人脐带间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究

· 230 · 中华神经 医学杂志 2006年 3月 第 5卷 第 3~JJ Chin JNeuromed,March 2006,Vol 5,No．3 人脐带间充质干细胞体外扩增和向神经元样 细胞定向诱导分化的研究 袁源 杨树源 韩忠朝 张晓辉 【摘要】 目的 探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)的体外分离 、纯化、扩增和向神经元样细胞的定 向诱导分化。以期为脐带 MSCs的神经移植提供理论依据。 方法 无菌条件下收集剖宫产新生儿脐 带，酶消化法获取 MSCs，进行培养。用流式细胞仪检测MSCs的面标志。取扩增 3，5，l0代的MSCs 分别向神经元样细胞诱导，用免疫组化和 RT．PCR法检测神经元样细胞特异性标志。 结果 脐带富 含 MSCs，且脐带 MSCs(UCMSCs)强表达 CDl3、29、CD44、CD105。弱表达 CDl06，不表达 CD34、 CD1la、CDl4、CD33、CD45。神经条件培养基诱导后的细胞平均有 7O％左右呈现典型的神经元样表 型。免疫组化法检测发现不同代数的MSCs经诱导后均表达 nestin，NSE，NeuN，NF．M，弱表达GFAP。 RT-PCR显示诱导后 NSE mRNA表达增加 。 结论 MSCs存在于人脐带 中，并且在 体外有较 强的增 殖能力。特定条件下能够分化为神经元样细胞。 【关键词】 脐带； 间充质干细胞； 体外扩增； 诱导分化； 神经元样细胞 【中图分类号】 Q254 【文献标识码】 A 【文章编号】 l671-8925(2006)03-230--007 Amplification and differentiation towards neuron-like cells of human umbilical cord derived mesenchy。mal stem cells YUAN Yuon ，YANG Shu-yuan ，HAN Zhong—choo ， ZHANG Xiao—hui*． Department ofNeurosurgery,General Hospital ofTianjin Medwd University，Tianjin 300052。China Corresponding author．' ． YANG Shu-yuan．死 022-60362621 【Abstract】 0bjective To explore the isolation， purification， amplification and differentiation towards neuron-like cells of human um bilical cord(UC)derived mesenchymal stem cells(MSCs)in order to offer some evidence for the transplan tation ofMSCs derived from hum an UC． Methods The UC from full-term neonates delivered abdominally was collected in sterile condition ． MSCs were dbta ed bv enzyme digestion and cultured in DM[EM／F12 medium． Surface an tigen ofUC．derived MSCs was detected by flow c~ometry．Different passages of MSCs(p2，p5，p l O)were induced to differentiate towards neuron．1ike cells and then neural markers were detected by immunocytochemistry an d RT-PCR analysis． Results UC is a rich source ofM SCs，and MSCs expressed strongly CD13 ， CD29，CD44，CD105，weakly CD106，did not express CD34，CDll a，CDl4，CD33，CD45．Under the induction ofDMEM／F12 medium 。 about 70％ cells rapidly assum ed the morphology of multipolar neurons． 1mmunocytochemical assay showed that different passages of MSCs expressed nestin，NSE，NeuN，NF-M and weakly expressed GFAP after differentiation ． r．