大柴胡汤对高脂饮食所致兔动脉粥样硬化的保护作用

： ： 竖 里 CINEONCARDIO ／CEREBROVASCULARDISEASE January 2007 Vo1．5 No．1 [8] Fondacci C，Alsat E，Gabriel R。et a1．Alterations of human placental EGFR in intrauterine growth retardation[J]．J Clin Invst，1994，93： 1149—1155． 【9] Gabriel R，Alteration of EGFR in placental membranes of smokers： Relationship with intrauterine growth retardation[J]．Am J Obstet Gyneeo1．1994。170：1238． [10] 林亚洲，许春蓖，黄海，等．川芎嚎干预心力衰竭实验犬心房组织 I、Ⅳ型胶原与TGF—B的mRNA达研究[J]．中西医结合心脑 血管病杂志，2005，3(16)；512—514． [11] 许建平，马庭元，闻良珍。等．川芎嗪治疗胎儿宫内生长迟缓改善 丁子宫胎盘胎儿血液循环的研究[J]．同济医科大学学报，1998， 27(4)：300—302． 作者简介：李兰花，女，现为山西医科大学在读硕士研究生(邮编： 030001)；张延丽，工作于山西医科大学第一医院；于娜，现为山西医科大 学硕士研究生。 (收稿 日期：2006—10-_26) (本文编辑 王雅洁) 大柴胡汤对高脂饮食所致兔动脉粥样硬化的保护作用 王凤荣。刘 彤，郑 娴，毛 丹 摘要：目的 探讨大柴胡汤对高胆固醇喂饲的家兔实验性动脉粥样硬化(AS)形成及对血管壁平滑肌细胞表型及相关原癌基因 ( 一myc表达的影响。 将雄性健康大耳白兔32只，采用随机分层分组法分为4组，每组8只。对照组予喂饲普通颗粒饲料； AS组予普通颗粒饲料加 1％胆固醇加猪油，中药组，在AS组基础上加大柴胡汤2O mL(生药量8．8 g)，西药组在AS组基础上加辛 伐他汀2．5 nag／(kg·d)。4组平行实验8周，实验后第5周、第1O周末由兔耳缘静脉抽血测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低 密度脂蛋白胆固醇(u)L—c)浓度。实验第1O周末，观察主动脉的病理变化，采用电镜技术观察此药对血管壁平滑肌细胞表达的影 响。观察与动脉粥样硬化相关原癌基因c—myc表达的影响。结果 实验1O周时，AS组、中药组、西药组TC、TG、LDL—C指标与 对照组比较有统计学意义(P<0．001)；中药组TG为(1．89±1．12)mmol／L，LDL—C为(7．88±1．06)mmol／L与AS组的(2．76± 2．32)mmol／L、(27．26±2．12)mmol／L比较有统计学意义(P<0．05)。结论 大柴胡汤具有调整脂质代谢、抑制血管壁平滑肌细 胞表型改变的作用。 关键词：大柴胡汤；动脉粥样硬化；原癌基因 中图分类号：R541．4 R285．5 文献标识码：A 文章编号：1672—1349(2007101—0036一O3 The Protective Effect of I)achaihutang on Atherosclerusis Induced by Fatty Foodstuff in Rats Wang Fengrong，Liu Tong，Zhen xian，et al／／Liaonin University of TcM (Shenyang 1 10032) Abstract：Objective To investigate the effect of Dachaihutang on athemsclerosis(AS)induced by fatty f~xtstuff in rats and phenotype of vascular smooth muscle cells and expression of correlated proto oncogene e—myc．Methods Thirty—two healthy male white rabbits were randomized into four groups．Contro1 group was fed with common diet．ASgroup was fed with common diet．1％ cholesteml diet and 1ard．The traditional Chinese medicine group was fed with common diet with 1％ cholesterol diet．1ard and Dactmihutang．Western medicine group was fed common diet with 1％ cholesterol diet，lard and simvastatin 2．5 rag／(kg·d)．The plasma levels of triglyceride(TG)，total cholesterol(1℃)，low density lipoprotein cholesterol(LDL—C)and high density lipoprotein cholesterol(HDL—C)were measured at 5th and the 1 0th week of experiment．