枸杞多糖对糖尿病小鼠模型免疫功能的影响

杞；雅 帮 南 龟 动 可 ‘上海免痤学杂志'2o。0年第 20卷第 3期 l59 · 文it编号：1~1-24"／8(∞0ol034)159-04 嘲一tb 枸杞多糖对糖尿病小鼠模型免疫功能的影响 、 ／ d j ‘护 6500 31 。 ，／”／ 昆明医学院微生物学与免疫学教研室 昆明 ， 摘要：利用静脉注射四氧嘧啶【l00-n吕／kg)诱导制备糖尿病小鼠模型．观察 I．BP-D对四氧喀嚏致糖尿病小鼠免疫功能的影 响。研究明，小鼠在注射四氧嘧啶后 72h，灌胃(ig)给予I~P-D。连续 10d，糖屎病小鼠Ns对照组免疫功能明显降低，而 LBP-D组显示 LBP-D具有明显促进小鼠淋巴细胞增殖、调节 T淋巴细胞亚群及提高 IL-1和IL-2水平的功能，使四氧嘧啶糖 尿病小鼠免疫功能恢复接近正常。研究结果显示．LBP-D对糖尿病模型小鼠有免疫调节治疗效应。 关键词：LBP．D；四氧嘧啶；糖尿病；淋巴细胞增殖；T淋巴细胞亚群；IL-1；IL-2 中固分类号：R392．6 文献标识码：A T1Ie Effects of LBP．D On Imllume Funelions in Alloxan-I．ndueed Diabetes M ioe neI1gXueduan， un，Xie P【lIin，JiaI1ghlzM，Zhao Chong(脚 ofMicrobi· Kumm'ngMedical College，陆fnm 650031) Ahtm'aet An experiment diabetes i,llOLis．e model was induced by inhaw删 s jrIjeetions of alloxan II]0凸0h im【e(100mg／ k )．and LBP-D w∞administrated 72 hours afterinjections of alloxanfor10 succe商ve d研B．ItwasfmmdthatU}P．D had 8 remarkahlly enhancing effects on the immtme functions including the~nh~ t of lymphocyte proliferation，up- regulation in tIle IlI哪be巧 of T lymphocyte subsets，elevations of theⅡ，1 and IL-2 levels。and recovery of the iHlnlU／lO- compromisedfunctior~s oftIle alloxan—indUCed diabetes mice nearto norma1．11lese experimental rcsuhsimplicatethat ⅡIP．D appeam t0 have a m叫 酬 at0 effect onthe alkrxan．induced diabetesmice． Key wards LBP-D；alloxan monohydrate；diabetes；lymphoeytes proliferation；T lymphocy~ subpopulafiom； Ⅱ，1：Ⅱ，2 糖尿病是一种常见的多发的内分泌代谢性疾 病，近年来发病率处于上升趋势，其死亡率仅次于 肿瘤和心血管病。高血糖还可诱发冠心病和动脉粥 样硬化，严重危害人类的生命健康。新近研究表 明⋯1，糖尿病患者可出现多种免疫功能的紊乱。采 用环孢霉素、硫唑嘌呤等免疫疗法治疗有严重的副 作用( ，而降糖药长期使用会失效[ 。因此从天然 药物中筛选和研究降糖药．已为世界各国工作者所 瞩目。近年来国内外对具有降糖作用的植物多糖的 化学和药理研究进展迅速l4J，多糖类成分不仅是一 种非特异免疫增强剂，而且还起到抗菌、抗病毒、 抗肿瘤等功能．并具有降血糖、降血脂、降血压等 多种作用，且无毒剐作用。本文首次研究了枸杞多 槔 D组份(Lycium batbammPolysaccharides．D．LBP-D )对四氧嘧啶糖尿病小鼠免疫功能的影响。 *云南省教委应用基金资助项目(9612117) 回昆明医学院物理学教研室；0昆明医学院第二附属医院内分泌 科；@北京中国医学科学院动物所生殖生物学宴验室 1 材料和 1 1 主要试剂 RPMI1640培养基、脂多糖(u)s)、 刀豆蛋白 A(Con A)、四氧嘧啶、TnetIlyl a-D-man． no~ide(a-MM)和噻唑蓝 (wrT)均为美国 Sitar产 品。三 联 细 胞 裂 解 液：10％ SDS-5％ 异 丁 醇． 0．O12mol／L HC1(w／v／v)，小牛血清为中国医学科 学院血液研究所产品。小鼠T淋巴细胞亚群试 剂盒，购于北京医科大学免疫系。 1．2 药品 LBP-D按文献[5]方法从枸杞子中提 取。实验时用生理盐水(NS)配成所需浓度。 1．3 实验动物 ICR小鼠，体重 18—24g．雌雄兼 用．云南省天然药物研究中心动物室提供。BAL8／ c小鼠．