危害,也没有内源荧光产牛的背景干扰,因此,Luc是一种理想的报告基因。 ⑥抗除草剂bar基因⑥抗除草剂bar基因bar基因编码磷化乙酰转移酶(PAT),使转化子对含有磷化麦黄酮()成分的除草剂具有抗性。⑦冠瘿碱合成酶基因⑦冠瘿碱合成酶基因主要包括胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成基因两类,存在于土壤农杆菌Ti质粒的T-DNA区段。 冠瘿碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以催化一些特殊反应,通过电泳分离及菲醌荧光染料染色,方便地观察,据此作为报告基因用于转植物基因细胞的筛选。 冠瘿碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多,现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。 (6)利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞 (6)利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞 在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。 常用的标记基因还有: -- 胸腺核苷激酶基因(tk)、 -- 二氢叶酸还原酶基因(dhfr) -- 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(hgprt) -- 细菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(ecogpt)等。 null胸腺核苷激酶基因(tk)、二氢叶酸还原酶基因(dhfr)及次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(hgprt)等的表达产物直接或间接参与核苷酸合成代谢。 这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡,只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长。如果用这样的缺陷型细胞作为受体细胞,导入含有这些基因的外源DNA,补充原来缺失的基因,使核苷酸合成代谢恢复正常,可以在不添加核苷酸的培养基中正常生长。 根据这一性质可以在不添加核苷酸的培养基中筛选出转化子。 ①胸腺核苷激酶基因①胸腺核苷激酶基因胸苷激酶(TK)是核苷酸合成代谢途径中的一种酶,能够把胸苷转换为胸苷-磷酸,保证核苷酸的顺利合成。胸苷激酶的编码基国(tk),几乎在所有的真核细胞中都能有效地表达,因此可采用这种基因作为遗传选择记号以确定哺乳动物基因转移.相应的受体细胞为遗传标记遗传表型的缺陷型。 null 转基因动物细胞筛选方式:HAT选择法、共转化选择法 HAT选择法:由于选择培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸苷(T),主要针对含有选择标记的目的基因转化子的筛选。 基本原理:利用培养基中的叶酸类似物氨基蝶呤(APT)阻断细胞核苷酸的正常合成途径,启动以次黄嘌呤为底物的补救合成途径(不受氨基蝶呤的抑制,能继续合成出所需核苷酸)。HAT培养基中有外源的胸苷,通过胸苷激酶的作用,tk+能以其为底物合成出TTP,则tk+细胞可继续存活;而tk-细胞无这种合成作用,则死亡。 null分离不具有这种选择记号的外源基因转化子则采用共转化选择法。 共转化是指两种无关联的DNA混合物、能够以磷酸钙沉淀的方式同时转化受体细胞。 共转化细胞的筛选仍可采用以HAT法进行。 ②二氢叶酸还原酶基因 ②二氢叶酸还原酶基因 二氢叶酸还原酶(DHFR)在真核细胞核苷酸生物合成过程中可催化二氢叶酸(DHF)还原成四氢叶酸(THF)。dhfr突变体细胞无法合成四氢叶酸,阻断了正常核酸代谢途径,不能在常规培养基上生长。但如果在常规培养基中加入次黄嘌呤和胸苷,则突变体细胞可以借助补救合成途径维持生长。 null应用dhfr基因作为选择记号的一个明显的优点是,由于基因扩增的结果,转化的细胞能够合成大量的野生型的DHFR,检测比较方便。 ③黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)基因 ③黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)基因 XGPRT是由大肠杆菌Ecogpt基因编码的一种核苷酸代谢酶。哺乳动物细胞中缺少这种酶,但存在着它的类似物次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)。XGPRT酶能够有效地把黄嘌呤转变为黄苷磷酸(XMP),最终形成鸟苷-磷酸(GMP)。HGPRT酶则只能利用次黄嘌呤-鸟嘌呤,催化次黄嘌呤转变为次黄苷-磷酸(IMP)。 根据这些特性,Ecogpt基因可以作为哺乳动物基因转移的一种显性选择记号。 null可见哺乳动物的HGPRT酶无法合成GMP。 