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第三章 基因工程制药工艺技术基础

2010-05-23 50页 ppt 5MB 45阅读

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第三章 基因工程制药工艺技术基础null生 物 制 药 工 艺 学生 物 制 药 工 艺 学Biopharmaceutical technology 第三章 基因工程制药技术null基 础 知 识基因工程大肠杆菌的构建基因工程制药微生物表达系统 生 产 实 例null 克隆技术-多莉的诞生具 体 事 例null如果把高等动物的某些基因导入工程菌,再通过微生物培育,就可以快速、经济地生产出极有价值的药品。具有调节糖代谢、治疗糖尿病作用的胰岛素,一般制药厂要消耗100千克的胰脏原料才能生产出3~4克的产品;用化学合成法制取胰岛素基因,并在大肠杆菌...
第三章 基因工程制药工艺技术基础
null生 物 制 药 工 艺 学生 物 制 药 工 艺 学Biopharmaceutical technology 第三章 基因制药技术null基 础 知 识基因工程大肠杆菌的构建基因工程制药微生物达系统 生 产 实 例null 克隆技术-多莉的诞生具 体 事 例null如果把高等动物的某些基因导入工程菌,再通过微生物培育,就可以快速、经济地生产出极有价值的药品。具有调节糖代谢、治疗糖尿病作用的胰岛素,一般制药厂要消耗100千克的胰脏原料才能生产出3~4克的产品;用化学合成法制取胰岛素基因,并在大肠杆菌中表达成功,投入市场后,即便宜,产量、质量又得到了保证。具 体 事 例基因工程生物药物null基因治病,实际上指的是把功能基因导入病人体内使之表达,并因表达产物 - 蛋白质发挥了功能使疾病得以治疗。半乳糖血症是因长染色体上的一个基因发生突变,由G变为g引起,隐性纯合体即表现为患者。我们通过基因治疗就可将大肠杆菌半乳糖酶的基因通过运载体转移到患者体内的细胞中,使之产生半乳糖酶,从而使症状好转或消失。具 体 事 例基因药物null转基因植物是指科学家在实验室中通过基因工程方法,把作物基因构成加以改变,培育出的新品种。日本农水省生物资源研究所等单位将人的乳腺中产生乳铁蛋白的基因组导入了番茄品种“秋玉”之中开发出了一种基因重组番茄。该番茄能生产母乳中所含的具有提高免疫机能和防止感染的作用和具有增加铁质的功效的多功能蛋白质——乳铁蛋白。具 体 事 例转基因食品null 基因工程(或遗传工程、基因重组技术) (gene engineering)制药是,对不同生物的基因在体外剪切、拼接、重新组合,与适宜的载体(质粒、噬菌体、病毒)DNA连接,构成完整的基因表达系统,然后导入宿主生物细胞内,与原有遗传物质整合或以质粒形式单独在细胞中克隆,并表达活性蛋白质、多肽或核酸等药物。通过基因工程改造微生物细胞的代谢过程,还可提高抗生素、维生素、氨基酸、核酸、辅酶、甾体激素等药物的生产能力。 null基因工程药物制备主要程序下游技术基 础 知 识体外DNA的重组示意图null基 础 知 识null 基因工程的诞生基 础 知 识 理论上的三大发现: 20世纪40年代发现了生物的遗传物质是DNA; 20世纪50年代提出了DNA的双螺旋结构; 20世纪60年代确定了遗传信息的传递方式。 技术上的三大发明: 工具酶(限制性核酸内切酶和DNA连接酶 ); 载体; 逆转录酶。nullDNA的组成基 础 知 识 DNA的结构与功能五碳糖 磷酸 碱基 鸟嘌呤(G)腺嘌呤(A)nullDNA的结构DNA的复制 基 础 知 识 DNA的结构与功能化学结构图结构模式图null基 础 知 识基因的“剪刀”──限制性内切酶(限制酶)一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定的切割点上切割DNA分子。常用限制酶EcoRI、HindI等(华美公司、Promega公司均可购买)。基因的针线──DNA连接酶连接酶的作用是:将互补配对的两个黏性末端连接起来,使之成为一个完整的DNA分子。常用连接酶T4 DNA。基因的针线:DNA连接酶基 础 知 识基因的针线:DNA连接酶null 常用的运载体:质粒、噬菌体和动植物病毒等基 础 知 识基因的运输工具——载体 要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达,首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去!能将外源基因送入细胞的工具就是载体。 载体必须同时满足三个要求:①具有多个限制酶切点,以便与外源基因连接;②能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达;③具有标记基因,便于进行筛选。null基 础 知 识获取目的基因直接分离基因——鸟枪法 将供体生物的DNA用限制酶切割为许多片段,再用载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达,基因工程就算成功了。 该法最大的缺点是带有很大的盲目性,工作量大,成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。null基 础 知 识人工合成基因法有两种方法:      ①逆转录法:以mRNA为模板,在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(基因)。   ②直接合成法:根据蛋白质的氨基酸顺序推算出mRNA核苷酸顺序,再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。