表皮生长因子受体单克隆抗体抗肺癌作用的研究

《肿瘤~2000年 1月(第 20卷第 1期) · 实验研 究 · _r一 7 表皮 长 研究 因子受体单克隆抗体抗肺癌作用的 V 任新玲 ，沈丽英 ，金伯泉 ，戚好文 ，马 进 ● ‘ ’～ _ ， _ ‘ 。 。 ～ 7；，D、 J R7； 中国分类号：R73—362 文献标识码：A 文章编号；1000—7431(2000)01—0035一D3 摘要：目的 实验观事表皮生长因子受体单克隆抗体 (EGFR McAb)egf／r3对肺癌的治疗作 用。 体外细胞 增 殖抑制 实验采用 MTT法，禄鼠体 内移植瘤采用同时治疗 (T1蛆)与延后 治疗(T2蛆)两种。结果 egf／r3 McAb 对高表达 EGFR的 SPC—A1和 A549肺癌细胞体外均具有 增殖抑制作用，井呈剂量依赖性；以 sPc—Al进行裸鼠皮下 移植做 体 内实验 ，至洁井 结束 ．T1蛆 5O 成瘤 (316)，时照 蛆 100 成瘤 (616)；至实验蛄束，Tl蛆 与T2组瘤体抑制率 分科为 75 与 67 ，瘤重抑制率分别为 65 与 47 痛 理切 片显 示治疗 蛆肿瘤蛆织局部坏死，电镜 示践粒体凝螭， 嵴断裂、溶解。结论 egf／r3 McAb部分抑制肺癌钿胞成疳， 明显延鹱已成疳肺癌生长．具有一定的抗肺癌作用。其体内 抗瘸效果强于体外，可能与宿主免疫系统枣与瘤细胞溶解有 关 EFFICACY OF EPIDERM AL GRoW TH FACIU R RECEp- ToR ANTIBoDY AGAINST LUNG CANCER IN VITRo AND IN NUDE M ICE REN Xin—ling．SHEN 一ying， JIN Bt quan，et a1．IDepartment of Respiratory Di．~ease，x ring Hosptial—Fourth Military Medical Um'versity， Ⅱ 710O32 cht t＆ Abstract{0bjective Tv investigate the effect of epi— dermal growth factor receptor(EGFR)monoclonal antibody (MeAb egf／r3)against lung cancer．Methods Inhibition of cell growth in vitro wa．q observed by MTT assay．The effect of antibody on growth of tumor xenografts in nude mice was investigated with group T1 treating at the time of tumor in- oculation and group T2 treating of established tumors Re- suits The egf／r3 McAb jnh ted the cell growth dose—de— pendently on both lung cancer eel1 lines SPC—A1 and A549 At the end of treatment 50 ％(3／6)s1【es in group T1 were tumor free，while 100 (616)sites in control group had tu一 基金项 目：本课题部分为中国 古 巴协作项 目基盘 资助 作者单位：1．第四军医大学西京医院呼吸内科(西安 710032) 2 第四军医太学免斑学教研室 3 第四军医大学空医系 mor forming．At the end of expe riment．the inh；bit Dn ratE of tumor size and of tumor weight in group T1 were 75％ and 65％ respectively，and in group T2 were 67 and 47 respectively．Pathologic examination showed that the treated tumor was necrosed Under electronic microscope． the mitoehondria appeared condensed and its crease5 disap— peared．Conclusion These results suggested that the ant[一 body could partly inhibit lung cancer formation．