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薄膜过滤法杀菌率试验

2017-08-07 4页 doc 19KB 45阅读

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薄膜过滤法杀菌率试验薄膜过滤法杀菌率试验一、试验原理将经消毒剂作用过的微生物样本,立即倾入装有微孔滤膜的滤器内,加压过滤后,再加适量稀释液冲洗,去除残留消毒剂后,用稀释液清洗滤膜上残留的菌,将清洗液稀释培养,计算消毒剂杀菌率。本试验适用于验证杀菌剂的杀菌率。二、试验器材、化学试剂及菌种培养皿、试管、烧杯、5uL-50uL微量移液器、100uL-1000uL微量移液器、以及配套的枪头、10mL离心管、0.25µm微孔滤膜及配套过滤器、无菌注射器、游标卡尺、涂布棒、麦氏比浊管、电动混合器、水浴锅、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培...
薄膜过滤法杀菌率试验
薄膜过滤法杀菌率试验一、试验原理将经消毒剂作用过的微生物样本,立即倾入装有微孔滤膜的滤器内,加压过滤后,再加适量稀释液冲洗,去除残留消毒剂后,用稀释液清洗滤膜上残留的菌,将清洗液稀释培养,计算消毒剂杀菌率。本试验适用于验证杀菌剂的杀菌率。二、试验器材、化学试剂及菌种培养皿、试管、烧杯、5uL-50uL微量移液器、100uL-1000uL微量移液器、以及配套的枪头、10mL离心管、0.25µm微孔滤膜及配套过滤器、无菌注射器、游标卡尺、涂布棒、麦氏比浊管、电动混合器、水浴锅、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、电热炉、营养琼脂培养基、PBS缓冲液、无菌水。菌种:溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌三、试验步骤1、试验工器具准备及灭菌在锥形瓶中配置营养琼脂培养基,用电热炉加热煮沸至澄清状态,盖好塞子,将微孔滤膜加入到滤器中,和镊子分别用牛皮纸包好,同PBS缓冲液、无菌水、配套枪头、涂布棒、离心管一起放入高压灭菌锅中灭菌,121℃杀菌25min。将培养皿用牛皮纸包好和试管、烧杯一起放入鼓风干燥箱中灭菌,170℃杀菌2h。试验前超净工作台及操作室使用前需用紫外灯杀菌30min以上。2、倒平板将培养基及培养皿放置到60℃后开始倒平板,培养基使用前摇匀,每个平板倒15~20mL左右,倒好后水平静置至完全凝固。3、菌悬液的制备从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h后,加入5mL的PBS缓冲液将斜面上,在手掌上轻轻振打80次,使菌株完全冲下,倒入试管中轻轻摇匀。吸取1mL的菌液加入到4mL的PBS缓冲液中,再吸取1mL稀释的菌悬液依次进行5倍梯度稀释,选择108CFU/mL左右的菌悬液或106CFU/mL左右的孢子悬浮液(对比0.5麦氏比浊管),待用。4、杀菌剂的配置用分析天平准确称量1g杀菌剂于灭菌后的15mL离心管内,加入10mL无菌水,摇匀使溶解(根据情况可使用电动混合器摇匀或放入水浴锅中加热使溶解)。杀菌剂为液体可直接下一步骤。5、加入杀菌剂5.1取1只试管,加入4.5mL杀菌剂溶液于试管内,吸取0.5mL菌悬液加入试管内,混匀,分别作用2min、5min、10min、20min后,吸取1mL溶液移入装有微孔滤膜的注射器中,加压过滤(加压要缓慢),分两次加入10mLPBS缓冲液于注射器中加压冲洗滤膜,以去除滤膜中残存的杀菌剂,用镊子取出滤膜放到烧杯中,用10mL的PBS缓冲液冲洗,吸取0.5mL溶液加入4.5mLPBS缓冲液的试管中,吸取0.1mL溶液接种到培养皿中,用涂布棒涂匀,盖好培养皿,每组做三个试验。5.2取1只试管,加入4.5mLPBS缓冲液,吸取0.5mL试验菌悬液于于试管中,混匀后,做10倍系列稀释,选择3个适宜稀释度(10-4、10-5、10-6)接种,吸取0.1mL接种到培养皿中,用涂布棒涂匀,盖好培养皿,每组平行做两个试验,作为阳性对照值。5.3用未接种的培养基做阴性对照。6、培养平板并观察结果将培养皿反放于生化培养箱中,调整温度为35℃培养48h后观察结果。4、试验结果1、第一组培养结果如下:样品过滤后稀释个级别。样品培养温度℃,培养h检测结果如下表 作用时间 2min 5min 10min 20min 培养皿号 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 菌落数 平均值 2、第二组培养结果如下:对照品培养温度:℃,培养h检测结果如下表 稀释级 10-4 10-5 10-6 培养皿号 1 2 1 2 1 2 菌落数 平均值 3、阴性对照培养结果:4、杀菌率计算4.1计数菌落时,一般以肉眼观察,必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu~300cfu的平板为准,每个稀释度3个平板生长菌落数全部合乎上述,则以该3个平板的菌落平均值作为结果;若有2个符合合乎上述标准,则以该合格的2个平板菌落的平均值作为结果4.2对于对照组的菌落计数,选取平均数为30cfu~300cfu的稀释度平板,有两个及两个以上稀释度在此范围内按平均值作为结果。4.3杀菌率计算:X1=X1——杀菌率(%)A——对照样品品均菌落数B——被试样品品均菌落数 作用时间 2min 5min 10min 20min 杀菌率
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