植物组织培养材料分化与脱分化过程中的生理生化变化

● 7一弓{ 第23卷 第 3期 VO1 23 }3 山 东 农 业 大 学 学 报 Journal of Shandong Agrlcultural University 992年 9月 Sep．1992 文 ·献 ·综 ·述 植物组织培养材料分化与脱分化 过程中的生理生化变化 何 道 一 {科研处 ) 关键词： 堡塑 垡 中国法分类号 堡 {基础部) 鬯 ‘；单塑堇羞 Q944．6 一 THE PHYS10L0GICAL AND B10CHE ⅡCAL CH^NGES 0F PLANTLIH IN VITR0 IN DⅡ1FERENTIATING AND DEDⅡlFERENTIATING HeDaoyi (Dept ofScience Research．Sfiandong Agri Univ Taian Chma 271018) Cheng Bingsong (Dept．ofBasic Course8， 出nP Agri Unit．Taian．China 271018) Key words： culture in vitro；difierentiation；dedifferentiation；tissure culture ’ 细胞分化和脱分化是植物组织培养再生值株的重要生理过程。细胞学、细胞化学和发育生物学等方 面的研究积累了大量资料；联系激素作用机理从分子水平认识细胞分化的机理也有许多研究．无论从哪 方面看，细胞内外化学物质的变化是细胞分化的物质基础，而对细胞分化及脱分化过程中生理生化变化 的研究是认识其本质的重要方面 本文就细胞分化与脱分化的有关生理生化问的研究作一简单的介 绍 1 分化与脱分化中同工酶谱的研究 同工酶在高等植物中普遍存在，在 ：同的发育阶段 不同的组织中均表现出特有的酶谱类型 ”n 它与植物体内生物化学反应的多样性、可变性及其对环境的适应有关。Scandolios ¨认为，同工酶系 统是研究分化的有用标志物。组织培养物的形态建成是由诺多因素决定的，激素对此过程的调节涉及分 子水平，使基因表达出现不同 ” 同工酶正是不同基因表达的产物，因此研究植物组织培养物分化与 脱分化时，它总受到研究者的重视 在同工酶的研究中，过氧化物酶同工酶倍受重视．Galston” 指出，遗传、激素及外界条件对植物 发育的谰节作用与过氧化物酶同工酶谱的变化有关。Rawal 认为，某些过氧化物酶同工酶可能是器 官分化的指标．沈宗英等 研究表明，分化与脱分化过程中均不断出现新的酶带，两者的差别主要在 阴投向酶带，分化过程中多了两条酶带，另有一条酶带话性比脱分化过程中的相应酶带话性高 阳极向 酶带也有差别，有两条酶带在分化过程巾逐渐加强．脱分化过程中却逐渐减弱。过氧化物酶是合成木质 素的关键酶之一 ⋯ 。术质素是形成导管的主要填充成份，导管是盘伤组织中维管结节的组分，而维管 结节的形成是器官分化的前提 ，由此看来，过氧化物酶参与了器官的分化。但也有研究者认为，过 氧化物酶谱在分化前后没有明显变化，只在脱分化形成禽伤组织后同工酶谱才有明显变化 内源激素水 本文收到日期：1990年12fl 7日。 维普资讯 http://www.cqvip.com 328 山东农业大学学报 23卷 平的变化导致细胞分裂与分化的不同，从而也就表现出过氧化物酶同工酶谱的变化 ⋯ 。这些相互矛盾 结果的出现，可能是因备研究者使片j材料的不同所致，特别是I}fi以分析的培养材料，因彝细胞的发育进 程不一致，导致了某些假象 胚性与非胚性愈伤组织的过氧化物酶同工酶的研究，也有类似的矛盾结 果 有人观察到，胚性和非胚性禽伤组织的过氧化物酶同工酶谱有差异，并认为这种差异是由基因表达 不同而造成的。