Light microscopy and transmission electron microscopy were adopted to assess pathological change of aorta and expression of contractile fiber cells at the 10th week．Proto—oncogene c—myc w&s studied by hybridization in situ．Results Dachai— hutang could reduce the 1evels of serum TC，TG and U)L—C．It could also reduce the formation of athemsclerotic plaque and the hyperpla— sia of vascular,smooth nlu~le．Cdl organs correlated with synthesis were decreased obviously and Dachaihutang could restrain the expression of proto—oncogene c—mye．Conclusion Dachaihutzng could inhibit development of experimental atherosclerosis．adjust lipid metabolisxn and inhibit phenotype change of vascular smooth muscle cells and the expression of proto—oncogene． Key words：Dachaihutang；ather~sclerosis；proto——oneogene c——myc 动脉粥样硬化(AS)是指某些部位内膜下脂质沉积，伴平滑 肌细胞增殖、纤维基质成分增加引起管壁增厚、变硬，管腔狭窄 的病变。是心脑血管疾病的重要基础，是影响人类健康最常见、 最重要的疾病之一。组织病理学研究证明，AS有内皮细胞的损 伤，平滑肌细胞的增生和内膜下迁移，单核／巨噬细胞的浸润和 增生．．因此，AS是一种以细胞增生为主要病变的疾病。临床及 实验研究证明，中药对AS具有显著的拈抗作用，可以通过调整 脂质代谢，抑制血小板黏附聚集释放反应，抑制平滑肌细胞增 殖，有较明显的抑制 AS斑块形成的作用。本实验通过对大柴 胡汤的降脂、抑制血管壁平滑肌细胞表型的变化及阻抑原癌基 因C—myc的表达等方面的探讨，以期揭示其抗 AS形成的机 制，旨在对古典方剂进行现代研究，挖掘出它的功效，为临床应 用提供理论依据。 1 材料与方法 1．1 药品与仪器 实验动物为新西兰兔，由辽宁中医学院实 验动物中心提供；大柴胡汤煎剂由辽宁中医学院附属医院制剂 室提供，依原方基础上加泽泻；胆固醇粉购置辽宁化学试剂公司 (荷兰进口分装)。辛伐他汀为美国默沙东大药厂生产(批号： X19990366)。 ． 血浆磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)、铜锌超氧化物 歧化酶(Cu／Zn--SOD)放免分析药盒，C—myc原位杂交检测试 剂盒。购自武汉博士德分子生物公司。 OLYMPUS光学显微镜，JEM--1200EX电子显微镜，电热 保温箱(上海阳光实验仪器厂生产)；Hzs_-H水浴振荡器(哈 维普资讯 http://www.cqvip.com 中西医结合心脑血管病杂志2007年 1月第5卷第 1期 ·37· 尔滨东联电子技术开发公司生产)；AO石蜡切片机(scientific Instruments生产)；贝克曼700型全自动生化分析仪(美国制 造)。 1．2 实验分组 雄性健康大耳白兔 32只，体重(2．0～2．5) kg，实验前先将动物常规饲养 7 d，然后将实验免随机分为4组， 每组8只。对照组喂饲普通饲料；AS组予普通饲料加 1％胆固 醇饲料加猪油；中药组在AS模型组基础上另加大柴胡汤20 mL (生药量8．8 g)，每日灌胃1次；西药组在AS 模型组基础上另加 辛伐他汀2．5 mg／(kg·d)。动物均为单笼饲养，动物每日每只 进食 100 g饲料，饮水不限。4组平行实验 10周，然后空气栓塞 处死家兔。 1．3 血脂测定 实验后第 5周、第 10周末由兔耳缘静脉抽血 测血脂。血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆 固醇(m L C)采用北京中生生物学技术公司生产的试剂盒， 用酶法测定。血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL—C)采用 Fried wald计算 ：LDL—c(mmol／L)：TC一(HDL—C)一 TG／2．2。 1．4 病理形态学检查 处死家兔后立即取出主动脉，剪取主动 脉弓近左颈总动脉分叉处全层动脉组织0．5 crI1×0，5 crI1标本 用OCT包埋，液氮速冻，留做冷冻切片原位杂交用。再取 0．5 ∞ ×0．5∞ ，标本用4％多聚甲醛固定，留做石蜡切片原位杂 交。