海藻糖对固定化酶的保护作用

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 　　1999207220 收到初稿 , 1999210231 收到修改稿. 联系人及第一作者 : 杨基础 , 男 , 53 岁 , 硕士 , 副教授 13 国家“九五”科技攻关项目 (No196203201209) . 海藻糖对固定化酶的保护作用 3研究论文 杨基础 　董 　焱木 　杨小民 (清华大学化学工程系 , 北京 100084) 摘 　要 　研究了海藻糖对固定化纤维素酶在干燥和存放过程中的保护作用 , 发现海藻糖能有效地减少固定化酶干 燥过程中酶的热失活 , 而且能提高固定化纤维素酶存放过程中的热稳定性. 但温度越高海藻糖的保护效果越差. 借助红外分析和差示扫描量热 , 初步推测了海藻糖对固定化纤维素酶保护的机理为 : 一是糖的羟基同酶分子 以氢键的形式结合 , 提高了酶的热变性温度 ; 二是糖分子包裹在酶分子周围 , 或填充在酶分子的空间结构内 , 特 别是酶的活性部位附近 , 并形成玻璃态 , 将酶蛋白的空间结构固定住而避免酶的失活. 关键词 　纤维素酶 　海藻糖 　固定化酶 　红外光谱 　差示扫描量热 中图分类号 　Q 55 　TQ 01 引　言 人们常用糖来保护生物材料的活性 , 如葡萄 糖、葡聚糖和蔗糖. 新发现的海藻糖是由 (α, α—1 →1) 键连接的非还原性二糖. 海藻糖被普遍 认为是某些生物在脱水状态下保持生物活性的关键 物质. 许多学者研究了在经历干燥和冻融过程时海 藻糖对生物活性材料如菌体[1 ] 、脂质体[2 ] 、酶[3 ] 甚至动物组织[4 ]等的保护作用 , 明海藻糖是一 种新型的抗逆保鲜剂 , 在生物、医药和食品行业中 应用前景很广. 文献 [ 5～8 ] 用红外图谱法[3 ,5 ]和 差示扫描量热法[6 ,7 ]对海藻糖保护脂质体的机理进 行了研究 , 提出了水替代假说[7 ]和玻璃态学说[8 ] . 固定化酶制备过程中遇到的一个难题是固定化 酶在干燥和存放过程中如何提高酶的热稳定性. 本 文 旨 在 研 究 海 藻 糖 对 固 定 化 纤 维 素 酶 ( EC3121114) 在干燥和存放过程中的保护作用 , 并对其机理进行初步的探讨. 1 　材料和方法 111 　材 　料 海藻糖 , 由日本林原商事株式会社提供 , 食品 级 , 含量 > 99 %. 纤维素酶 (绿色木霉) , 含量 ≥ 15000 unit· (mg 酶) - 1 , 上海丽珠东风生化技术公 司生产. D370 大孔型阴离子交换树脂 , 由南开大 学树脂厂提供. 112 　固定化纤维素酶的制备 首先对树脂进行活化. 用自来水浸泡大孔型阴 离子交换树脂 D370 , 静置数小时后 , 撇除悬浮颗 粒 , 将沉降树脂浸于 1 mol·L - 1 HCl 溶液中 , 24 h 后再以 1 mol·L - 1 NaOH 处理 24 h , 最后用去离子 水将树脂洗涤至中性 , 布氏漏斗抽滤 015 h , 待用. 采用吸附法制备固定化酶. 用缓冲液 HAc - NaAc (p H 值 415) 配制酶溶液 , 将 5 g 活化后的 湿树脂加入 40 ml 浓度 50 mg·L - 1的酶溶液中 , 搅 拌后静置 5 h , 然后将酶液倒出 , 树脂用去离子水 洗涤 3 次以去除表面上附着的纤维素酶 , 抽滤后加 入 25 ml 一定浓度的海藻糖溶液 , 浸泡 5 h 后放在 58 ℃烘箱中干燥. 113 　固定化纤维素酶活性分析方法[9 ] 用固定化纤维素酶水解滤纸中的纤维素 , 产生 纤维素二糖和葡萄糖等还原糖 , 这些还原糖能将 3 , 5 - 二硝基水杨酸还原成橙黄色的氨基化合物 , 利用比色法测定其还原物的生成量来表示酶活力. 定义在 40 ℃下每分钟催化分解羧甲基纤维素钠产 生相当于 1μg 葡萄糖的还原糖所需的固定化酶量 为 1 个活力单位. 实验确定酶反应的最适 p H 值为 414. 2 　结果与讨论 211 　海藻糖对纤维素酶固定化干燥过程的保护 作用 实验研究了海藻糖对酶固定化的影响 , 结果如 表 1 所示. 可以看出 , 如果酶固定化后不进行干燥 处理 , 海藻糖的加入对酶活性并无明显的影响. 固 第 51 卷 　第 2 期 2000 年 4 月 　　　 　　　 化 　　　工 　　　学 　　　报 Journal 　of 　Chemical 　Industry 　and 　Engineering (China) 　　　 　　　 Vol151 　№2 April 　2000 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 定化过程中 , 酶的活性收率约 1116 %～1211 %. 