大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定

CtIi r { ll{ ＼l (}F1 _【i t i,i_、j、 ， ME／ CINEO CARDI()一 CEREBROk ASCt j 、K DIbEASE ()cra b{ r 2009 V【)1．7 No．10 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定” 闩纯英，杨 敏 ，陈 畅 ，张 钰．林占进 摘 要 ：目的 改进大鼠血管平滑肌 细胞 (VSMC)的培 莽方 法。 采 用机械 刮除 、差异贴壁 等 手段 进行组 织贴块 法原代培 养 ，胰蛋 白酶消化传代 ，并应 用相差显微镜和即用型 sABC免疫组化染色试 剂盒对细胞进行形态学和免疫组化鉴 定。结果 镜下培 养细胞呈典型的“谷一峰状”生长，免疫组化染色显示胞浆 内 n—actin阳性表 达。结论 拳法可获纯度高、结构和功能良好 的 VSM Cs。 关键词：血管平滑肌细胞；细胞培养；大鼠 中图分类号 ：R364．3 文献标识码 ：A 文章编号：1672—1349(2009)1O～¨9O—O2 Culture and Identification of Vascular Smooth M usele Cells in Rats Yan Chunying，Yang Min，Chen Chang，et al Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital，Medical College of Shantou University(Sl1antou 515041) Abstract：0bjective To improve the culture method of vascular smeoth Hluscle cells(VSMCs)in rats．Methods The prima~Y cul— ture and subcuhure weTe done by modifled tissue—piece ineculation and trypsin digestion respectively．The cells were purified by the mechanical treatment aiId differential attachment．The cuhured cells were identified by morphology and immunohistochemistry with phase contrast microscope and SABC kit．Results The cultured cells possessed typically“peak and valley”characteristics for VSMCs under microscope and expressed the smooth ruusele specific d fferenliation marker smooth nluscle—d—actin(SM — —actin)by immu— nohistochemical staining。Conclusion The method presented here could obtain the highly purified VSMCs with good structure and function． Key words：vascular smooth nluscle eell；eell culture；rat 血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)是构 成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分之一。目前 认为 ，VSMc从血管 中膜迁 移到 内膜 、增殖 并分 泌大 量 的细胞 外基 质而使内膜增生是动脉粥样 硬化和血 管成形术后再狭窄等 病理过程 发生的主要 。