另将主动脉纵行剪开，选择主动脉弓近左颈总动脉分叉AS 斑块取材经石蜡包埋，HE染色，光镜下测量最人 AS斑块内膜 厚度及中膜厚度。另取左颈总动脉分叉全层动脉组织 0．3 crn× 0．3 crI1。浸入2．5％戊二醛PBS缓冲液固定 2 h以上，PBS清洗 3次，再用 10％锇酸固定 1 h，经丙酮酸梯度脱水，环氧树脂丙酉阍 混合液浸泡24 h，经石蜡包埋，修订后超薄切片，铅铀ji)(重染色， 置JEM一1200Ex型电子显微镜下观察与照片。 1．5 统计学处理 计量资料以均数±差(i±S)表示，采 用 检验、q检验、直线相关分析。均在SPSS下进行。 2 结 果 2．1 生存情况 实验过程中各组动物进食及活动正常，毛色光 泽。同期体重增加无统计学意义(P>0．05)，到第 10周末体重 增加数，对照组分别为(0．85±0．10)kg，中药组(1．00±0．11) kg，AS组(1．00±0．22)kg，西药组(0．90±0，15)kg。生存情 况，实验初期中药组因肺内感染死亡 1只，实验中期对照组及西 药组均因肺内感染各死亡 1只，实验末期 AS组因心肌梗死死 亡1只(通过解剖证实)，各组其他动物状态均良好。 2．2 生化检测 2．2．1 对血脂的影响 实验前各组间无明显差异。实验后中 药组、西药组、AS组血清Tc、TG、LDL一( 与对照组相比有统 计学意义(P<0．001)，中药组、西药组显著低于AS组(P< 0．05)。详见表 1。 表 1 4组血脂指标比较(i± ) mmol／L 2．2．2 大体标本检测和病理检测结果 对照组主动脉内膜光 滑，未见粥样硬化斑块。AS组的主动脉内膜均有严重的粥样硬 化病变，肉眼呈点、斑条状，边缘清楚，表面无明显破溃，较严重 者斑块融合成片、密布内膜面。中药组及西药组的主动脉内膜 散在粥样斑块，多在主动脉起始部和肠系膜动脉、肾动脉分叉 处。光镜下见对照组血管内膜形态大致正常。AS 组血管内膜 明显增厚，内膜下大量平滑肌细胞(SMC)增生，内有脂质沉积， 形成泡沫细胞，内膜中有大量巨噬细胞浸润。最大内膜厚度AS 组(0．38±0．44)nlnq，对照组(0+02±0．01)n1n1，中药组(O．12± 0．03)111111．，西药组(0．O8±0．02)IYI~_，中药组与AS 组相比有统 计学意义(P<0．01)。 2．3 电镜 F血管壁平滑肌细胞表型的改变 AS 组多数 sMC 富有大量的粗面内质网和核糖体，高尔基体发达，肌丝较少。平 滑肌细胞呈分泌型改变。中药组SMC含肌丝较多，与合成功能 相关的细胞器较少。 2．4 C—myc原癌基因原位杂交结果 AS组动物的硬化斑块 中C—myc mRNA的阳性表达信号呈棕黄色颗粒，多见于增殖 的平滑肌细胞内。中药组及西药组的主动脉内膜斑块内可见少 量散在分布的阳性颗粒，且强度明显弱于AS 组。对照组的主 动脉组织内未见c—myc mRNA阳性表达。 3 讨 论 大柴胡汤出自《伤寒论》，由柴胡、大黄、黄芩、芍药、半夏、生 姜、枳实、大枣组成，主治少阳病，兼热邪内陷，热结于肠胃，以致 气机升降失调之证，本次应用在此方基础加上泽泻。实验结果 表明大柴胡汤可明显降低血清TC、TG、u)L—c的水平，对血 脂代谢紊乱有明显调节作用。这可能是大柴胡汤抗AS 作用的 重要机制之一。 对血管壁平滑肌细胞表型的影响，平滑肌细胞在形态上有 两种表型，收缩表型和合成表型。前者胞浆中含有丰富的粗细 肌丝，有收缩功能，抗肌球蛋白免疫组化显示强阳性反应；合成 表型肌浆内含较多细胞器，仅含少量肌丝，无收缩功能，可分泌 多种结缔组织基质。本实验应用电镜观察 AS组动脉内膜组织 的超微结构，发现斑块组织中的平滑肌细胞含有丰富的粗面内 质网和高尔基体，收缩蛋白极少，即平滑肌细胞呈分泌型改变。 因为合成型平滑肌细胞在各种因子作用下大量增殖，同时产生 大量的胶原纤维、弹力纤维、蛋白多糖和糖蛋白、紫细胞问质成 分；吞噬胆固醇，使脂质在平滑肌细胞中积聚，形成肌源性泡沫 细胞。增殖的平滑肌细胞和泡沫细胞容易坏死，细胞坏死后与 细胞间质成分、脂质成分一起构成典型的粥样病变。而中药组 血管内膜平滑肌细胞肌丝含量较多，与合成功能相奖的细胞器 维普资讯 http://www.cqvip.com ‘ 38 。 INIESE JOURNALOFINTEGRATIVEMEI．)ICINEONCARDIO一／CEREBROVASCULARDISEASE January 2007 Vo1．5 No．1 较少，所以动脉粥样病变程度轻，同时也说明此药能抑制血管细 胞间黏附分子的增殖，阻抑了AS的形成。 C—myc基因属即刻早期基因，受血小板源性生长因子 (platelet derived grouth factor，PD( )等多种有丝分裂原刺激后， 呈快速诱导方式表达，C—myc产物作为转录因子去调节其他基 因的表达，以介导细胞外信号在细胞水平的应答效应，参与细胞 增殖调控，是细胞生长过程中的重要调节基因。C—myc的产物 是核内蛋白质，与细胞 Go～G】期有关，参与 DNA复制内膜损 伤、高脂血症等多种因素，可引起血管壁PIX~F基因的异常表 达，而诱导C—myc等癌基因异常表达，LDL—c亦可直接促进 C—myc基因表达，C—myc基因表达核内蛋白质，与DNA结合， 调节细胞内其他基因表达，产生和分泌多种生长因子，再通过内 分泌和旁分泌作用，使细胞增生更明显ll， 。