活性收率较低 , 这是吸附法固定化酶的主要缺点 , 但因方法较为简单 , 而本研究的目的是研究在酶固 定化中海藻糖对其热稳定性的影响 , 所以研究中仍 采用吸附法固定化酶. Table 1 　Effect of trehalose concentration on activity of immobilized cellulase during drying (at 58 ℃) Sugar∶enzyme (mass) Activity/ unit·(g resin) - 1 without drying drying at 58 ℃ 0 695165 18165 012 727187 341198 0125 719119 409177 014 710141 430115 在纤维素酶固定化时 , 如进行干燥 , 会引起酶 的失活. 实验研究了海藻糖对纤维素酶固定化干燥 过程的保护作用. 添加的海藻糖同酶的质量之比分 别为 012、0125 和 014 , 干燥温度 58 ℃. 酶活的 变化如表 1 所示. 结果表明 , 没有添加海藻糖的固 定化酶的活力只有 18165 unit· (g 树脂) - 1 , 而添 加海藻糖的固定化酶的活力都有较大的提高 , 并且 随着加入海藻糖量的增加高温干燥后固定化纤维素 酶的剩余活力越高 , 与没有添加海藻糖的固定化酶 的活力相比高达 20 倍左右. 可见 , 对于采用加热 干燥的固定化酶 , 高温干燥是酶活损失的最主要原 因. 添加海藻糖能够大大降低高温干燥给纤维素酶 固定化所造成的损伤 , 增加海藻糖的浓度能在一定 程度上增强对酶的保护作用. 但当海藻糖/ 酶量增 加到 0125 时 , 增强作用就变得不十分明显. 例如 , 海藻糖用量从 0125 增加到 014 , 增加了 60 % , 而 固定化酶的活力只增加了不到 5 %. 这说明用海藻 糖对纤维素酶的固定化过程进行保护 , 糖的用量 不大. 212 　海藻糖对固定化纤维素酶保存过程的保护 作用 将经过干燥的固定化纤维素酶分别在 20 ℃、 37 ℃和 58 ℃3 种条件下长时间保存 , 研究海藻糖 对固定化纤维素酶的存放过程中热稳定性的影响. 如图 1 所示 , 在上述 3 种不同的温度下 , 在长 达 584 h 的时间内 , 有海藻糖保护时 , 固定化纤维 素酶的活力都远高于无海藻糖保护的固定化纤维素 酶的活力 , 一般均提高 10 倍以上. 从图中可以看 出 , 海藻糖的添加量对固定化酶存放过程也有一定 的影响 , 没有添加海藻糖保护的固定化酶酶活均几 乎为零 1 海藻糖用量增加 , 固定化酶的剩余酶活也 随着提高. Fig11 　Protection of trehalose towards immobilized cellulase at various temperature mass ratio of trehalose and enzyme : □0 ; ○012 ; ý 0125 ; ×014 考察一下加和不加海藻糖的固定化酶的活力之 比随存放时间的变化 , 可以进一步分析海藻糖对固 定化纤维素酶存放过程的保护效果. 如表 2 所示 , 在 37 ℃条件下 , 加和不加海藻糖的固定化酶活力 之比随海藻糖用量的增加而增加. 如海藻糖与酶的 质量比从 012 增加到 014 , 528 h 后 , 活力之比从 21 增加到 3118. 实验温度为 20 ℃和 58 ℃时有同 ·491·　　　　　　　　　　　　　　　　　　　化 　　　工 　　　学 　　　报 　　　　　　　　　　　　　　　2000 年 4 月 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net Table 2 　Comparation of activities of immobilized cellulase with and without trehalose (37 ℃) Sugar∶enzyme (mass) Time/ h 0 72 96 168 192 240 312 384 456 528 012 1813 1610 1717 2211 2212 2312 2119 2114 2012 2110 0125 2210 1414 2017 2512 2815 3112 2617 2119 2519 2711 014 2311 1919 2316 2915 3210 3113 3119 2917 3013 3118 Table 3 　Effect of temperature on activities of immobilized cellulase with and without trehalose (mass ratio of trehalose and enzyme : 012) Temperature / ℃ Time/ h 0 96 168 192 240 312 384 456 528 20 1813 1717 2211 2212 2312 2119 2114 2012 2110 37 1813 