这反映了两类愈伤组织发育 L的差异 ” 但也有报道说二者之间不存在差异 除过氧化物酶同工酶外，酯酶同工酶、氯基酸转移酶同工酶也较受重视 旺’ 。徐竹筠 ” 发现，不 同培养基上培养物的酯酶同工酶带表现各异。Esp1110等 对眷氨酸一革酰乙酸氨基转移酶同工酶研究 指出，在胚性和非胚性禽伤组织中存在着明显差异，并认为谈酶是组织形态建成过程中很有州的指示 酶。此外，对乙醇脱氢酶 谷氨酸脱氢酶． 一葡糖苷酶等同工酶的研究也有类似报道 。 尽管同工酶越来越受到研究者的重视，但它与分化的关系至今还不甚了解。有的研究者认为，因其 它条件引起细胞分裂与分化的不同，从而也就导致了同工酶谱的差异 ⋯ Bonner ”和 Gaspar ”则 认为，分化过程中同工酶谱的变化是分化的原因，而不是分化的结果 过氧化物酶同工酶和分化过程中木质素形成的关系如何?酯酶同工酶在分化巾表现出差异，酯酶是 脂类代谢的重要酶类，而脂粪代谢与分化有何联系?氨基酸转移酶是合成氨基酸的重要酶，该酶的变化 如何反应氯基酸代谢的变化?而分化过程中此变化又有何意义?等等。诸如此粪问题，至今未得到权威 I 性解释 因而，目前分化与脱分化过程中同工酶的研究还只停留在表现差异的比较上，未能瀑八下去 2 分化与脱分化过程中酶活性的研究 组织的分化与脱分化过程，包含一系列复杂的生物化学反应，因而对分化和脱分化有关酶类活性变 化的研究，有着极其重要的意义。 过氧化物酶活性与高等植物发育有关。棘竹筠 。 证实，在胡萝 体细胞的胚胎发生过程中，过氧 化物酶的总活性 与胚状体发育有关，无胚状体出现时酶活性较低，当"Pt胚状体出现时酶活性增高，大 量胚状体出现井开始分化为小植株时，酶活性叉变低。据此认为，组织块中过氧化物酶活性的提高，很 可能是组织进入大量分化时期的前奏。‘这与 Alvaraz“”对兰花幼胚发育过程的研究有相似之处。沈宗 英等 的研究也有类似结果，表明分化过程中的过氧化物酶活性高于脱分化过程。Siegel等 。”指H{， 植物器官的细胞从幼嫩到老化，过氧化物酶活性逐渐增强。过氧化物酶与细胞壁本质化过程有关． Bell 14 J认为，过氧化物酶是合成本质素的美键酶之一。分化过程中过氧化物酶积极参 与了术质化过 程 因而在脱分化过程中，过氧化物酶活性低，细胞木质化程度也低，保持着幼嫩状态。分化过程中木 质化进程加速，形成许多维管结节，这与组织学观察极为一致。Galston等 “ 认为，在调节植物组织 的吲噪乙酸水平中过氧化物酶起着重要作用 在分化与脱分化过程中，过氧化物酶活性的变化可能引起 有效的内源激素水平的改变，从而影响细胞组织的发育 70年代后，荤丙酸类代谢及其产物 与植物细胞分化 器官生长发育的美系受到重视 愈伤组织在分 ● 化过程 巾，出现苯丙氯酸解氯酶 (PAL)活性高峰．术质部的形成与此有密切美系 ．余沛涛 等 “ 也报导，烟草禽伤组织在分化过程中一般出现两个 PAL活性高峰，第一个出现在培养后的第 1～3 天内，第二个在第 11天左右时出现。前者在分化与不分化组织中都存在，似与组织分化无关 因而它可 · 能是由组织或细胞转移到新培养基上诱导产生的。PAL是个诱导酶，受许多因素擞活。第二个活性高峰 在分化的组织中出现，并随分化的进程酶活性趋于 F降，认为可作为分化启动的指示酶。 呼吸酶活性的测定。常f}}i作鉴定某一呼吸途径存在或强弱的指标．毕玉蓉等 0 对烟草禽伤组织分 化中的 3一磷酸甘油醛脱氢酶．琥珀酸脱氢酶进行了研究。