因此 ，获 得 良好生 长状态 的离体 VSMC是研究其生物学行 为的基础 。本 文参考有 关研究报 道 ， 进行适 当改进 ，运用组织贴块法 、胰蛋 白酶 消化法进“细胞的原 代及传代培养，应用多种方法纯化细胞，成功培养出纯度高、结 构和功能 良好 的 VSMCs．为相关研究提供实验材料0。 。 1 材料与方法 1．1 实验 动物 Wistar大 鼠，雌 雄不限 ，体重 (1 O110)g，购 于汕头大学 医学 院文验动物 中心 1．2 仪器与试剂 DMEM(高糖型)培养墓、胰蛋 白酶粉(1：250)， 均 购 自 Hy—Clone公 司 ；标 准 胎 牛 血 清 购 自杭 州 四 季 青 公 司；青霉素钠 、硫酸链 霉素 购 自华 北制 药厂 ；兔抗 大 鼠 n—actin 单克隆抗 体 (武 汉 博 士 德生 物 工程 有 限公 司，中 国 )；印 H】型 SABC免疫组化染 色试剂盒(武 博 德生物工程 有限公 司，中 国)。 1．3 细胞培养 大 鼠用 10 g／I 戊 巴比妥按 l mL／100 g体 质 量腹腔注射麻 醉，仰卧固定在超净工作 台上 。J铂0．78 reel， I 硫 化钠脱毛，碘伏充分消毒皮肤。沿腹中线剖开胸腔、腹腔．剪开 膈肌，翻开左侧肺叶，可见存脊丰_E前走行的胸主动脉。小心分离 取出主动脉放在 清净 的平 mL rf1，加入 体 积分数 20 标 准胎牛 血清的培养基反复冲洗 去除 血污 。州 两把眼科镊轻轻夹住 I血管 向相反的方向稍Hj力牵拉 ，呈袖套样剥除外 膜。更换平 皿，清洗 m管。固定血 管 端 ，用 眼科 剪纵 行剖开血管 将血管铺开 ，内 膜面向上 ，用棉签刮 去血管内膜及 血迹 、脂肪 滴等杂质 ，再次用 培养基冲洗 此时可见血管 中膜为 白色 ，有一 定的韧度 。血管 1)为汕头市重点科技计划基金项 【j[汕府科t2007 J 76号40] 中膜的主要成 ，，为 ＼：SMC，将其剪成约 1 innl×1 rfun×1 lnm 的 组织块 ，边缘整齐 、光滑 ，均匀贴放 干 25 cm 培养瓶底 面，间 隔 约 5 mm,向培养瓶 内加 人约 4 mL含体积分数 2O 胎牛血清的 培养基 (不接触组织块)，)t-滴 2～3滴 于组织块上 ，使其保持 湿 润。将 培养瓶细胞面 向 放 人 37℃、体积分数 5 C0z培 养 箱中 ，稍微松开瓶 口(使 C() 能够进入瓶 中)。静 置 1．5 h～3．0 h，轻轻翻转培养瓶使组 织块浸 没在培养基 巾，继续培养 。静 置 3 d后视细胞状态给予换液 ．待 细胞生 长至约 90 融合时 给予 传代 。 1．4 细胞换液 在超净：【作台上 ，吸弃 原培养基 ，用 PBS轻轻 冲洗后 ，加入新鲜的 含体积分数 20％胎牛血清 的培 养基继续培 养 。动作膻轻柔 ，尽量不要碰到组织块 。周期为 2 d～3 d。 5 细胞 传代 在趟 净 】 作 台 』二，小心 吸弃 原 培养 基，加 入 PBS 2 nil 轻 兄培养瓶冲洗细胞 ，吸弃 ，加入 2．5 g／L胰蛋 白酶 2 mI ．：37℃消化约 40 S 例置显 馓镜 下见细胞 回缩 、变 圆、折光 性增强，立即吸弃胰蛋 白酶。加入 PBS 4 mI 冲洗残余胰蛋白 酶 ，吸弃。』JI1人含体积 分数 l0 胎牛 血清的培 养基 4 mL终止 消化 。盖好瓶盖 ，对称拍 打培养瓶侧 壁 ，使 大 耶分细胞脱 落 ，然 后 轻轻 吹打瓶壁细胞使其完全脱落 ，形成的细胞悬液按 1：2或 1：3接种 。周期 5 d～7 d，首次传 代时 ，脱 落的组织块 可以 转移到新的25 cln 培养瓶中，按原代培养的方法使组织块重新 贴壁。 1．6 细胞纯化 1．6．1 自然纯化法 由 于进行 了前期 的m管预处理(去除 了大 部分内膜和外膜组织)．原代培养时虽为多种细胞混杂生长，但 平滑肌细胞仍 占绝 大多数 。随着传 代次数 的增 加，平滑 肌细胞 可排挤其他细胞 的生 长而优势增殖 。 