1615 1812 1219 1019 1311 1511 1313 1318 58 1813 1313 1014 9185 810 517 418 Table 4 　Effect of temperature on activities of immobilized cellulase with and without trehalose (mass ratio of trehalose and enzyme : 014) Temperature / ℃ Time/ h 0 96 168 192 240 312 384 456 528 20 2311 2316 2915 3210 3113 3119 2917 3013 3118 37 2311 2218 2712 2711 2212 2614 2619 2317 2414 58 2311 1812 2016 1516 1612 1114 914 样的规律. 可见 , 增加海藻糖的用量 , 有益于提高 酶在存放过程中的稳定性. 为更清楚地比较海藻糖对固定化酶活力的保护 作用随温度的变化规律 , 相同海藻糖用量、相同存 放时间、不同存放温度下加和不加海藻糖的固定化 酶酶活之比示于表 3 和表 4. 可以看出 , 随着存放 温度升高 , 在整个保存期内加和不加海藻糖的固定 化酶酶活之比降低. 海藻糖与酶的质量比为 012 和 014 时有同样规律. 这说明 , 虽然有了海藻糖的保 护 , 高温贮存对酶活的影响还是不能完全去除 , 而 且温度越高海藻糖的酶活损失越严重. 213 　海藻糖对固定化纤维素酶保护机理的研究 众所周知 , 测定物质分子的红外谱图及其变化 可以研究物质的分子结构和分子间可能发生的作 用 , 通过测量热容变化所得到的差示扫描量热谱图 可以确定试样所发生的物理和化学变化或玻璃化转 变. 但是 , 酶固定化后 , 直接测量或鉴定糖与酶的 相互作用很困难 , 所以本文通过测量游离纤维素 酶、海藻糖和它们的混合物的红外光谱和差示扫描 量热谱图研究海藻糖和酶分子间的相互作用 , 对海 藻糖保护固定化酶的机理做一间接分析. 21311 　海藻糖、纤维素酶及其混合物的红外光谱 　海藻糖、纤维素酶及其混合物的红外光谱示于图 2. 如图所示 , 海藻糖红外光谱的特征吸收峰有 5 个 , 分别是 : 约 3300 cm - 1处为 O —H 的伸缩峰 , 一般由多个峰叠加而成 , 峰带较宽 ; 约 2900 cm - 1 处为 C —H 的伸缩峰 , 有振动耦合所产生的多重分 裂峰 ; 1410～1260 cm - 1处为 O —H 弯曲峰 , 有振 动耦合所产生的多重分裂峰 ; 1300～1050 cm - 1处 为 C —O 伸缩峰 , 有振动耦合所产生的多重分裂 峰 ; 1050～900 cm - 1处为 C 骨架振动峰. 而对于 海藻糖与纤维素酶的混合物 , 由于二者的相互作 用 , 海藻糖的红外特征吸收峰发生变化 , 2900 cm - 1波数左右的 C —H 的伸缩峰向高波数方向移 动了 30 cm - 1 , 同时 , 由振动耦合所产生的多重分 裂峰峰形明显变化 , 1410～1260 cm - 1波数左右的 O —H 弯曲峰的多重分裂峰和 1050～900 cm - 1波数 左右的 C 骨架振动峰的多重分裂峰峰形也发生变 化. 这些变化说明海藻糖原来氢键的作用形式发生 了改变 , C —H 键之间的作用减弱 , 且海藻糖分子 ·591·　第 51 卷 第 2 期 　　　　　　　　　　　杨基础等 : 海藻糖对固定化酶的保护作用 　　　　　　　　　　　　　　　 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 原有的规则结构被改变 , 酶和糖分子之间形成 氢键. Fig12 　Infrared spectra of trehalose , cellulase and their mixture Ⅰ—trehalose + cellulase ; Ⅱ—trehalose ; Ⅲ—cellulase A1 O —H stretching ; B1 C —H stretching ; C1 O —H bending ; D1 C—O stretching ; E1 C skeleton vibration ; F1 C O stretching ; G1 N —H bending ; H1 C —N stretching and N —H bending 同样 , 海藻糖对纤维素酶的红外光谱也产生影 响. 纤维素酶的红外光谱有 3 个特征频率 : 1700 cm - 1波数左右为酰胺 Ⅰ带 , C O 伸缩峰 ; 1600 ～1400 cm - 1波数左右为酰胺 Ⅱ带 , N —H 弯曲峰 ; 1300 cm - 1波数左右为酰胺 Ⅲ带 , C —N 伸展振动 和 N —H 弯曲振动的混合峰. 