PCR also showed an increased NSE mRNA expression after induction ． Conclusion UC rived MSCs have a strong proliferation capacity and Can be induced to differentiate towards neuron．1ike cells in vitro． 【Key words】 Umbilical cord； Mesenchymal stem cell； In vitro amplification； Induced differentiation； Neuron．1ike cells 中枢神经系统损伤后将导致严重的功能障碍，但 基金项目：天津市科委重点公关项 1~t(01311121l1 作者单位：300040天津，天津医科大学总院神经外科【袁源(现工 作单位为烟台市毓璜顶医院神经外科)、杨树源、张晓辉】；300040天 津，中国医科院血液病研究所(韩忠朝) 通信作者：杨树源．电话：022-60362621 基 础 研 究 · 目前尚无促进神经再生的有效措施。外源性细胞替代 治疗是神经修复重建的最有前途的的治疗策略。近年 来 ，国内外多个实验组报道了骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)体外特定条件下能转 化为神经元样细胞，使骨髓 MSCs受到了越来越多的 关注『l ]，但临床上，骨髓取材困难 ，供体有限，随年龄 维普资讯 http://www.cqvip.com 中华神经医学杂志2006年3月箜 鲞箜 塑 ro QQ鱼： ： ： 增长骨髓 MSCs增殖能力、多向分化能力下降，且有 病毒污染的可能【3]。这些限制了骨髓 MSCs的进一步 临床应用。寻找其他来源的 MSCs成为近年来的研究 热点。有研究报道 MSCs不仅存在于骨髓，还存在于外 周血，尤其是脐血⋯。更有报道从胎儿肝脏 、肺脏 、肾脏 等部位分离到了 MSCs，表 明 MSCs不仅存在于血液 系统。也存在于实质组织内。但脐血 MSCs含量稀少， 分离极其困难 ，胎儿 MSCs应用又受到伦理学 的限 制。既然脐带血及胎儿内脏均存有 MSCs，而脐带作 为新生儿的一部分并且是分娩废弃物，其中是否也含 有并能否分离到足量的 MSCs引起本实验室的关注。 本文探讨从脐带获取 MSCs的方法及其神经分化潜 能。 和方法 一 、材料 脐带取 自天津市中心妇产医院足月新生儿剖宫 产脐带 ，均经父母授权同意。 二、主要试剂和诱导剂 DMEM／F12(Hyclone公司)，胎牛血清(天津血研 所)，重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human bFGF，rh2 bFGF，邦定公司)，32叔丁基 24羟 基茴香醚 (butylated hydroxyanisole，BHA，sigma公 司)，二甲亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO，苏州工业 园区正兴化工研究院)。兔抗入神经元特异性烯醇化 酶单克隆抗体 (monoclonal rabbit antihuman neuron specific enolase，NSE，Chemicon公司)，兔抗人胶质纤 维酸性蛋白单克隆抗体(monoclonal rabbit antihuman ia fibrillary，GFAP，Chemicon公司)，兔抗神经丝蛋 白 (monoclonal rabbit antihum an neurofilament—M， NF—M，Chemicon公司)，鼠抗神经元特异性核 内抗原 (neuronal nuclear antigen，NeuN，Chemicon公司)，兔 抗人巢蛋白(nestin，博士德公司)。SP试剂盒购 自北 京中山生物技术有限公司，流式抗体除 FITC—CD105 购自Ancell公司，其余均购自美国BD公司。RT—PCR 试剂购自Invitrogen公司，引物由上海博亚生物公司 合成。细胞培养基：DMEM／F12+10％FBS+25mmoI／L 谷胺酰胺 +100U／mL青霉素 +100~g／mL链霉素。预 诱导液：DMEM／Fl2+20％FBS+l0 ng／mL bFGF 化学 诱 导法 诱 导 液 ：DMEM／F12+2％DMSO+200 ixmol／L BHA十25~mol／L KCI+2 inltlOI／L丙 戊 酸 +10 moI／L 拂司扣林 +l~mol／L氢化可的松 三、脐带 MSCs(um bilical cord MSCs．UCMSCs) 的分离 将 脐 带从 手 术 台上 取 下 ，无 菌 条 件 下浸 入 DMEM／F12培养基中，4℃保存；超净台内取出脐带， PBS充分洗涤，冲去脐静脉及动脉内的残存血，将脐 带剪碎至 1 1111113大小组织块 ，移至 0．1％胶原酶Ⅳ中 ， 37℃持续搅拌消化 30 min：随即向胶原酶一组织块消 化体系内加入终浓度为0．