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柴胡疏肝散抗肝纤维化的实验研究

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柴胡疏肝散抗肝纤维化的实验研究 柴胡疏肝散抗肝纤维化的实验研究 付德才 杨世忠 宋祥福1 (吉林大学第一医院,吉林 长春 130021) 肖 义 (吉林省妇幼保健院) (摘要]目的探讨柴胡疏肝散对肝纤维化大鼠模型Ⅸ一SMA、TGF-B1的影响及其抗纤维化的机制。方法采用40%CCl4皮下注射,制备 肝纤维化模型并以柴胡疏肝散于预,测定肝功能、血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)及肝组织羟脯氨酸(HYP),光镜观察肝组织病理变化,免疫 组织化学法检测肝组织Ot—SMA、TGF—p1表达,RT—PCR检测TGF—B1mRNA的表达。结果柴胡疏肝散...
柴胡疏肝散抗肝纤维化的实验研究
柴胡疏肝散抗肝纤维化的实验研究 付德才 杨世忠 宋祥福1 (吉林大学第一医院,吉林 长春 130021) 肖 义 (吉林省妇幼保健院) (摘要]目的探讨柴胡疏肝散对肝纤维化大鼠模型Ⅸ一SMA、TGF-B1的影响及其抗纤维化的机制。方法采用40%CCl4皮下注射,制备 肝纤维化模型并以柴胡疏肝散于预,测定肝功能、血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)及肝组织羟脯氨酸(HYP),光镜观察肝组织病理变化,免疫 组织化学法检测肝组织Ot—SMA、TGF—p1达,RT—PCR检测TGF—B1mRNA的表达。结果柴胡疏肝散组较模型组:肝功能明显改善,血清HA及LN 显著降低,肝组织HYP含量明显少,肝组织纤维化程度明显改善,肝组织(It—SMA及TGF—B1表达减少。结论柴胡疏肝散对ccl4诱导的大鼠肝纤维 化有良好的防治作用。 [关键词]柴胡疏肝散;肝纤维化;“一SMA;TGFBI [中图分类号]R575.2[文献标识码]A(文章编号]1005-9202(2007)12-1146-03 近年来柴胡疏肝散抗肝纤维化的临床研究取得了较好的 临床效果¨J,但目前国内外尚无柴胡疏肝散抗肝纤维化的基础 研究。本实验采用四氯化碳(CCl。)大鼠肝纤维化模型,观察柴 胡疏肝散的抗肝纤维化作用,并探讨其对d-平滑肌肌动蛋白 (仪.SMA)、转化生长因子(TGF.131)影响及柴胡疏肝散抗肝纤 维化的理论机制。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1 动物及药物雄性22月龄Wistar大鼠60只,体重 300—350g,由吉林大学实验动物中心提供。柴胡疏肝散(柴胡 6g,陈皮6g,川芎5g,香附5g,枳壳5g,赤芍5g,甘草3g,由 长春中医药大学附属医院提供)经冷水浸泡药材2h,常规两 煎,头煎1.5h,二煎1h,两次水煎液混合并过滤,经水浴蒸发 浓缩成含生药1.12g/ml的浓缩药液冷藏备用。按体表面积折 算,大鼠每天的柴胡疏肝散等效剂量为2.8g/kg(体重)。 1.1.2药品及试剂CCl。购自北京北化精细化学品有限责任 公司);秋水仙碱(colchicine)购自昆明股份制药有限公司;谷 丙转氨酶、谷草转氨酶试剂盒购自上海科欣生物技术研究所; 血清总胆红素(TBIL)试剂盒购自上海科华东菱诊断用品有限 公司;透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)放射免疫测定盒 购自上海海军医学研究所生物技术中心;单克隆急用型鼠抗人 生d.SMA试剂盒购自北京中杉生物公司,兔抗大鼠TGF—B1多 克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司,即用型sP免疫 组化试剂盒购自福州迈新试剂公司,DAB购自北京中山生物公 司,RT.PCR两步法试剂盒购自TAKARA公司,Trizol购自 Sangon公司。 1.2 方法 1 吉林大学公共卫生学院 通讯作者:杨世忠(1952一),男,教授,博士生导师,主要从事肝病研究。 作者简介:付德才(1964一),男,在读博士,主任医师,主要从事肝纤维化 发病机制及防治研究。 