从图 2 可以看出 , 添 加海藻糖的纤维素酶红外光谱的酰胺 Ⅰ带、酰胺 Ⅱ 带和酰胺 Ⅲ带均向高波数方向有较大的移动 , 这进 一步说明海藻糖的羟基同纤维素酶分子的酰胺基之 间存在比较强的分子间作用力. 以上纤维素酶对海藻糖红外光谱的影响和海藻 糖对纤维素酶红外光谱的影响 , 都说明海藻糖的羟 基同纤维素酶的酰胺基之间存在着氢键作用力. 21312 　海藻糖、纤维素酶及其混合物的差热扫描 量热谱图 　纤维素酶的差热扫描量热谱图如图 3 所 示 , 扫描速度为 10 ℃·min - 1 . 扫描开始后 d H/ d T 曲线就逐渐开始变化 ( H 是热流量 , W·g - 1 ; T 是扫描温度 , ℃) , 说明有以吸热为特征的纤维 素酶的物理热变性发生. 在 11919 ℃纤维素酶完全 变性 , 蛋白质的高级结构完全被破坏. 如图 3 所示 , 添加了海藻糖的纤维素酶的物理 热变性温度提高 , 说明海藻糖同纤维素酶的分子之 间存在较强的分子间作用力 , 且它们之间的作用力 增加了酶分子空间结构的热稳定性. 如图 4 所示 , 海藻糖在 104～113 ℃之间 d H/ d T 存在明显的阶跃 , 两边作切线 , 可以确定海藻 糖的玻璃化转变温度. 海藻糖的玻璃化转变温度较 高 , 为 10616 ℃. Fig13 　Differential scanning calorimetry of cellulase with and without trehalose A —without trehalose ; B —with trehalose Fig14 　Differential scanning calorimetry of trehalose 海藻糖与纤维素酶混合物的红外光谱和差热扫 描量热谱图的变化说明 , 不仅海藻糖的羟基能替代 水与酶形成氢键 , 增强了酶分子的稳定性 , 而且高 温下海藻糖会有玻璃态转变发生 , 即在它的玻璃化 温度以下形成玻璃态. 玻璃态是一种热力学不稳定 的相态 , 处于玻璃态物质的分子很不活跃. 海藻糖 同酶混合时 , 海藻糖的分子包围在酶蛋白分子周 围 , 将酶分子包裹起来 ; 而且因为海藻糖分子较 小 , 也可能进入酶分子的空间结构内部 , 特别是在 酶的活性中心附近 , 这样海藻糖就会在酶分子内外 形成玻璃态 , 而使酶分子很难发生空间结构的变 化. 由于这两方面的原因 , 使海藻糖能在较宽的温 度范围内有效地保护酶的活性. 3 　结　论 研究了海藻糖对固定化纤维素酶干燥和存放的 ·691·　　　　　　　　　　　　　　　　　　　化 　　　工 　　　学 　　　报 　　　　　　　　　　　　　　　2000 年 4 月 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 保护作用 , 得出以下结论. (1) 添加海藻糖能有效提高固定化纤维素酶在 干燥和存放过程中酶的热稳定性. 糖用量增加 , 固 定化纤维素酶的热稳定性提高. (2) 通过测量糖、酶和它们的混合物的红外光 谱和差示扫描量热谱图 , 初步推论海藻糖对纤维素 酶保护作用的机理为 : 一方面海藻糖的羟基同酶的 酰胺基能形成氢键 , 另一方面海藻糖分子包裹在酶 分子周围 , 或填充在酶蛋白分子的空间结构内 , 特 别是酶的活性部位附近 , 形成玻璃态 , 因而使酶的 热稳定性提高. References 1 　Israeli E , Shaffer B T , Lighthart B. 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Increase of stability of immobilized enzymes is not only because of the interaction between trehalose and enzyme , but also because of the formation of a glassy state in and around enzyme moleculars , especially near active sites of enzymes , so that the st ructure of enzymes is rest ricted , and activities of enzyme can be preserved at a high temperature. Keywords 　cellulase , t rehalose , immobilized enzyme , inf rared spectroscopy , differential scanning calorimetry3 To whom correspondence should be addressed. ·791·　第 51 卷 第 2 期 　　　　　　　　　　　杨基础等 : 海藻糖对固定化酶的保护作用