1．6．2 机械刮除法 虽然去除了大部 分内膜组织 ，但培养中仍 }f1西医纪合心晒血管病杂志 2009年 lO 第 7卷第 lO驯 呵见内皮细胞 曲小范 嗣生 长。亿代 =fj』住镜 下用 笔 养帆 表面刖L叶l内皮细胞生长区域。H{弯头吸管在该区域内反复推刮、 破坏细舱，吸弃培养液后再进行传代。 1．6．3 差异贴壁法 残 留的内膜和 外膜组织 r_l1含有少量 的成 纤维细胞，为_『去除残留的成纤维细胞 ，在传代时，将消化吹打 形成的细胞悬液静置 15 rn{n，使部分细胞贴壁，转移培养液至下 一 个培养瓶 qI．再次静置 、贴壁 ，重复 上述 步骤 】2欠或 2次 ，最 一 培养瓶 一{1可状较纯 的平滑肌细胞 。 1．7 细胞鉴定 将第 5代科数生长期的细胞悬液接种到置有 盖玻片的六 fL极 。待细胞基本 长成单 层 昏．取出盖玻 片 ，PBS 清洗，4 多 聚I}J醛室温 下同定 15 mlmPBS再次清洗 。根 据即 川型 SABC免瘦组化染色试剂 盒说 明书逐条进 行操作 (一抗 是 兔抗大鼠平滑肌肌动蛋门单克隆抗体)。传代细胞成活率的检 查墩 t匕f专f 的细胞悬液 9 r)1I ，加 入 1 ml 0． 6台盼蓝液 混 匀 后吸取 l滴 f血球计数极 上，3 min之 内在 显傲镜 下分 删计数 活细胞 和死细胞 。 2 结 果 2，1 原代培养 原代培养第 4天～第 7天，在倒置显微镜 F可 观察到少量细胞 以垂 直方 向 自组织 块边缘 游出 ，渐向外生 长形 成细胞 晕 ，进 而彤 成细胞簇 ，且形态 多样(梭彤、多角形 、星形或 不规则形)，大小 略有 差异 。此后 细胞呈 放射性 生长 ，至培 养 2 周～3周左右局部成束的细胞平行排列，部分区域细胞多层重 叠 ，部分区域高低起伏 呈“峰 、谷”状 生长 。传 代后 8O ～9O％ 的细胞 可重新贴壁生长 ，其生 长方式 及形态特点 同前 。 2。2 传代细胞 生长状况 原代细胞 一般 2周 余可 长满瓶壁且 形 成致密单层 ，这 时可进行首 次传代 。胰蛋 白酶将 消化细胞呈 圆形 ，根据传代 时比率不 同 ，24 h～72 h内叉可长满 瓶壁 ，继续 传代培养。随着传代次数的增加和反复的人工纯化，平滑肌细 胞越来越 占据优势 ，5代后 纯度可 达 98 以上。平滑肌 细胞在 传代过程巾形态变化不大 ，连续培养多代仍 可保持较好状态。 2．3 平滑肌细胞的鉴定 培 养第 5代 细胞经特 异 的平 滑肌肌 动蛋白免疫 细胞化学染色后 ，高倍 镜下 可见胞质 内大量棕色 、与 主}Ij胞 长轴平 行的纤维 细丝 ，即平滑肌 肌 动蛋 白丝。核卵 圆形 居 L}】． 淡蓝色 。 2．4 台嘭j蓝结果 共计数 1 053个细胞，其中 51个为阳性，约 有 95 以上 的细胞染色呈 阴性 ，表 明培养 的细胞 消化传代后 成 活率较高 。 3 讨 论 细胞培养主要分为原代 培养 和传代培养两 大类 。目前 国内 细咆库中没有动物或人 的正常 血管平滑肌细胞株 ，国外虽有 ，但 价格昂贵 ， 此均采朋原 代法培养 。常 片j的方法 有酶消 化法和 组织块法 ：酶消化法培养周 期短 ，但 酶作用时 间不 易掌握 ，且消 化酶本身对细胞有毒性作用 ，可致 培养失败 ；组织块法虽培养周 期相对较长，f}j操作简便，污染机会小，培养效率高 。本研究 采心组织块培养法。细胞培养前的准备工作繁多，包括培养用 液的选择 、过滤 、分装 ，特 殊成分 的添加 ，手术器 械 、培 养器皿 的 收集、清洗、消毒等，我们的体会是不要忽略每一个细节。例如： 外购 的培养基 巾通 常需要 加入 适 、J，比例 的 Na C()。，它 的作 用 并非完全是涮节溶 液的 pH值 ，同时还 与培养箱 中的 C() 形成 缓冲对，维持溶液 pH值的稳定，因此不能片{其他碱如NaOH代 替。又如 ：不同种类的培养基 、血 清的质量 和浓度 、特殊成 分的 添肌 与甭部埘细胞的生长百辑 久影 响．嘲此 应根据 既有资料 和 实际需要进行 全面评价和选择 一。 