1.2.1模型制作参照文献心3方法:实验第l天除正常空白 对照组(对照组)外,其余动物皮下注射CCl4分析纯0.5ml/ 100g(体重),以后每隔3d注射40%CCl4橄榄油剂0.3ml/ 100g(体重),连续8W。实验前2W饲喂高脂玉米粉饲料 (79.5%玉米粉+20%猪油+0.5%胆固醇),第3—6周饲喂 100%玉米粉和30%乙醇饮料。 1.2.2分组及给药方法将60只大鼠随机分为4组,每组15 只,第1组对照组,饲喂正常饮食;第2组模型组,按上述造模 方法给予饮食;第3组柴胡疏肝散治疗组,于造模3W开始,给 予柴胡疏肝散煎剂灌胃,每日2.8g/kg;第4组秋水仙碱组,于 造模3W开始给予秋水仙碱0.1mr,/(kg·d)~,共8W。 1.2.3标本制作上述造模及处理过程结束日,禁食12h后 称质量,股静脉取血,分离血清置一20℃保存;并立刻完整摘取 肝脏及脾脏,称质量后用生理盐水漂洗肝左叶数次,滤纸拭干 后,切取o.2g置于冰浴中的组织匀浆器内,加入冰生理盐水 2lIll,制备成100g/L肝组织匀浆,4‘000r/min4。C离心,取上清 液保存于一20。C。肝右叶置于40g/L中性甲醛液中常规固定 后,石蜡包埋,用于制作组织芯片。 1.3检测指标 1.3.1 血清及组织纤维化指标检测测定血清肝功能包括总 胆红素(TBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、A/ G,检测透明质酸(HA),III型前胶原(PCⅢ),N型胶原(CN), 层黏蛋白(LN)含量(放射免疫分析法):肝匀浆检测羟脯氨酸 (HYP)含量(二甲氨基苯甲醛法),检测试剂盒购自南京建成 生物工程研究所,均按试剂盒说明书操作。 1.3.2病理检测组织芯片分别行常规HE染色,Masson三 色染色(染胶原纤维)及网织纤维染色,光镜下观察,并根据王 泰龄等改进的肝纤维化半定量评分系统(SSS)¨’进行炎症活动 度及肝纤维化程度计分。 1.3.3免疫组织化学检查仅.SMA、TGF.B1采用石蜡包埋常 规切片,sP法,兔抗鼠TGF-Bl,多克隆抗体及鼠抗鼠a.SMA单 克隆抗体均以1:100稀释,DAB显色,苏木素复染。PBS代替 一抗作为阴性对照。阳性组织呈棕色,阴性组织呈蓝色.在全 万方数据 位焦耋笠苤塑蕴匠邀揎赶红缝丝盟塞墅堑霾笠!!翅 自动图像分析系统上,采用HPIAS-2000型图像分析软件进行 定量分析,随机选取每张切片10个视野(×400)倍测定阳性细 胞的A值与所占视野面积,取其乘积平均值为该组织切片所得 值,两项乘积越大表明组织中该抗原含量越高。 1.3.4RT.PCR检测大鼠GAPDH上游引物:5’一CATGAC. cACAGTCcATGccATc一3’,下游引物:5’.CACCCTGTrGCTG- TAGCCATATrC_3’全长450bp;TGFfll上游引物:5’一TGAGTG- GCTGTC唧GACG-3’,下游引物:5’-AC7rrCCAACCCAGGTCCT. TC-37全长350bp。a—SMA上游引物:5’一AAGAGGAAGACAG- CACAGCTC-3’,下游引物:5'-GATGGA’I'GGGAAAAcAGcc-3’称 取50—100mg肝组织用Trizol提取总RNA,采用分光光度法测 定其含量及纯度,测定A260/A280值。取2斗g总RNA,42℃ 逆转录90min。参数设置94℃变性,3min×1循环。94℃变 性30s,53℃退火30S,72oC延伸45S,共35个循环。最后72 ℃彻底延伸7min×1循环。同法扩增GAPDH作为内参照。 取5山PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳。凝胶图像分析系统 检测灰度,TGF.fll/GAPDH比值表示TGF.B1mRNA相对水平。 廿SMA/GAPDH比值表示Or.-SMAmR2NA相对水平。 1.4 统计学分析 实验结果计量数据以孑±s表示,经 SPSSll.10软件包进行方差分析,组间比较采用t检验。 2结果 2.1 各组大鼠肝功能改变模型组ALT、AST显著升高,ALB 显著降低;干预组ALT、AST较模型组明显降低,ALB则显著升 高。见表1。 表1大鼠血清肝功能的变化【i±s) 与模型组比较:1)P<0.05,与正常组比较:2)P<0.01 2.2 各组大鼠血清纤维化检查结果与正常组相比,模型组 大鼠肝纤维化各项指标明显升高(P<0.01),柴胡疏肝散干预 组与模型组比较,HA、LN及PCⅢ明显降低(P<0.01),但未达 到正常对照组的水平。