PCR法 人工合成法获取目的基因null基 础 知 识目的基因与载体结合 用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口,将目的基因插入切口处,让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后,在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子。 根据目的基因片段的来源与类型不同,可以采取不同的连接策略,目前常用的连接方式有三种方法:黏端连接、平端连接和T4克隆null基 础 知 识将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞:菌类和动植物细胞导入微生物细胞的方法 转化作用(直接吸收)、转导作用。重组体导入动植物细胞的方法 物理方法:显微注射、基因枪、电穿孔; 化学方法:磷酸钙共沉淀法、脂质体法、二乙胺乙基葡聚糖; 生物学法:反转录病毒法、原生体融合法。 null基 础 知 识目的基因的表达和检测 大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少,必须将它从中检测出来。 将每个受体细胞单独培养形成菌落,检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落,保留有表达产物的进一步培养、研究。根据遗传表型差异进行筛选 抗药性筛选、β-半乳糖酶显色反应选择、噬菌斑形成能力。根据重组子的结构特征进行筛选 快速裂解菌落比较重组DNA分子大小、限制性内切酶、原 位杂交、PCR筛选法。null 基因的表达与调控将DNA所承载的特定遗传信息转变为由特定氨基酸顺序构成 的多肽或蛋白质分子的过程,叫基因的表达。基因根据功能的不同可分为结构基因、调节基因和操纵基因。结构基因包括转录启动子、基因编码区和转录终止子。基 础 知 识null遗传信息的传递方向-中心法则 RNA的转录:以DNA为模板在RNA聚合酶的催化下合成 mRNA的过程。逆转录:以RNA为模板在DNA聚合酶的催化下合成DNA的过 程。翻 译:将以 核苷酸形式编码在mRNA中的信息转变成多肽 链中特定的氨基酸顺序的过程。基 础 知 识null大肠杆菌系统 基因工程制药微生物表达系统 生物学特性:Eco.是最简单的原核细胞生物,属于革兰氏阴性菌。杆状,大小为(2-4)um×(0.4-0.1)um。大肠杆菌的分裂方式是裂殖,在37℃下,17分钟繁殖一代。细胞壁外周身有鞭毛,较长,使细胞游动。无芽孢,一般无荚膜。 表达特点:大肠杆菌表达系统的遗传背景清楚,目标基因表达水平高,培养周期短,抗污染能力强。大肠杆菌会产生具有热源性的脂多糖和内毒素。null 基因工程制药微生物表达系统 质粒载体pBR322是研究得最多,使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒;“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首,“322”是实验编号。   优点:(1)相对分子质量较小,为4361bp;(2)带有一个复制起始位点,保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能;(3)具有两种抗生素抗性基因,可供转化子的选择标记;(4)具有较高的拷贝数,经过氯霉素扩增以后,每个细胞中可累积1000-3000份拷贝,该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。 常用质粒nullpUC质粒载体系列优越: (1)具有更小的分子量(pUCl8为2686bp)和更高的拷贝数 ; (2)适用于组织化学方法检测重组体(产生β—半乳糖酶 ) (3)具有多克隆位点MCS区 基因工程制药微生物表达系统 null 基因工程制药微生物表达系统 生物学特性:酵母(yeast)是最简单的真核单细胞生物,形态为球形、椭圆形、卵形或香肠形。无性繁殖方式以芽殖、裂殖为主,有性繁殖方式产生子囊孢子。 酵母生长繁殖迅速,倍增期约2小时。酵母的遗传背景已相当清楚,已形成五种类型的载体,遗传操作容易。具有真核生物的特征——安全、无毒。酵母的培养条件简单而且大规模培养技术成熟。酵母有亚细胞器分化,能进行蛋白质的翻译后的修饰和加工,并具有良好的蛋白质分泌能力。 酵母系统 null 基因工程制药微生物表达系统 表达载体:酵母表达载体是穿梭载体,能在大肠杆菌和酵母中复制。利用大肠杆菌进行载体构建,简单快速,然后在酵母中进行外源基因的产物表达。目前,已形成四种类型的酵母载体,YIp、YEp、YCp、YRp。 表达特点:许多大肠杆菌中使用的生物技术在酵母中也能用,大多数情况下可像大肠杆菌一样进行遗传操作。虽然已成功地应用酵母表达系统进行制药,但该系统并非尽善尽美。酿酒酵母发酵产生乙醇,制约了高密度发酵。毕赤酵母发酵周期长,要添加甲醇,分子生物学基础不清楚,遗传改造难度大。null 基因工程菌的质量控制(1)表达载体 详细表达载体(基因来源、克隆和鉴定;构建、结构和遗传特性)。(2)宿主细胞 详细记录宿主细胞的资料(细胞株系名称、来源、传代历史、鉴定结果及基本生物学特性等。载体转化方法及在宿主细胞内的状态及其拷贝数、工程菌的遗传稳定性及目标基因的表达方法和表达水平。)(3)目标基因序列 基因序列与蛋白质的氨基酸序列一一对应。详细记录目标基因的来源及其克隆过程。null 基因工程菌的规模化培养基因工程菌的培养基基因工程菌培养基碳源 诱导物氮源与无机盐选择剂 生长因子 null 基因工程菌的规模化培养(1)通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件,如温度、pH值培养基各种组分以及碳氮比,分析表达产物的合成、积累对受菌体的影响。