1％的胰酶在 37℃环境中 继续搅拌消化 30 min：10％ FBS终止消化 ，用细胞筛 过滤 。将含细胞的滤液进行离心。细胞接种于含 DMEM／F12培养基的 T一25塑料培养瓶 中。3，4 d后 ， 更换培养基，去掉未贴壁细胞。以后每 3天换液 1次， 至细胞融合传代。 四、细胞表面分子标志检测 取第 3代 UCMSCs，去掉培养液。用 PBS洗 2 遍 。再用 0．25％胰蛋 白酶消化；PBS洗涤后制成浓度 为 3．0x106／mE 的单 细 胞 悬 液 。分 别 加 入 抗 人 的 CDl3一PE、CD14一FITC、CD33一PE、CD34一PE、D45一PE、 CD1 la-PE、CD29一PE CD105一FITC CD106一PE Cy-ch — rome—HLA-DR单抗各 5 L，最后 4℃孵育 30 min， 流式细胞仪检测。 五、细胞增殖能力测定 分别取原代及第 2、6、12代UCMSCs，测细胞生 长曲线。调整细胞密度至 5xl03／cm2，接种至24孔板， 培养体系同前。第二天起每天取 3孔。0．25％胰酶消 化，离心，细胞计数，取平均值。细胞到达平台期即停 止观察。EXCEL统计分析生长 曲线 。 六 、细胞周期测定 分别取第 3代及第 8代对数生长期 UCMSCs． 消化后离 心 ，用 PBS洗两遍 ；再用 50 Ixg／mL碘化丙 啶标记细胞和用 100~g／mL RNA酶避光孵育 30 min。行流式细胞术检测细胞周期。 七、体外诱导 MSCs向神经元样细胞分化 分别取第 3，5，l0代生长状态 良好的 UCMSCs。 用 0．25％胰蛋 白酶 ．0．01％EDTA混合液消化 ．经 PBS 洗涤两遍，离心，收集细胞，分别采用化学诱导法。神 经营养因子诱导法，丹参诱导法诱导其分化。 1．化学诱导法 ：用 D M／Fl2培养基将收集 的 UCMSCs按 lx104／mE接种于预先放置有明胶包被 的消毒盖玻片的 6孔板中培养。培养 3 d后 。盖玻片 上的细胞达到 60％~70％融合 ；此时 ，去掉培养基 。更 换为预诱导液进行培养 ；24 h后去掉预诱导液 。用 PBS洗涤两遍 ，加入诱导液继续培养 ：诱导 30 min后 开始在倒置显微镜下观察，以后每隔 30分钟观察 1 次 ，并照相记录细胞分化过程中的形态变化 。诱导 5 h、10 h后 的细胞爬片经 4％多聚 甲醛 固定 30 min。行 免疫组织 化学检查 分别检测 NSE、nestin、GFAP、 NeuN、NF—M 表达。对照组只加预诱导剂。 2．神经营养因子诱导法：用 DMEM／F12培养基 将收集的 UCMSCs按 5x103／mL接种于预先放置有 维普资讯 http://www.cqvip.com l 牛 、r ^ Z01~I, l ll 5 n { ‘’hIn N¨ 1 Ⅲ1 d M h 【¨!“ 、I N 包 做 n0 破 “ 的 6 扎 艇 -r 雌 ，j DMEM：FI 2 J 『 券 JXII hFGI(2{I ng／mL)，E( 『 【10 ng／mL) 压式-fitfp情fRA 0 5 Izmol／l一)艘M 37 I：饱 fluI噬j 芥 ll,J继续 祚 7 d 舛 『蚍 Hj芯 化月 0 ⋯【 7 d 取 f r蚺 津慨 PBS 2 J蛆 4’ 多 斛 宅 地慢 盟 犄 3 ¨棼l秃廿澍、艘种 n 、技 _再坤 襄州化’ 诉 浊 m讲 甘 24 h h ． 、十 哺 澉 川 PBS 7 洚 世 授 匀 DMEM，Fl2l 讲 蚶 幔 纯 魄 1 导 5 h 4”n 聚rl J l定 ．，_电痤 『【羁 化 学幢 八 心 Il 【fl：学憔定 每f雌sP试刹 龠( ：l_t⋯ 生物{ 忙公 州坩 n h 、 进f r纯怔州旦“ 舱 ． PBS洗 2挑 4'ul，多嚷 I．I I I1_ln，‰H、O IfI 济 液J十川 1 0rain 【)】“-一IIi ron X IO0 &^I(1 min J I fil LIl。{ }6 fff l 5 min 1ii．4 “』傲 PBS洗 ． f物 豢怕、【 的 I f1淞 7 t青 i 5 min．I 。0 }14 氧化物 【 帕 龇椭 I I书 I n 漓 37 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http://www.cqvip.com 表 I 1、 l再 NSE NF—M IlC：~till NeuN GFAI ： H⋯一半c％ ． 5) T ．1 Positi c m【c 0rNSE，NF M ncslill，NctIN alld GFAP in groups with dili~rent inductkm methods{％一 ．．-5 J 母睡 +11I-II【L ， <(1 05． J 蚌什 车Iq I ：卜二 0．05： 辨 华 J {HtIL ， >()05． 地 昔 柞l Fil L HlI ’<⋯ l5 一 l 2 i3-actin．3：GFAP i4 GFAPi 5：NSEifi NSF c：7 ma cr OC T一4( 坤i )；9：OCI-4『l焉寻ii?i 图 q u【Ms( 神 哥I llI NS f 0 l n E．