肝组织HYP含量模型组与正常组相比 明显升高(P<0.01),柴胡疏肝散干预组与模型组比较,明显 降低(P<0.01)。见表2。 表2各组大鼠血清HA、LN、PCⅢ含量变化(n=15,i-I-$) 与模型组比较:1)尸<0.01,与正常组比较:2)v<0.01 23组织形态学改变肝脏HE染色显示,正常大鼠可见少 量胶原着色,病理模型组肝小叶结构破坏,纤维组织增生明显, 将肝小叶分隔成大小不等的肝细胞团,肝细胞广泛变性坏死, 汇管区扩大、胶原沉积。柴胡疏肝散干预组肝细胞有不同程度 的变性坏死,汇管区及小叶间有少量纤维组织增生,纤维间隔 细小,与模型组比较差异显著。秋水仙碱干预组肝细胞有不同 程度的变性坏死,汇管区及小叶间有少量纤维组织增生,肝细 胞内可见脂肪沉积。统计分析,柴胡疏肝散干预组及秋水仙碱 干预组较模型组纤维化程度较轻(P<0.05),Masson染色胶原 面积:模型组与柴胡疏肝散干预组相比分别为与(12.9± O.6)%和(6.2±0.4)%,柴胡疏肝散干预组较模型组为低(P< 0.01)。见表3。 表3大鼠肝纤维化的分级(i-1-$) 与模型组比较:1)P<0.05,与正常组比较:2)P<0.01 2。4 免疫组化结果正常组肝组织中几乎不表达TGF一131,模 型组TGF-Bl阳性细胞主要位于中央小叶和门静脉周围纤维带 及肝纤维间隔中,主要见于Kuffer细胞、类间质细胞质及其周 围,柴胡疏肝散干预组阳性染色程度均较模型组明显减轻(P< 0.01)。d-SMA在胞浆表达,正常对照组只表达于小动脉及小 静脉,在胆管无表达。模型组仪-SMA主要表达于汇管区及纤维 间隔,且呈长椭圆形或梭形。实验表明模型组d-SMA免疫组织 化学染色面积明显升高,显著高于正常组(P<0.01)。柴胡疏 肝散治疗组及秋水仙碱干预组明显低于模型组(P<0.05)。 见表4。 表4各组大鼠肝组织TGF-阻及a-SMA表达的变化(i±s) 与模型组比较:1)P<0.05,与正常组比较:2)P<0.01 2.5 RT-PCR检测正常肝组织几乎不表达TGF—BlmRNA, 万方数据 而模型组为强表达,TGF-BI/GAPDH比值为0.84±0.17,远高 于正常组(P<0.01);柴胡疏肝散干预组TGF-131/GAPDH比值 为0.57±0.14,TGF-131mRNA表达低于模型组(P<0.05)。仅- SMAmRNA模型组表达较正常组明显增强,比值为0.97±0.15 (P<0.01);柴胡疏肝散干预组比值为0.62±0.23,与模型组比 较(P<0.01)。 3讨论 目前的研究认为,肝纤维化的病理改变是细胞外基质 (ECM)的增生和降解失衡所致,而病理情况下细胞外基质的主 要细胞来源是肝星状细胞(HSC),他的激活和增生在肝纤维化 过程中起主要作用Hjo。TGF一131是HSC活化的强有力刺激因 子和肝纤维化形成的始动细胞因子∞’“,d.SMA是HSC活化的 标志哺】。从祖国医学辨证认为,肝纤维化是由于气滞、血瘀、络 阻所致,肝纤维化初期主要为气滞,进而血瘀,最后络阻,气机 不畅,肝纤维化、肝硬化形成。因而,在肝纤维化早期给予理气 治疗,间以活血可有效地阻止肝纤维化的形成,柴胡疏肝散(源 自《景岳全书》)主入肝经,方用陈皮、柴胡、川芎、香附、枳壳疏 肝理气,川芎、赤药活血化淤,共奏理气活血之功效,是防治肝 气淤滞的有效验方。本实验证实了柴胡疏肝散具有保护鼠肝 功能的作用,ALT、AST较模型组明显降低,ALB较模型组明显 升高,两者比较差别显著;血清中各纤维化指标及肝组织羟脯 氨酸含量柴胡疏肝散组较模型组明显降低;柴胡疏肝散从组织 学上具有减少试验鼠肝纤维化形成的作用,病理HE染色,Mas- son三色染色胶原含量较模型组明显降低,病理分级明显改善, 两者比较差别显著;柴胡疏肝散能够减少或阻抑试验鼠TGF-B1 及伐一SMA的表达,免疫组化及RT-PCR证实TGF-B1及oL—SMA 的表达量较模型组明显降低,两者比较差别显著,柴胡疏肝散 具有防治实验鼠肝纤维化的作用。 4参考文献 1朱肖鸿,付淑艳,叶蕾.柴胡疏肝散抗肝纤维化治疗的疗效观察 [J].中医药学报,2003;31(2):38. 2于世瀛,贲长恩,杨美娟,等.免疫性和化学性损伤肝纤维化动物模 型的比较[J].实验动物科学与管理,1995;12(4):5-6. 3 中华肝脏病学会肝纤维化学组.肝纤维化诊断及疗效评估共识[J]. 