Lowry法测定蛋白质浓度

Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度 [目的]  掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。 [原理]     蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。 [操作]    取试管7支、编号、按下表操作： 立即混匀，在20℃～25℃水浴保温30分钟。用660nm比色，测定光密度值。 操作注意事项： 1．  按顺序添加试剂 2．  试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下（试剂甲）易被破坏，因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管，使试剂乙（磷目酸）在破坏前即被还原。 [计算]        (一)绘制标准曲线。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。         (二)以测定管光密度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。     (三)再从标准管中选择—管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。     [器材]     (一)721型分光光度计     (--)恒温水浴箱     (三)中试管7支     (四)刻度吸管：1. 0ml二支；0.5ml一支；5.0ml一支。     [试剂]     (一)试剂甲     (1)4％碳酸钠(Na2CO3)溶液     (2)0.2N氢氧化钠溶液     (3)1％硫酸铜溶液(CuSO4·5H2O)     (4)2％酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾或钠)     在使用前(1)与(2)、(3)与(4)等体积混合，再将两混合液按50：1比例混合，即为试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。 (一)试剂乙：      (1)市售酚试剂在使用前用NaOH滴定，以酚肽为指标剂，根据试剂酸度将其稀释，使最后酸度为1N。     (2)或取Na2WoO42H2O  l00g和Na2MOO3  25g。溶于蒸馏水700ml中，再加85％ H3PO4 50ml和HCl(浓)100ml，将上物混合后，置1000ml圆底烧瓶中温和地回流十小时，再加硫酸锂(Li2SO4H2O)150g，水50ml及溴水数滴。继续沸腾15分钟后以除去剩余的溴，冷却后稀释至1000ml然后过滤，溶液应呈黄色或金黄色(如带绿色者不能用)，置于棕色瓶中保存，使用时用标准NaOH滴定，以酚酞为指示剂，而后稀释约一倍，使最后酸度为1N。     (三)标准蛋白质溶液     用结晶牛血清白蛋白，根据其纯度用蒸馏水配制成0.25mg／ml的蛋白质溶液。(纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定)。     (四)待测样品：准确取血清0.1ml，置于50ml容量瓶中，再加0.9％NaCl溶液至刻度，充分混匀，也可以用尿液为样品。