但当哺乳动物细胞获得外源的Ecogpt基因,并能有效地表达的话,它们就能够克服霉酚酸和甲氨蝶呤的抑制作用,利用黄嘌呤合成GMP,使细胞能够在这种补加有黄嘌呤和腺嘌呤的抑制培养基中存活下来。 5.3.1.2 营养缺陷型检测法 5.3.1.2 营养缺陷型检测法 根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质,筛选含目的基因的克隆子。如果目的基因产物能降解某些药物使菌株呈现抗性标记,或者基因产物与某些药物作用是显颜色反应,则可根据抗性或颜色直接筛选含目的基因的克隆子。 例如要从某种生物的cDNA文库中钓出dhfr,则可根据二氢叶酸还原酶能降解三甲氧苄二氨嘧啶的性质(该化合物会抑制大肠杆菌的生长),将cDNA文库的一系列克隆子接种在含有适量三甲氧苄二氨嘧啶的培养基上,能正常生长的克隆子中含有dhfr基因。5.3.1.3 形成噬菌斑筛选法 5.3.1.3 形成噬菌斑筛选法 对于λDNA载体系统而言,重组DNA分子大小必须在野生型λDNA长度的75%-105%范围内,才可以在体外包装成具有感染活性的噬菌体颗粒,转导受体菌,在培养基上形成噬菌斑,未转导的受体菌继续正常生长。 如果在重组过程中使用的是取代型λ载体,则噬菌斑中的λ噬菌体即为重组子,因为空载的λDNA分子不能被包装,难以进入受体细胞产生噬菌斑。 如使用插入型λ载体,由于空载的λDNA大于包装下限,所以也能被包装成噬菌体颗粒并产生噬菌斑,此时筛选重组子可以利用λ载体上的筛选标记基因,如lacZ’。当外源DNA片段插入lacZ’基因时,重组噬菌斑无色透明,非重组噬菌斑则呈蓝色。 null通过系列筛选方法获得转化子后,为了确定获得的转化子是真正需要的重组子,还须进一步分析鉴定重组子基因组中的外源DNA片段、目的基因转录的mRNA或翻译的多肽(蛋白质、酶)。 5.3.2 依赖于重组子结构特征分析的筛选法 5.3.2 依赖于重组子结构特征分析的筛选法 5.3.2.1 快速裂解菌落鉴定分子大小 主要是根据有外源DNA片段插入载体后的重组DNA与载体DNA之间的大小差异来鉴定重组子。 分别提取不同转化子的DNA,经琼脂糖凝胶电泳,由于重组DNA是载体DNA中插入了外源DNA片段,其分子量大于载体DNA分子,在琼脂糖凝胶板上出现的DNA带中,落后的带是重组DNA的带。 这是对重组子进行分析鉴定的最基本、最简单的方法,直观快捷,只须获得质粒DNA分子的粗制裂解液即可进行琼脂糖凝胶电泳,尤其适用于插入片段较大的重组子的筛选。 此方法只用于重组子的初步鉴定。 null5.3.2.2 限制性核酸内切酶酶解分析法 通过快速裂解菌落鉴定分子大小的方法难以区分期望重组子和非期望重组子,因为重组质粒DNA分子中,质粒载体可能会与一个以上的外源DNA片段连接重组。 采用限制性核酸内切酶分析法不仅可以进一步筛选鉴定重组子,且能判断外源DNA片段的插入方向及分子质量大小等。 基本做法是从转化菌落中随机挑选出少数菌落,快速提取质粒DNA,用限制性核酸内切酶酶解,并通过凝胶电泳分析来确定是否有外源基因插入及其插入方向等。 全酶解法全酶解法简单操作过程是,用一种或两种能将外源DNA片段从重组质粒上切割下来的限制性核酸内切酶酶解质粒DNA,凝胶电泳后重组质粒分子较单一载体质粒多出一条泳带,据此将重组子和非重组子分离开来。如果插入片段与载体质粒大小相近,则最好用合适的酶将之线性化,通过比较大小确定其是否为重组分子。进一步利用在外源DNA片段上具有识别位点的一种或一种以上的限制性核酸内切酶酶解重组质粒分子,根据酶切图谱分析即可判明插入片段的方向等。 null部分酶解法部分酶解法通过一种或数种限制性核酸内切酶对重组质粒DNA分子进行部分酶解分析,根据部分酶解产生的限制性片段大小,确定限制性核酸内切酶识别位点的准确位置及各个片段的准确排列方式,从而将期望重组子筛选出来。 部分酶解法较全酶解法简单易行,两者通常用于当载体和外源DNA片段连接后产生的转化菌落比任何一组对照连接反应(如只有酶切后的载体或只有外源DNA片段)都明显多时的重组筛选。 null5.3.2.3 利用PCR方法筛选确定重组子 由于在载体DNA分子中,外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的,可以设计合成相应的PCR引物,以待鉴定的转化子或重组子的DNA为进行PCR反应,反应产物经琼脂糖凝胶电泳,若出现特异性扩增DNA带,并且其分子量同预期的一致,则可确定含此重组DNA分子的重组子是期待的重组子。 5.3.3 核酸分子杂交检测法 5.3.3 核酸分子杂交检测法 基本原理是:具有一定同源性的两条核酸(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则高度特异地复性形成双链。 该技术也可用于重组子的筛选鉴定,杂交的双方是待测的核酸序列和用于检测的已知核酸片段(称为探针)。 null基本做法是将待测核酸变性后,用一定的方法将其固定在硝酸纤维膜(或尼龙膜)上,这个过程也称为核酸印迹转移,然后用经标记示踪的特异核酸探针与之杂交结合,洗去其他的非特异结合核酸分子后,示踪标记将指示待测核酸中能与探针互补的特异DNA片段所在的位置。 