中华肝脏病杂志,2002;10(5):327. 4 SakataR,UenoT,NakamuraT,eta1.Greenteapolyphenolepigallocate- chin-3-gallateinhiplatelet—derivedgrowthfactor—inducedproliferationhu- manhepaticstellatecelllineL190[JJ.JHepatol,2004;40:52-9. 5 IaonoM,SodaM,lnoueA,eta1.Reversetransformationofhepaticmyofi- broblast—likecellsbyTGFbetall/LAP[J].BiochemBiophysResCom- mall,2003;311:959-65. 6 BorderWA,NobleNA.Transforminggrowthfactorbetaintissuefibrosis [J].NEnslJMed,1994;331:1286-92. 7 PinzaniM.NovelinsightsintothebiologyandphysiologyoftheItocell [J].PharmacolTher,1995;66:387-412. 8 BallardiniG,GroffP,BadiaideGiorgiL,eta1.hocellheterogeneity: desmin—negativeItocellsinnormalratliver[J].Hepatology,1994;19: 440-6. 【2006—10-20收稿2006-11-09修回] (编辑章木) 葡萄籽原花青素对AGEs诱导的内皮细胞分泌NO及ET一1的影响 张风雷 高海青沈琳马亚兵 由倍安李保应 (山东大学齐鲁医院老年病科,山东 济南250012) [摘要】 目的观察葡萄籽原花青素(GSP)对糖基化终产物(AGEs)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)一氧化氮(NO)、内皮素(ET一1)生成 及其mRNA表达的影响。方法牛血清白蛋白(BSA)与葡萄糖在体外共同孵育以制备糖基化终产物(AGE—BSA),将培养的HUVEC与不同浓度的 GSP(5、15、25斗g/m1)预孵育4h,再加入200tLg/mlAGE-BSA共同培养,分别用硝酸还原酶法及放免法测定培养上清液中NO及ET一1的含量,用逆 转录PCR(RT.PCR)检测一氧化氮合酶(eNOS)及ET一1mRNA的表达,用激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧簇(ROS)的产生。结果HUVEC用 AGE-BSA刺激后明显增强细胞内ROS产生,并能减少内皮细胞NO的分泌及eNOSmRNA的表达,增加内皮细胞ET一1的分泌及其mRNA的表达 (P<0.01)。而GSP预孵育则对AGE—BSA诱导的上述作用具有显著的改善作用,并呈剂量依赖性(P<0.叭)。结论GSP可能通过抑制细胞内氧 化应激而影响AGEs诱导的内皮细胞NO及ET一1生成,改善血管内皮功能,这对于防治糖尿病慢性血管并发症具有重要的意义。 [关键词)葡萄籽原花青素(GSP);糖基化终产物;一氧化氮;内皮素·1;内皮细胞 (中图分类号】IO,85.5【文献标识码】A [文章编号]10惦.9202(2007)12-11484)4 一氧化氮(NO)及内皮素(ET.1)是血管内皮源性的、调节 血管功能及舒缩活性的重要物质。糖尿病(DM)病人体内蛋白 通讯作者:高海青(1953-),男,教授,博士生导师,主要从事老年冠心病 的病因学及发病机制研究。 作者简介:张风雷(1970一),男,在读博士,主治医师,主要从事老年冠心 病及糖尿病心血管并发症研究。 非酶性糖基化反应增加,形成的糖基化终产物(AGEs)是一种 稳定的、不可逆的、具有自发荧光活性的产物,能损害血管内皮 细胞使血管活性物质的释放失调,改变血管的功能及通透性, 从而参与DM慢性血管并发症的发生发展,而细胞内氧化应激 在此过程中起了关键作用。葡萄籽原花青素(GSP)具有很强 的清除自由基、抗氧化作用,能抑制DM大鼠体内蛋白的非酶 性糖基化反应,减少AGEs产生¨’。本研究的目的是观察GSP 万方数据
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