9 R 12I：i．TR analyms f1n Lhe expressions of NSE，GFAP and C儿 F．4 in Li(’M S(’ be~rc IlLl aIi the di!l~：rcn LI ¨ [In 『‘细胞移似滑疗足 r种新 的活疗 _f段 目前 ， 符 罔邯n：进 行十圳胞移植 清疗的 丛础研 究干¨临床 鹿 川 l 纠胞按照其 艇艨 - 卅：情 十坌f}1胞和成体干雏l 胞 ll=f：胎 I：耋fI1胞足 徙 胞 ，理 沦上能分化为各 种 成体细胞；n：特定祭fl 下分化为神经样细胞也已见诸 报道 似其研究受到伦 ‘ 技法理的限制 ．且 阿 胎 干细胞的 味婚特fl ， 在f{{：在敛螭性 的危险 神 经 系统疾病细胞替代请 疗蛀州息的种 子细胞是种缝 干 胞 砷 r细抛取 难，限制 r Jl{f临床应 2000年 woodbe~'fII：宴 骨髓 质细胞{BMSCs)在特 定 条什下能分化 为冲经样细胞后 ，骨髓 基质细胞逐 渐 l戊～ { 经刊学领域的一个研究热点 体外1j=ff究证实 经 的 蕊导 ‘法 - r变 为神经样 胞 ，并 丹圳表达神 纤 li{胞 旃 物 nestin、成熟 冲终细胞标志物 NSE、 NF 13Tubulin—m及胶 质 圳 廿乜特 导‘ I：标 物 GFAP、 GaIC 片仃研究从电生 力 面 实漉 的细胞表 观 小 件经细1尥样 偻电f i n ．尢耻体 内研究 也表明 BMSCs哺 移植 -q存活 行政 善损伤 动物 的神经 功 能 较之神 ] 细胞 ．BMSCs收材方便 ．米 源广泛 ，怛 仍然行存供体有限，病毒污染等局lf}! 幸运的是， MSCs作=I=『川质米源n 干细胞．不仅存 于骨髓，血 r泛存在丁胎儿实质性腑 及Ⅱ弁 }}j：m 率研究 脐带 中分离别的 咆 聃 能 蛆 最达 I=细胞特异f~t／c OCT．4． I m胆特 H一．II彤卷 lJ五生 学特 征 与骨 髓 MSCs卡日似．流式捡删纳 表f¨j其抗 标志与骨 髓 MSCs蜘同 我 们据此 ^ 1|J脐 带分离到 的lJ!,li罐细胞 世属于MSC S．表叫除骨髓 胎儿脏器外．MSCs还存 在 丁新生 1[_脐带组织巾 脐带 f¨f分离 MSCs n 蕈嘤 意 义 r‘．瞵带 作 分 娩鹱卉物 ，米源r 泛 ．取柑 疗 便 ．不受怔¨伦理 及法习I的限制 ． 奉 f究建立 的分 离培养 方浊 盟是能 高教 、快速 、大链地 增 MSCs，这 义是脐血源 } 细胞所不能比拟的 ． 乖研究分别利用化学诱导法 ．III药 导法垌I冲经 营 捧吲子 诱 导涪 从 uCMSCs r1，漆导 ⋯神经 元样细 胞 ，并经免疫 蛆化染包教 RT-PCR法蚯宴 诱导后的细 胞表 达神经十细 胞特 性抗 原 nestin硬 熟 经细 胞特 异性抗 啄 NSE、NeuN、NF—M 段 其 tuRNA，进 一 步赶实脐 Jii]宽质f细胞 州忖髓 MSCs一佯 具订神 经 分化潜 能 3种不同 诱译疗法 ． 然 诱 导救率 不同 但最终 均有大量细胞嵌 为神经 r[佯J 志并发 达神经 元特 晕性标志物 叶1胚层起 的 MSCs横向分 化为 外月 、 起源 的l}申经细胞 ．其 确 机制尚小清楚 ． 基 因． 片技 术 实骨髓 MSCs 存能 女达成骨细胞 软骨细胞 、『 E肌细胞 、造血细[抱川质干细胞 种经细胞 维普资讯 http://www.cqvip.com 中华神经医学杂志2oo6生 旦笙 鲞笙 塑 ： 燮 2 鱼： ! ： ： 等的某些标志物基因，一旦基因组中某些基因被细胞 外微环境中的细胞因子所激活 ，则可能向某些特定细 胞分化[7J。研究显示，首次传代后的BMSCs即已有 80％细胞表达nestin及 Tuj—l。4～5代后，可检测到低 度表达的成熟神经元标志物 MAP一2、TH、及 GFAP [8J 。总之．MSCs无论在基因水平还是蛋白水平都与神 经细胞有密切 的联系。不同的诱导方法可能仅仅是开 启或加强了这种联系通道。本实验亦证实诱导前后均 有 NSE及其 mRNA表达，但诱导后表达明显增加。 与文献报道一致。还有学者对 MSCs神经诱导的分子 通路进行了研究，表明：(1)BHA、13一巯基乙醇等抗氧 化剂通过不同途径促进细胞 内第二信使 cAMP增 加．forskolin则直接诱导cAMP增加，继而激活PKA 通路 ．后者可启动下游靶蛋白磷酸化 。同时 ，PKC在 诱导过程中对维持细胞存活有具有重要作用。(2) MEK-ERK信号通路也在 MSCs神经诱导过程中发 挥重要作用。而TrkA则在神经营养因子诱导法中发 挥重要作用[9]。 尽管已进行 了大量研究 ．MSCs的跨胚层分化能 力 ，尤其是神经分化潜能仍然存在争议 ，如 Birgittm] 认为诱导后 出现的突起状结构是 F．肌动蛋 白裂解 ， 细胞骨架重建的结果而不是伸出的树突或轴突。Lu 等 ⋯ 则认为MSCs化学诱导法诱导后出现的神经元 样细胞改变是细胞毒性损害 、胞浆收缩 、细胞骨架改 变的结果。