结果表明，分化组织中的酶活性高于束分化组 织 中的酶活性。 在胡萝 体细胞胚胎发生过程中，精氨酸脱强酶 ”．嘧啶途经酶活性均增强 ．从此现象看， 细胞的分化过程，是由代谢不活跃状态向活跃状态转变的过程．在这个过程中，酶活性的增强很可能涉 及 DNA转录 蛋白质翻译等分子水平的调控问题。 维普资讯 http://www.cqvip.com ● ● 3期 何道一等：植物组织培养材料分化 与脱分化过程中的生理生化变化 329 3 分化与脱分化过程中蛋白质和氨基酸的研究 在不定芽形成过程巾，人们发现，最幸』J的两天就有低分子量 (16 000~20．000 Dalton)蛋白质的表 现，这是迄今为止不定芽形成过程中最早的生物化学现象 。 Takesi Yasuda等的研究表明，冷杉子 叶在生芽培养基 培养两天，低分子量蛋白质合成增加，4天达最高水平。这种低分子量蛋白质的台成 受诱导寂仿组织培养基的抑制 外植体在生芽培养基 培养两天，再转移到愈仿组织诱导培养基上， 分子量蛋白质的合成受到抑制，形态 f：表现为芽的形成受阻。选两种培养基的不问点在下NAA含量的 差异 达不仅反应了NAA在不同浓度 F作I}}i性质的差异，而且也进 一步证实r墩素的作用涉及到蛋白 质的合成 实验表明，这些低分子量蛋白质的合成可能和不定芽形成的早期阶段有关，而且是个不可逆 过程。在生芽培养基 培养两天的外植体，紧接着转移刊诱导赶伤组织培养基 培养，即使再转回到生 茅培养基上培养，愈伤组织也失去了再生不定芽的能力。Haseyawa等 ”还测定了不同形态培养物新 合成的蛋白质。指出，低分子量蛋白质持续增加是和生芽培养物相联系的 IBA诱导不定根产生时，蛋白质合成速率因IBA处理而大大降低，但蛋白质的含量却较高，这可能 是 IBA减少了蛋白质的转变。IBA的这种作用可能持续到细胞分裂诱导的结束，甚至到根原基的形成 究其原因、这和诱导更多的不定根的发育相联系 。其它研究也表明，蛋白质合成的抑制剂能提高某 些切段生根的反应 ”。但也有与之相反的报道，认为诱导生根刺激蛋白质合成 。 在水稻肛培养中，单向和双向电泳表明，胚性和非胚性愈伤组织及胚 中的蛋白质，有质和量的差 异。有几种 性和非胚性及胚特异蛋白的存在，胚性禽伤组织中的特异多肽有两种和胚中的主要多肽相 一 致。有一种多肽始终在非胚性愈伤组织中出现，而在胚性愈伤组织中只有极低的量，而胚 中则不存 在 胚性和非胚性蠹仿组织培养在再生培养基 L，除了非胚性愈伤组织中45KD蛋白质的量上升外，蛋 白质的图谱几乎都没有变化 C25)。Sung等 00推导，在胡萝 体细胞胚发生时，有两种胚特异蛋白质的 合成，对环己亚胺不敏感性增强 0 另外也发现．胚特异蛋白消失，却另有两类愈伤组织特异蛋白出 现 对甘蔗愈伤组纵 胚性细胞团氯基酸组成分析表明，二者窖有特异氨基酸的存在。后者游离氯基酸 含量比前者少，这可能是组织器官分化时蛋白质、棱酸合成代谢加强的缘故。Stefania等 ”也报道， 在不定芽形成时，游离氨基酸减少而蛋白氨保持较高水平。这也说明，不定芽形成时不断有新的蛋白质 音成 4 分化与脱分化过程中核酸的变化 在分化与脱分化过程中，对 RNA的明显积累与染色体指导 RNA的合成及俸细胞胚发生的关系， 亭J起 了较多的关注。有人测定了不同条件下胡萝 细胞悬浮培养物在发育过程中核酸和核 DNA的含 量。该培养物在有2·4一D培养基上不能形成体细胞胚，在无2 4一D培养基上有体细胞胚形成。在培 养早期，两种培养物的 RNA／DNA的比都有增加，但胚性培养物的高于非胚性培养物的。