(2)通过培养罐操作确定培养参数和控制的及顺序。由于工程菌生长和异源基因表达之间有着较大的差异,各培养参数在全过程中必须分段控制。基因工程菌的培养过程null 基因工程菌的规模化培养基本培养方式 分批培养、补料分批培养、连续培养、透析培养。 理论上,大肠杆菌发酵的最高菌体密度可达200-400g/L,合理流加碳源是成功的关键。null 基因工程菌的规模化培养基因工程的培养设备 常规微生物发酵设备可直接用于基因工程菌的培养。但是微生物发酵和基因工程菌发酵有所不同,微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产物,细胞生长并非主要目标,而基因工程菌发酵是为了获得最大量的基因表达产物,由于这类物质是相对独立于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞并不需要的蛋白质,因此,培养设备以及控制应满足获得高浓度的受体细胞和高表达的基因产物。基因工程菌发酵罐简图null 基因工程菌发酵工艺与控制 工程菌发酵工艺控制可参考微生物发酵制药工艺的检测与控制,但也要注意工程菌的特殊性,整个工艺必须符合工程菌的遗传特性。 温度:基因工程菌生长的最适温度往往与发酵温度不一致。在一定的温度范围内,随着温度升高,质粒的稳定性在下降,因此,可以建立基于温度变化的分步的连续培养,低温下生长培养,高温下进行诱导产物表达。 溶解氧:基因工程菌是好氧微生物。 pH值:大肠杆菌适宜6.5-7.5,酵母5.0-6.0。null 基因工程菌发酵工艺与控制 产物的表达诱导与发酵终点控制null⒈要使目的基因与对应的载体重组,所需的两种酶是( )  ①限制酶 ②连接酶 ③解旋酶 ④还原酶    A.①② B.③④ C.①④ D.②③ 2.基因工程的正确操作步骤是( ) ①使目的基因与运载体结合   ②将目的基因导入受体细胞  ③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求 ④提取目的基因 A. ③②④①   B. ②④①③      C. ④①②③    D. ③④①②3.实施基因工程的第一步的一种方法是把所需的基因从供体细胞内分离出来,这要利用限制性内切酶。一种限制性内切酶能识别DNA分子的GAATTC顺序,切点在G和A之间,这是利用了酶的( ) A.高效性    B.专一性    C.多样性    D.催化活性易受外界影响 ⒋采用基因工程的方法培育抗虫棉,下列导入目的基因的作法正确的是( ) ①将毒素蛋白注射到棉受精卵中   ②将编码毒素蛋白的DNA序列,注射到棉受精卵中  ③将编码毒素蛋白的DNA序列,与质粒重组,导入 细菌,用该细菌感染棉的体细胞,在进行组织培养 ④将编码毒素蛋白的DNA序列,与细菌质粒重组,注射到棉的子房并进入受精卵中 A.①② B.②③ C.③④ D.④①   3.实施基因工程的第一步的一种方法是把所需的基因从供体细胞内分离出来,这要利用限制性内切酶。一种限制性内切酶能识别DNA分子的GAATTC顺序,切点在G和A之间,这是利用了酶的( ) A.高效性    B.专一性    C.多样性    D.催化活性易受外界影响 ⒋采用基因工程的方法培育抗虫棉,下列导入目的基因的作法正确的是( ) ①将毒素蛋白注射到棉受精卵中   ②将编码毒素蛋白的DNA序列,注射到棉受精卵中  ③将编码毒素蛋白的DNA序列,与质粒重组,导入 细菌,用该细菌感染棉的体细胞,在进行组织培养 ④将编码毒素蛋白的DNA序列,与细菌质粒重组,注射到棉的子房并进入受精卵中 A.①② B.②③ C.③④ D.④①   nullDNA体外重组返 回nullDNA的组成返 回null返 回null返 回null返 回引发延伸终止解旋酶 聚合酶 碱基互补配对原则 null返 回null返 回典型的原核蛋白质编码基因的结构null返 回cDNA的合成步骤寡聚脱氧胸苷酸4种脱氧核苷三磷酸null返 回PCR原理示意 Mullis,1985年创立,1987年获得专利,1989被科学杂志评为十大科技发明之首,1993年获诺贝尔化学奖。null返 回人工合成基因的方法null返 回带外置透析器的发酵设备null返 回发酵罐nullnullnull2、基因工程与药物研制  许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限,其价格往往十分昂贵。  微生物生长迅速,容易控制,适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内,让它们产生相应的药物,不但能解决产量问题,还能大大降低生产成本。null  胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取,100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素,其产量之低和价格之高可想而知。  将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌,每2000L培养液就能产生100g胰岛素!使其价格降低了30%-50%!null3、 环境保护  基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。  通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类,用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属,分解DDT等毒害物质。null
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