细胞培 养的几点技 巧 ：① ，团抱 生长具有接 触抑制 和密度依 赖性 ，取 2只或 3只大 鼠的胸 ． 蟓组 织块必须均匀 接种于 25 mI 培养瓶【f1，问隙约 2 mm～ IT|m。当部分组织块周围细胞 密集、重叠，停止增殖时，即使整eI细胞未达到传代标准，仍可用 酶消化 ，吹散密集细胞 ，1：】方式 传代生 长。②原 代培 养初期 ， 当部分组织块漂 浮未贴壁 ，可将 重新摆放至瓶底 ，翻转f涸 2 h～3 h后 ，再浸没 于培养 液 中，使其 重{ 贴壁 。该 法不 会影 响 同瓶 中其 他已萌 出的细胞的生长 。@ 职材时 ，凶其胸 主动二永较 细，操作时动作一定要轻粟，避免埘血t的，d度损伤。一般受牵 拉少 ，剪切时边缘整齐 圆滑 的组 织块 ∞出细胞 的概率较 大。④ 细胞 传代 时 ，酶消化时间不应 同 戒碗搬他人经验 ，也在镜 F 察至胞 质【nJ缩 ，间隙增大 时及时 止 化。细胞培菥 自0关键之 一 是无毒 和无 污染 。由于重觎 每个工作 环节 ，卒实验fF蛸舞 中 仅发生过 3次小范 用污染 ，2次 为真菌 ．1次 为支原 体。真菌 污 染时 ，肉眼可 r见淡黄包或 白色的漂浮物 ，镜下显示纵滞交错的 键 管状 菌丝 。有报告称 ：用双层 0．22￡tm 混台纤维 素 滤 膜 意 可有效去除污染的 真菌 。支原体 污染时培 养液未浑 浊 ，但 镜 下可见圆形或梨形的微小颗粒 ，细胞变粗糙 ，胞 浆内有较多的颗 粒状物质，细胞停止增殖。支原体 的检测方法有 多种，巢式 PCR法为不错 的选 择 ．该法快速 、简便 、灵敏 度高 。细胞原 代 培养另一常见的问是其他 细胞 的污 染 ，如 何进行 高质量的 细 胞纯化是众多培养者面临的难题。正常动脉血管分为 3层 ：内 膜由单 层内皮 细胞 、少量平滑肌细胞及胞外基质构成 ，中膜层 唯 一 的细胞成分是平 滑肌细胞 ，外膜有成纤维细胞和平滑肌细胞 。 本研究综 合运用 了 3种 方法纯 化细胞 ，效果 良好 。首先对 接种 前 的动脉进行 了预处理 ，尽量刮去外膜和内膜 层 ，保 证接种的组 织块 中平滑肌细胞 占绝对优势 ，为细胞 的 自然纯化打下了基 础。 然后用机械刮除法去除 了小 范 围生长 的特 殊形态 的内皮细 胞。 而成纤维细胞与平滑肌细胞 形态上难 以鉴 别，利 用二者贴 壁的 时间差 ，反复贴壁去 除了成纤 维细胞 。最终 5代左 右平滑肌 细 胞的纯度达 98 以上 。 参考文献 ： [1] 廖华，糜涛，郭小梅． 管平滑肌细胞增殖信号转导通路与血管冉 狭窄防治[J]．医药导报，Z007，26(2)：11 6一i21． E2] 于学军，何作云，王晓燕，等．平滑肌细胞双层联合培养模型的改进 EJ]．第三军医大学学报，2004，26(6)：554 556． [3] 马丽，刘苏健，邓勇志，等．大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与攀定 [J]．中国心血管病研 究杂志，2007，5(5)：363—365． [4] 徐正云．任国珍，马爱群．大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养 与鉴定 EJ]．岭南心血管病杂志 ，2005，11(3)：202—2o4． L5] 梁若斯，陈德．成人动脉平滑肌细胞体外培养模型的建立[J ．巾国 现代 医学杂志 ．2002．12(IO)：3i． 6] 弗雷谢尼，章静波．动物细胞培养一基本技术指南[M3．第 4版．北 京：科学 出版社 ，2004：116． [7] 周跷莉，雷寒，柳青．血管平滑肌细胞的培养及鉴定[J]．重庆医学， 2005．34(6)：877—879． 作者 简介 ：闰纯英 ，女 ，毕业于 山西 医学院 ，教 授，硕士研 究生导师 ，主任 医师，现工作于油义大学医学院第一附属医院(邮编：515041)；杨敏、陈 畅、张钰、林吉进，工作于汕头大学医学院第 一附属医院。 (收稿日期 ：2009—06—13) (本文编辑 郭怀 印)