retard the growth of cancer cells． The antibody wBs found to have substantially a better ant tUnlor activi ry in vivo than that in vitrot it is perhaps due tD the supplementary host inlnlune functions by the IgG2a McAb． Key words j Lung cancer receptor M onoclonal antibody Epidermal growth factor lmmunotherapy 肺癌细胞的无限增殖是一个复杂的生物学过 程，其机理尚未完全阐明。近年来 ，有关表皮生长因 子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR) 研究工作主要在乳腺癌、卵巢癌、阴道上皮癌以及头 颈部肿瘤等恶性组织中进行 ，结果表明 EGFR的过 度表达与某些肿瘤的发生和预后不 良有关“]，国外 应用 EGFR单克隆抗体(EGFR MeAb)开展的肿瘤 实验性治疗也多是在上述肿瘤 中进行。肺癌存在 EGFR的过度 表达，但是就 EGFR与肺癌 的发 生、 发展、预后以及组织特异性 的关系等诸多方面尚未 达成共识口]，尤其是针对 EGFR的肺癌治疗研究报 道甚少 。作者曾应用流式细胞仪分析肺癌细胞株 EGFR的表达，结果发现肺癌细胞系存在 EGFR的 表达，并可能存在着生长因子自分泌环 ，提示 EGFR 及其配体在肺癌的发生发展中可能发挥 了重要的调 控作用。为此，作者应用 egf／r3 McAb进一步开展 了体外及裸鼠体内抗肺癌作用的实验研究．为探索 肺癌分子免疫治疗的新途径积累资料。 材料和方法 一 、肺癌细胞系 实验动!l白及主要试剂 维普资讯 http://www.cqvip.com 36 TUMOR(Shanghai)January 2000，Vo]．20 No．1 肺腺癌细胞系 A549和 SPC—A1分别引自第四 军医大学 口腔医学院和生物技术 中心，肺巨细胞癌 细胞 系 PI A 801引 自北京解放军 301医 院病理 科口一。BAI B／c(nu／nu)裸鼠由第四军医大学动物中 心提供 。EOFR McAb egf／r3由古巴分子免疫中心 提供 ，IG2 McAb(腹水)由第四军医大学免疫学教 研室提供，RPMI 1 640培养基购 自美国 OIBCO公 司，四唑盐(MTT)购 自美国 SIOMA 公司，胎牛血 清(FCS)由中国浙江金华生物制品公司生产。 二、体外细胞增殖抑制实验 采用 MTT法 。取对数生长期 的SPC—A1和 A549细胞，制成单细胞悬液，活细胞计数>98 ， 以 2×1O ／孔 接种 于 96孔 板，用 1 FCS RPMI 1640培养基培养，细胞贴壁后加入不同浓度的egf／ r3 McAb，继续培养 4天，在 570 nm波长测各孔吸 光值 A。按下列公式计算抑制率： ；6j ( )=( 一言 )X100， 结果以每组 5孔的均数±标准差 ± )表示。 三、egf／r3 McAb裸鼠体内抗瘤实验 选 择 BAI B／c(nu／nu)6～8周龄裸小 鼠 24只 (平均体重 18．6 g±1．7 g)，雌雄兼用。取对数生长 期 SPC—A1细胞 ，制成单细胞悬液，按 7×1OV只，将 细胞接种于裸鼠侧腹部皮下血供丰富的部位，按随 机分组设计将动物分成 4组 ，分组及给药方法见表 1。对照组，同时治疗组，无关抗体组裸鼠于接种 24 h后开始治疗，延后治疗组于第 6天移植瘤体积直 径约 O．5 cm时开始治疗。肉眼观察出瘤情况，第 6 天开始用游标卡尺测量肿瘤长径(a)，短径(b)，每 3 天测量 1改，至实验结束 表 1 动物分组及给药方法 肿瘤完全抑 制作为 0，按下 列公式计算肿瘤体积和 瘤体抑制率： 肿瘤体祝 (V)一4门 Ⅱ h c 一( 一毒盖 蒜等 】× 。。 至 第 21天对照 组动物瘤 体直 径约 O．8 cm～1．0 om，动物开始死亡时结束实验，处死动物，摘除移植 瘤称重，按下列公式计算瘤重抑制率： $c =( 薷嚣嚣蒜耄 × oo 四、肿瘤病理形态学观察 摘除移植瘤 ，常规 HE染色，做病理检查 体外 实验收集经 lOO~g／ml egf／r3 McAb处理 48 h的 SPC—A1细胞，以 PBS处理的做对照，反复洗涤、离 心、加人 1 戊二醛固定 12 h以上，然后将细胞 团 块切成细条状 ，PBS轻洗涤，1 锇酸固定 60 nlin， 取出后浸人 PBS 30 min，取出行丙酮梯度脱水、包 埋、聚合、制成超薄切片，透射电镜观察并照相 五 、统计学处理 数据采用均数±标准差(j=± )，组问比较采用 团体 检验。 结 果 一 、egl'／r3 McAb对』、肺癌细胞系增殖的影响 用不 同剂量的 egf／r3 McAb处理 3株肺 癌细 胞系，均 可见一定程度 的增殖抑制，McAb浓度在 O．001 g／ml时这种抑制作用即出现，并随抗体浓 度 增高而 增加 ，在 50{3~g／ml时，抑 制率均 达到 35 左右，呈剂量依赖性(见图 1)，经 egf／r3 McAb 处理的肺癌细胞死亡较少 拿 *} 船 晕 0001 0 u． 