在整个培养 过程中，非胚性培养物中的棱 DNA含量都保持不变，而胚性的锝u有极少变化 因此，RNA／DNA比 的增加主要是 RNA的积累。同时也发现，RNA的积累先于体细胞胚形成，并随细胞的进一步发育， RNA含量开始下降。在俸细胞发生的早期阶段，RNA台量的增加可能是和棱 DNA基因量的变化 有关 Ⅲ 。Pa捌 和 Berlyn发现，在松胚培养中，不定芽发生的第一步是通过增加 RNA、DNA和基本 棱蛋白的含量而建立器官发生区的 。 对不定根发生和 RNA合成关系的报道不尽一致。法国大豆在一定裱度的 [BA刺激下诱导生根，同 时也刺擞 RNA和 Poly(A)+_RNA 的合成 ”。但也有报道，RNA合成的抑制剂能提高生根效 应 ⋯ 。棱酸酶能提高生根反应，井认为 RNA的合成参与了一种抑制生根的机制，诱导不定根的形成 需抑制 RNA的合成 ”耵 Jarvis等用 IBA处理大豆下胚轴切殴，一定裱廑时能诱导根的形成，但在下 胚轴器官形成的早期 RNA合成减少。用IBA．精胺和维生素 D处理大豆F胚轴切段，都能提高不定根 的发生，但也影响 RNA的代谢，且处理后 24h内就可抑制 RNA的台成 但当再把切段用硼处理，又 维普资讯 http://www.cqvip.com 330 山东农业大学学报 23卷 可提高 RNA的合成．硼是该切段根原基发育的必需处理物 ”。这反应了根诱导和根原基发育时期 RNA代谢的差异．诱导阶段，RNA合成的减少反应了细胞脱分化时细胞功能的转变 5 分化及脱分化过程中呼吸代谢及淀粉含量的变化 植物呼吸过程中葡萄糖的降解途径已有』 ‘泛的研究，但以植物禽伤组织为材料、特别与组织分化、 器官形成相联系进行呼吸方面的研究，还比较少．碘乙酸、丙二酸及 Na PO 抑制试验 ” 表明，在烟草 愈伤组织中，均存在着 EMP、TCA及 H-MP途径，三者的强度在组织分化、叶原基形成过程中部发生 了变化 在盘伤组织的拟分生组织和芽原基分化期，EMP途径运行较低，随芽原基生长，EMP途径逐 渐加强 且高于相同日龄的不分化盘伤组织 在组织分化、芽原基形成的盘伤组织中，有更高的 TCA 活性，也有较高的 HMP途径运行．EMP途径和 HMP途径的变化是在输导组织和芽原基分化的盘伤组 织中发生的，HMP途径运行程度较高，而芽原基的继续生长则与 EMP途径增加有关 有烟草愈伤组织 中分化、芽原基形成及生长期间，三种代谢途径还不清楚 初步推测，EMP途径的加强可提供愈伤组錾l 生长和分化所需的更多能量．HMP途径可能主要为组织芽原基分化产生用于生物合成所需的还原力 (NADPH)及用于核酸合成的中间产物。通过莽草酸途径，4_磷酸赤鲜糖合成一些具有重要调节功能的 芳香族化合物。TCA的一些酮酸中间产物可为蛋白质 氨基酸的合成提供碳架，而且 TCA的某些中间 产物是产生 ATP的主要来源． 近年来，高等植物线粒体中抗氰呼吸的生物学意义吸目【了焱 多研究者．交替途径存在于植物的发肯 过程中，如种子萌发、芽和根的生长 有的研究表明．．抗氰呼吸和愈伤组纵的形成及分化有关，而且在 分化的愈伤组织中承担着电子传递的主要功能 ∞ ．Akira base“ 报道，在禽伤组织培养的早期阶 段，交替途径有所增加．但所占比重很小 在培养的后期，当愈伤组织发生不定根时．交替途径明显， 井认为交替途径与愈伤组织的生长无关，而与盘伤组织的币定根发生有密切关系 Thorpe和 Murashige 研究了在芽形成和非芽形成条件 F核酸、蛋白质及碳水化合物的变化，发 现在引起芽形成的组织区的早期就有大量淀粉的积累。