根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法的不同,核酸分子杂交检测法可分为菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、southern印迹杂交和Nothern印迹杂交四类。 分子杂交分子杂交核酸杂交:两种不同来源单链DNA或RNA相互配对的过程。 分子杂交:生物大分子之间通过相互作用结合在一起:核酸之间通过碱基互补配对;蛋白质之间通过抗原、抗体反应;核酸、蛋白质之间通过疏水作用,氢键进行相互作用。null5.3.3.1 Southern印迹杂交 5.3.3.1 Southern印迹杂交 Southern blot DNA杂交由 E.Southern于1975年提出。 DNA琼脂糖凝胶电泳 转移到NC膜上 DNA或RNA探针杂交 放射自显影显杂交带 Southern印迹杂交,有时又称为DNA印迹杂交或Southern DNA印迹杂交等。 null它是根据毛细管作用的原理,使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上,然后通过与已标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段。null其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。 该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。 Southern杂交Southern杂交纪念发明者—— Edward Southern (1)提取总DNA (2)酶解 (3)电泳 (4)转移到滤膜 (5)变性解链 (6)DNA探针及杂交 (7)洗脱 (8)放射自显影 (9)比较分析 演示null在印迹技术中,硝酸纤维素滤膜是目前应用最广的一种固相支持物,但它也存在一些不足之处: 第一、硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合DNA的,这种结合并不十分牢固。 第二、硝酸纤维素滤膜质地校脆弱,容易碎裂,因此操作须小心谨慎(待别是经烘烤后)。 第三、硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐浓度,在低盐浓度时结合DNA效果不佳,不适宜于电转印迹法。 第四、硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的DNA片段(特别是小于200bp的DNA片段)结合能力不强。 硝酸纤维素滤膜尼龙膜尼龙膜现在人们更倾向于使用尼龙膜。 尼龙膜结合DNA和RNA的能力强于硝酸纤维素滤膜,对小分子质量的核酸也能较好地结合,经烘烤或紫外线照射后,这种结合更加牢固。同时尼龙膜韧性强,操作较方便,对离子浓度要求不高,可重复用于杂文。但其杂交信号本底较硝酸纤维素滤膜高,这可通过增加预杂交液中的非待异性封闭试剂用量的方法加以克服。3.3.2 Northern印迹杂交 3.3.2 Northern印迹杂交 Northern印迹杂交是指将RNA分子变性及电泳分离后、从电泳凝胶转移到固相支持物上进行核酸杂交的方法.又称为Northern RNA印迹杂交等。 该法是在southern印迹杂交基础上发展起来的,主要针对RNA分子的检测,基本步骤与southern印迹杂交相似。但RNA分子与DNA分子有所不同,一般不能采用碱变性处理, Northern杂交是研究基因表达的最严谨的方法之一,可以定量分析组织中某一特异mRNA的表达丰度,根据其迁移的位置也可判断基因分子大小。这一技术应用十分广泛,常用于基因表达调控、基因结构及功能、遗传变异及病理研究。 注意:需在变性条件下电泳,防止RNA形成二级结构。null在RNA变性凝胶电泳中常用的变性剂有甲醛、乙二醛、羟甲基汞、尿素和甲酰胺等。 null5.3.3.3 斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 5.3.3.3 斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 如果只要检测克隆菌株、动植物细胞株或转基因个体、器官、组织提取的总DNA或RNA样品中是否含有目的基因,则可采用斑点印迹杂交(dot blotting)或狭线印迹杂交(slot blotting)进行检测,它们是在Southern印迹杂交的基础上发展的两种相似的快速检测特异核酸(DNA或RNA)分子的核酸杂交技术。 null两种方法的基本原理和操作步骤相同,即通过特殊的加样装置将变性的DNA或RNA核酸样品,直接转移到适当的杂交滤膜上,然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸样品中是否存在特异性DNA或RNA。两者的区别仅在于呈现在杂交滤膜上的核酸样品分别为圆斑状和狭线状。 null斑点杂交法主要用于基因组中特定基因及其表达情况的定性和定量研究。 与其他核酸分子杂交法相比,斑点杂交法具有简单、快速、经济
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