01 1 '0 100 10OD egf／r3单抗浓皮 ‘L ) l eRf／r3 McAb对培养忡编细胞J竹殖们彤 二、egl'／r3 MeAb对裸鼠体内穆植瘤的治疗作用 本实验对照组、无关抗体治疗组及延后治疗组 棵鼠全部出瘤。同时治疗组 3只动物分别于皮下移 植 SPC—A1细胞后第 5、6、7天瘤块 消失，第 9天治 疗结束，一半(3／6)部位 未触及瘤组织块，成瘤率为 5O ，另 3只动物肿瘤体积明显小于对照组(见表 2)，第 21天实验结束，同时治疗组 1只动物始终未 见肿瘤生长，解剖局部未见残余肿瘤组织。与对照组 维普资讯 http://www.cqvip.com 《肿癌~2000年 1月(第 20卷第 1期) 相比，同时治疗组肿瘤生长缓慢，尤其以治疗期间最 明显，第 6天瘤体抑制率达到 85 ，第 21天 ，瘤体 抑制率仍然达到 7 ，瘤重抑制率为 67 延后治 疗组．与对照组相比，肿瘤生长缓慢，第 21天瘤体抑 制率为 65 ，瘤重抑制率为 47 。 表 2 egf／r3对裸鼠SPC—A1移檀瘤形成的抑制作用 。。P<0．01，与对照组相 比， 为接种肿榴后第 9天 量． 三、肿瘤形卷学变化 对照组移植瘤体积较大，表面粗糙 ，可见多个结 节 ，同时治疗组 与延后治疗组肿瘤体积小，瘤表面光 滑，部分肿瘤 可见中央坏死．无多结节现象。常规 HE染色显示，两治疗组部分肿瘤组织结构疏松，呈 局灶性坏死改变，以同时治疗组变化更明显。体外培 养的 SPC—A1，透射电镜检查发现胞浆内线粒体明 显增多、凝缩、嵴溶解、胞浆溶酶体增多。 讨 论 目前，对肺癌采取 的综合治疗 的疗效远不 能令人满意 因此，寻找新方法、探索新途径就成为 当务之急。随着分子生物学及免疫学的发展，促使人 们从分子免疫水平对肿瘤的发病机理 、生物学行为 等方面进行深入研究。近 20年的研究发现信号转导 的异常与肿瘤发生、发展有密切关系，其中酪氨酸激 酶途径尤为人们重视 表皮生长因子受体具有酪氨 酸蛋白激酶活性，其介导的信号途径在细胞生长与 分化中有重要作用。研究表明 EGFR在人类许多上 皮源 性恶 性 肿瘤 组织 表 达增 强，人 肺 癌尤其 是 NSCI C有过表达现象。过度表达的 EGFR不断将 表皮生长因子的刺激导人细胞内，引起细胞持续分 裂增殖 ，最终导致肿瘤发生 肿瘤组织 EGFR在发 病早期 即出现高表达，且具有全程表达、特异性强、 突变少、相对稳定等特点，因此有望成为肿瘤细胞新 的表面标志物 考虑到 EGFR在肺癌表达的特点及 其介导的 自分泌环(autocrine loop)在肺癌发生发 展中的调控作用，针对 EGFR进行肺癌分子免疫治 疗成为可能 EGFRMcAb能特异性地识别 EGFR， 阻断其介导的信号转导，打断自分泌环路，从而抑制 肿瘤生长 本实验所用 3株肺癌细胞系均存在 EGFR的 表达 一及生长因子 自分泌环 体外实验表明 egf／r3 McAb对 3株肺癌细胞系均有轻度增殖抑制作用并 呈剂量依赣性。体外 EGFR McAb对肿瘤细胞主要 表现为抑制性而非毒性，与文献报告一致“1 值得注 意的是，尽管3株肺癌细胞系EGFR的表达存在明 显 差 异 (SPC—A1、A549高 表 达 ，PI A一801低表 达)C6]，但 egf／r3 McAb对它们却表现出相似的抑制 作用，提示虽然 PI A一801 EGFR表达低．但其介 导 的 自分泌环可能仍然在 PI A一810细胞增殖 中发挥 了重要的调控作用 。体 内实验时 ，该抗体部分抑制肺 癌细胞成瘤，明显延缓已成瘤肺癌细胞的增殖速度， 显示 egf／r3 McAb对肺癌的明显治疗效果，尤其是 延后治疗方式更符合临床发病情况，此实验结果对 今后 开展 临床 工作 更具 有实 用 价 值 对 egf／r3 McAb体内外抗瘤效果进行 比较发现，在体外主要 表现为抑制性的，在体内却表现出杀伤性(瘤细胞坏 死)，抗瘤效果明显优于体外，提示 egf／r3单抗在体 内可能激括了宿主免疫系统参与抗瘤作用，这可能 与egf／r3 McAb为IgG2a亚类有关 ～ 参考文献 [1]Base[ga』，Menetel sohn』The epidermal growth factor receptor as a target for therapy in breast carcinoma：J] Br Cailce~R粹 Treat，l994，29(11：l97 [2]Ruseh V．Baselga』，Cordon—Cardo C，et al Differentim expres— sion of the epidermal grawth {actor receptor and its】igands in primary non-small cett lung c ncers and adjacent beniRn lung