Brossard ”研究烟草茎段芽形成过程中发现， 在器官生长分化结构形成之前淀粉含量增加 Patel等 。 对松树胚培养的研究表明，导致不定芽形成的 第一步是伴随 RNA、DNA和基本核蛋白增加而形成器官发生区，随后便是贮存物质的积累，如脂粪、 蛋白质，特别是淀粉。接着，在这个区域内酯酶、淀粉酶活性的增加和这些物质的被利用。这与呼吸途 径的强度变化似乎存在某种联系。 6 分化与脱分化过程中内源激素和钙调素的变化 ● 近年来．随着酶联免疫．放射免疫测定激素技术的发展，分化与脱分化组织内源激素的研究有了起 步。刘淑兰等 0 研究了芝麻胚轴体细胞胚胎发生过程中几种内源激素含量的变化。他们发现，从肛性 禽伤组织到子叶形肛几个主要发育时期，IAA含量逐渐降低，到子叶形胚时 IAA含量降至最低点，而 子叶形肛到根发生时期 IAA含量又逐步升高。在由胚性盘伤组织到子叶形胚的发育过程中，玉米素核苷 (ZR)+玉米素 (ZT)与 ABA的含量变化呈负相关。根分化时 [AA含量升高，而 ZR+ZT和 ABA含 量均下降，ZR+ZT含量比ABA含量下降的更低。非胚性愈伤组织中IAA和 ABA的含量高于f匝性禽伤 组织，而 ZR+ZT则相反。在外植体分化与脱分化过程中，内源激素的变化和使用外源激素醣导的结果 基本一致。这说明．培养基中施加外源激素可调节组织内源激素的变化，从而诱导分化与脱分化的进 行 外源激素是只调节内源激素的变化，还是直接参与诱导过程?搞清这个问题，将更有助于对分化与 脱分化机理及激素作用机理的认识。 钙调素 (CAM)又称钙调蛋白，是本世纪 60年代后期在动物中发现的一种激活因子，随后在所有 检铡的真核细胞中均发现其存在 Ca 是细胞内功能调节的第二信使，它与CaM 结合后调节细胞内多 种重要酶的活性和功能 最近，有人 ”测定了胡萝 盘伤组织诱导过程巾CaM 的变化．结果发现， 随培养时间的延长，CaM 含量增加，脱分化分裂细胞中有较多的 CaM，用 CaM 拮抗剂三氟拉嗪 (TFP)处理外植体 30天左右后，盘伤组织形成受到明显抑制，去除 TFP可使愈伤组织的生长部分得以 维普资讯 http://www.cqvip.com ● ● 3期 何道一等：植物组织培养材料分化与脱分化过程中的生理生化变化 331‘ 恢复。这些都表明，CaM 可能在激素诱导愈伤组织的发生过程中起着 一定作用，激素作I}Ii可能首先引起 细胞溶质 Ca 浓度增加，继而通过 CaM对脱分化及细胞增殖过程产生效应 目前虽然组织培养中分化与脱分化机理方面的研究做了一系列的工作，生理生化方面的研究也 f人 注目，但因技术上的限制，阻碍了此项研究的深入进行。一是在培养技术 E还不能严格控制细胞发育的 同步化，因而研究材料拄往不能严格 一致，从而有不同发育时期的混杂，造成实验结果的不准确；二是 微量测定技术还不够完善，尤其在组织培养材料少的情况 F，许多生理生化测定技术难以使用，因而发 展微量测定技术是此项研究的当务之急 参 考 文 献 王熊，罗士伟 植物生理学报，I981．7·78—82 王凯基等 植物学报，1981，23：97～103 唐锅华 植物生理学报．1983，9 357--364 枭柿祷，薛应龙．植物生理学报．1987，13 14～I9 毕玉蓉，鬃厚果 实验生物学报．1987，20：I】I～I14 粱厚果等 植物学报，I984，26：499～505 棘竹筠 植物生理学报，I984，10：373～380 洗宗英等 植物生理学报，l985．1l I7～24 刘淑兰等+中国植物生理学会第五次全国垒 议摘要汇编，1990，I68 邱彩虹 ，孙犬业．中国植物生理学会第_丘政全国会议论文摘 要}[编，1999．