这些争论需要做更多的诱导机制及电生理 学方面的研究 ，尤其是从功能上证实诱导后的细胞能 完成某些神经活动 ，如形成突触联接 ，建立神经反射 。 本研究 证实脐带是 MSCs的 的一种新 的来源 ． UCMSCs的生物学特征与骨髓 MSCs相似 ．在特定 条件下可诱导为神经样细胞，为脐带来源MSCs的应 用提供了理论基础和技术方法。由于脐带的易获取性 及 UCMSCs分离扩增的高效性 ．UCMSCs的发现不 仅使 MSCs家族增加了成员，更为大规模 MSCs治疗 神经系统疾病走向临床铺平了道路。 参 考 文 献 l Brazelton TR，Rossi FM。Keshet GI，et a1．From marrow to brain： expression of neural in adult mice 【J】． Science， 2000， 290： l775．1779． 2 W oodburyD，SchwarzEJ，ProckopDJ，et a1．Adultrat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons【J】．J Neurosci Res，2000，6 l q(4)：364-370． 3 Rao M S， Mattson MP． Stem cells and aging： expanding the possibilities[J]．Mech Ageing Dev，2001，122(7)：713·734． 4 TondreauT，Meuleman N，DelforgeA，eta1．Mesenchymal stem cells derive from CD133 positive cells in mobilized peripheral blood an d cord blood：proliferation，Oct-4 expression and plasticity【J1．Stem Cells，2005，23(8)：l 105-1 ll2． 5 Bossolasco P。Cova L'Calzarossa C，et a1．Neuro·glial differentiation ofhuman bone marrow stem cells in vitro[J]．Exp Neurol，2005，193 (2)：312·325． 6 郭再玉，姜晓丹。徐如祥．骨髓基质细胞源性神经干细胞体外分化 及电生理特性的研究【J】．中华神经医学杂志，2005，4(6)：545．548． 7 Tremain N，Korkko J，Ibberson D，et a1．MicroSAGE analysis of 2， 353 expressed genes in a single cell·derived colony of undifferentiated hum an mesenchymal stem cells reveals mRNAs of multiple cell lineages[J]．Stem Cells，2001，l9(5)：408-418． 8 Tondreau T，Lagneaux L，Dejeneffe M，et a1．Bone marrow-dcrivad mesenchymal stem cells already express specific neural proteins before any differentiation[J]．Differentiation，2004，72(7)：319-326． 9 JoriFP， NapolitanoMA， Melon eMA，eta1． Molecularpathways involved in neural in vitro differentiation ofmarrow stromal stem cells[J]．J Cellular Biochem ，2005，94：645—655． 10 Neuhuber B， Gallo G， Howard L， et a1． Reevaluation ofin vitro differentiation protocols for bone marrow stromal cells：disruption of actin cytoskeleton induces rapid morphological chan ges and mimics neuronal phenotype[J]．J Neurosci Res，2004，77(2)：192—204． 1l Lu P，Bleseh A，Tuszynsld MH．Induction of bone marrow stromal cells to neurons：differentiation，tmnsdifferentiation，or artifact?[J]．J Neurosci Res，2004，77(2)：l74-191． (收稿日期：2005-07一l1) (本文编辑：张玲) 维普资讯 http://www.cqvip.com