增生的SMC巨噬 细胞，脂肪摄人量增加后脂质代谢障碍，最终形成“泡沫细胞”。 另外，增生的细胞产生大量细胞间质，最终形成 AS斑块。杨和 平等L3 J用原位杂交技术证明，AS斑块内C—myc基因表达明显 高于斑块旁中膜。说明原癌基因c—myc的表达与AS的细胞 异常增殖有关。本实验结果也证明，AS组家兔血管壁 C—myc mRNA表达量增高，而大柴胡汤组 C—myc mRNA表达水平与 AS组比较明显降低，说明此药能阻抑原癌基因 C—myc的表 达，抑制 AS 的产生，起到抗AS的作用。 参考文献： 【1] 汤键，周爱儒．原癌基因与心血管病[M]．北京：北京医科大学、中 国协和医科大学联合出版社，1990：165． [2] FatalwJ．Distinct phosphotyrosines∞ agrowthfactor receptor bind to specific moleculesthat mediate differet signaling pathways[J]．Cell， 1992，9：413． [3] 杨和平，张敏，刘荣修，等．动脉硬化斑块和斑块旁中膜C—sis、C— myc基因检测和细胞表型的比较研究[J]．中华病理学杂志，1992， 21：349 350． 作者简介：王凤荣(1962一)，现工作于辽宁中医药大学附属医院(邮编： 110032)；刘彤、郑娴、毛丹，工作于辽宁中医药大学附属医院。 (收稿日期：20O6—1O O1) (本文编辑 王雅洁) 葛根素对脑缺血再灌注损伤 神经元 L一型钙通道的影响 唐 瑜 摘要：目的 研宄脑缺血再灌注损伤后，不同时点大鼠海马CA1区锥体细胞L一型(二82 通道的活动变化及葛根素对它的影响。方 法 采用改良Pulsinelli四血管闭塞法制作大鼠全脑缺血模型，实验随机分为3组：①正常组；②模型组：又分为6个时间点，各时间 点均为1组；③葛根素组：6个时间点分组同模型组。在各时间点急性分离出成年大鼠海马CA1区锥体细胞后，采用膜片钳细胞贴 附模式记录同一钳制电压下离子通道活动情况。结果 在观测的时间点内，再灌注24 h时的开放概率升高(P<0．05)；再灌注0 h (缺血组)、6 h、12 h、24 h时通道平均开放时间显著高于正常组(P<0．05)；再灌注0．5 h通道电流幅度明显高于正常组(P<0．05)。 用药组开放概率无一高于正常组水平。通道开放概率在再灌注1 h、12 h下降(P<0．05)；各个时点通道电流幅度，在用药前后均没 有明显的变化(P>0．05)；再灌注0．5 h组、6 h组、12 h组、24 h组用药后，通道平均开放时间明显下降(P<0．05)。结论 在不同 时点，脑缺血再灌注损伤对L一型Ca2 通道影响的主要机制不同。葛根素可以抑制脑缺血再灌注损伤后大鼠海马CA1区锥体细胞 L 型钙通道。提示临床上葛根素治疗缺血性中风可能与其抑制神经细胞L一型钙离子通道的开放防止钙超载有关。 关键词：脑缺血再灌注损伤；海马；L一型Ca2 通道；葛根素 。 中图分类号：R318．04 R285．5 文献标识码：A 文章编号：1672—1349(2007)01—0038—03 Effect of Puerarin on L——type Calcium Channel Following Cerebral lschemia Reperfusion Injury in Rat Tang Yu／／Department of Pathology，Chengdu Medical College(Chengdu 610083) Abstract：Objective To study the effects of Puerarin on L——type calcium channd in CA1 Pyramidal Neurons of Hippocampus in rats with cerebral ischemia reperfusion injury．Methods The experiment rats were divided into 13 groups randomly：① control group；② mod— el group(divided into 6 subgroups based on the time)；③ Puerarin group(divided into 6 subgroups based on the time)．The pyramidal neu— rolls in hippoeampus CAL region were dissociated acutely from SD adult rats by the enzyrnatica1 and automatica1 way．The ion cbannel activi— ties at the same holding voltage were recorded by the cell—attached of patch clamp techniques．Results At 24 h after reperfusion the ealci— urn channel open probability increased(P<0．05)．At Oh after reperfusi0n，6 h，12 h，24 h，open time was prolo~ d(P