166 Anza】T et al PlantCellPhysiol一197I，12 695～ 700 Akirahase PlantCeII Physiol 1987 28(5)833～84I AIvarez M R．King DO Amet J Bot 1969．56： l80～ l86 BellAA Ann Rev Plant Physio[ 198I．32： 39～40 Bro'ssardD Ann Sci Nat Bot Blot Veg 1 975 16 43～ 150 Espino FJ．Vazquez AM Plant Science．1985 39： 195～ l98 EverettN P et al Plant Science．1985 41： l33～ l40 Galston DM ，DavisPJ．Science．1969．163： 1 288～ I297 GasparTH ct a1 ActaHortic 1977．78： 61 H Ashihara et al Z Pfanzenphysio1．I981 ． 104： 【29 Jarvis BC et al Plant Phy~ol l985．64： 53～ 59 JJ M ontagu~et a1．Plant Physiol ， 1978，62： 430 Kanthara JGR et at Biochemistry．I979，1 8． 383～ 387 Kiyoshi-M asuda el aL PIant Science Letters I984 33 23～ 29 L Jang_JwuChen，Dawn S Luthe Ptant Science ． 1987．1 8 l8I～ I88 Liang HG，CS Lu．Plant Physiol，1984．75： 876～ 878 OnoH，NakanoM ．Jpn J Gent，1978．53： 241 PaId K R，BerlynGP．Can J．Bot+ 1983．61： 575～ 585 Rawa1 SK．M ehta AR Plant Sci Lett．1982．24： 67～ 77 Rubery PH，NorthcoteD H Nature，1968 ， 2I8： 1230～ l234 Scandalios JG．Ann Rev Plant Physio[ ， 1974．25 225～ 258 Siegel BZ，Galston AW PLant Physio] 1967．42： 22】～ 226 StefaniaBiondi，TTevo~A ThorpeTA Bot ． Gz，I98I，I43(I1： 2O～25 ShibaokaA ct al PlantCellPhyslot．1969．8： 647～656 Takeshi Yasuda et al Plant Physio1．1980，48： 83～ 87 ZR Sung，R Okimoto．Proc Nat1．Acad．Sci U S A ．1981．78： 3683 ZR Sung PlantPhysio1．I98I．68： 26l ZR Sung．R Ok Jmoto Proc Natl Acad Sci U S．A ，I983． 80： 2661 T11orpe TA ，T M urashge Can．J Bot．1970．48： 277～ 285 m ¨ 他 珀 H ” " 博 如 妇 拍 嚣 竹 " ” 弛 维普资讯 http://www.cqvip.com