23±2g，雄性，上海实验动物中心供应。 1．4 主要仪器 荧光显微镜，日本产Olympus(昆 明医学院第一附属医院中心实验室免疫室提供)。 722型光栅分光光度计．上海第三分析仪器厂出品 维普资讯 http://www.cqvip.com l60 ‘上海免疫学杂志)砌 年第∞卷第3期 (Q／YXLH4-92型)。ELISA仪(美国产 B~tek E 340 型，云南省天然药物药理重点实验室提供)。 1．5 动物模型 实验性四氧嘧啶糖尿病动物模型 的制备参见文献[6]，四氧嘧啶由小鼠尾静脉注入， 剂量为 100mg／kg。正常对照组小鼠血糖为 5．89± 0．21mmoVL，模型组小 鼠用药前血糖 为 18．44± 0．81trano~L，用药后血糖在 8．60±0．38mmo~L～ 9．81±0．~rmnol／L。LBP．D对四氧嘧啶糖尿病小鼠 血糖的影响另文发表。 1．6 给药方法 【cR小鼠随机分成5组(每组小鼠 数见结果表中)，正常对照组和四氧嘧啶动物模型 组。后者在四氧嘧啶注射后 72h，开始灌胃给药 (ig)。正常对照组和四氧嘧啶动物模型的 对照 组：Ns每只鼠O．5ml／次；LBP．D三个剂量给药组 (200、400、~Omr／ ．d)连续用药 l0d，第 l1天检 测免疫学功能。 1．7 淋巴细胞增殖实验 胸腺细胞和脾细胞增殖 实验按文献[7]进行。 1．8 T淋巴细胞亚群的检测_日 大鼠抗小鼠 cD4 及L 2单克隆抗体(MeA1))和 FITC．兔抗大鼠IgG MeAb用 0．01~I／L P 按 1：10稀释。取 ICR小 鼠 的脾细胞(1×1o7／Hd)50 移人 40孔塑料培养板 中，离心沉淀弃上清后 ，加 cD4或 CD8 McAb40 L／ 孔。非特异染色对照加等量的 RPM[1640液混匀， 4℃反应 30II1in，洗涤三次，弃上清，每孔加^ FIT(：．兔抗大鼠IgG 4叫 ，混匀，4℃反应 301／lin，洗 涤三次后加 1o0 Hanks液混匀，吸取 1O 置血球 计数板上，在荧光显微镜(激发光 490mn，屏障滤 板透光范围520nfn～530rim)下观察计数。每个样 品共计数 200个细胞 ，其中阳性荧光细胞数换算成 阳性百分率(％)。 1．9 Ⅱ 的测定 1．9．1 小鼠腹腔巨噬细胞(M中)的制备：取 ICR小 鼠，无菌收集腹腔渗出细胞(PEc)，同组合并后用 ~ 1640培养液洗二次，将细胞悬浮于含 10％小 牛血清 ~MI1640完全培养基中，调整细胞浓度到 2×106／Hd，接种至培养板上，于 37℃、5％c 饱 和湿度条件下培养 2—3h，然后洗去未贴壁细胞。 得到 M中单层。 1．9．2 Ⅱ厂1的诱生与检测L J：将上述 PEC悬液． 按每孔 1Hd加到 24孔培养板上，得到M中单层， 于各孔中加入 u)s(终浓度为 1 舀／Hd)，培养 24h 后收获上清，作为 1样品。 1活性的测定用 Con A(2．5峭／n11)活化的 BAIB／c小鼠胸脲细胞增 殖 hfrr法 。 1．10 Ⅱ，2的测定 1．10．1 脾细胞的制备：BALB／e小鼠，摘除眼球 取血，断颈处死后，无菌取脾，制备单个细胞悬 液，将细胞用Hanks液洗两次，将细胞重悬于 RP． ~1640培养液，活细胞率>90％。 1．10 2 c∞A活化小鼠脾细胞的制备 J：取上述 小鼠脾细胞 5×106／Hd加 c∞ A 1O ，lml／孔分装 于24孔组织培养板个孔中，置 co2孵箱内培养 48h。收集培养细胞用 a-MM洗液(含 a．MM 20mg／~ 的 RP~1640培养液)洗三次以除去 con A，然后重 悬于 ~ 1640培养液中作为 2活性的检测细 胞。 1．10．3 小鼠 Ⅱ，2活性测定"|9 J：Mrr比色法测定 Ⅱ 的水平。将 5×106／Ⅱd c∞ A活化的小 鼠脾细 胞 1o0 分别加入 96孔板中，再加入 1o0 1：8稀 释的待检样品，设培养液对照孔。经 4h培养后， 加入 hfrr溶液 20 ，孑L；继续培养 4h后，加入三 联液1o0 ，于37℃放置过夜，用 ELISA仪，选择 检测波长57onfn，参考波长630nm测定 值。 1．11 统计学分析 实验数据以 ±s表示，组间 比较采用 ￡检验。 2 结果 2．1 L田IP．D对小鼠淋巴细胞增殖的影响 小鼠在 注射四氧嘧啶后 72h，ig给药，模型 Ns对照组和 正常对照组均给等量 NS。连续用药 1od，第 11天 检测小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞增殖实验，结果见表 1。由结果可见，模型 Ns对照组与正常对照组比 较，小鼠淋巴细胞增殖明显降低(P<0．O1)，模型 LBlP-D三个剂量给药组均不同程度促进淋巴细胞增 殖，800me／ ．d组能使小鼠胸腺淋巴细胞增殖基 本恢复至正常。 表 1 LBP-D对四曩嘧啶糖屎病小■；I‘巴细胞增矗的髟响 摸型 NS对照组与正常对帽组比较．△△P<0 01 用药组与 Ns对照组比较， P(0_0】：⋯ P