黄精中的多糖组分及其免疫活性

·1132· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第8期2006年8月 黄精中的多糖组分及其免疫活性 刘 柳，郑 芸，董群‘，方积年 (中国科学院上海生命科学研究院上海药物研究所，中国科学院研究生院，上海201203) 摘 要：目的 研究黄精Polygonatumsibiricum中的多糖组分的结构特征及免疫活性。方法黄精水提粗多糖用 DEAE一纤维素柱色谱和凝胶过滤色谱进行分离纯化，用化学及光谱方法各多糖组分的结构特征，并进行免疫 活性测试。结果 黄精水提粗多糖经分离纯化，得到5种多糖。PSWIB—b为中性半乳聚糖，PSW2A一1和PSW3A一 1为酸性多糖，PSW4A和PSW5B为糖蛋白，其中PSW3A一1、PSW4A、PSW5B具有一定免疫活性。结论5种多糖 为首次从黄精中分得，并都以半乳糖为主要构成单元，其中3种具有免疫活性。 关键词：黄精；多糖；免疫作用 中图分类号：R284．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)08—1132一03 PolysaccharidesfromPolygonatumsibiricumandtheirimmunologicalactivities LIULiu，ZHENGYun，DONGQan，Fangji—nian (ShanghaiInstituteofMateriaMedica，ShanghaiInstituteforBiologicalScience，ChineseAcademyofSciences， GraduateSchooloftheChineseAcademyofSciences，Shanghai201203，China) Abstract：ObjectiveTostudythecharacteristicsandimmunologicalactivitiesofthepolysaccharides fromPolygonatumsibiricum．MethodsThepolysaccharidefractionsfromwaterextractofP．sibiricum wereisolatedandpurifiedusingDEAE—celluloseandgel—filtrationchromatography．Theirstructureswere investigatedusingchemicalandspectralmethods．Theirimmunologicalactivitiesweredetermined．Results FivepolyscaaharideswereobtainedfromthewaterextractofP．sibiricum．PSWIB—bwasaneutralgalac— tan．PSW2A一1andPSW3A一1wereacidicp01ysaccharides．PSW4AandPSW5Bwereglycoproteins． PSW3A一1，PSW4A，andPSW5Bshowedsignificantimmunostimulatingactivities．ConclusionFive polysacharidesareobtainedfromP． sibiricumforthefirsttimeandaremainlycomposedofgalactose amongwhichthreepolysacharideshavetheimmunologicalactivities． Keywords：Po匆gonatumsibiricumRed．；polysaccharide；immunologicalactivities 黄精是百合科黄精属植物黄精Polygonatum sibiricumRed．的干燥根茎[1]。中医常用于治疗肺虚 燥咳、头晕、脾胃阴虚、口干食少等。黄精的化学成分 有皂苷、醌类、生物碱、氨基酸、糖类等。黄精多糖是 黄精主要生物学活性成分之一，有关药理学研究证 明黄精多糖具有增强免疫功能、抗炎、抗病毒等多种 作用跚。黄精多糖的初步结构研究已有报道‘引，但进 一步的结构及构效关系的研究却未见报道，本实验 研究黄精中分离纯化得到的5种均一多糖的结构特 征及免疫活性。 1材料 1．1 试剂：黄精药材购于上海市徐汇区中药饮片 厂，单糖对照品：葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、阿 拉伯糖及木糖为Fluka公司出品。测定多糖相对分 子质量的标准品DextranT系列为Pharmacia公司 生产，其他试剂均为国产AR级，用前未作进一步处 理。 1．2仪器：Waters高效液相色谱系统：515HPLC Pump，2410示差检测仪，UltrahydrogelTM2000和 UltrahydrogelTM500串联柱；日本岛津GC一14BPF 型气相色谱仪，色谱柱为5％OV一225／Aw—DMCS— ChromosorbW玻璃填充柱；WZZ一1S型数字式自 动旋光仪；ZD一2型自动电位滴定计。 2方法 2．1 提取分离：取3kg黄精，以95％乙醇浸泡3 周，滤过，药渣室温晾干，得2．25kg。用沸水提取， 收稿日期：2005—10-29 基金项目：国家自然科学基金资助项目(No30470397) 作者简介：刘柳(1979一)，女，硕士研究生。 *通讯作者董群Tel：(021)50806600—3203E—mail：dongqun@hotmail．com 万方数据 中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第8期2006年8月·1133· 每次加蒸馏水15L，提取时间为4h，共提取5次。 将滤液合并，浓缩，透析。内液加入乙醇沉淀，沉淀用 无水乙醇、丙酮依次洗涤，常温真空干燥，得133g 灰白色体PSW。PSW用DEAE—cellulose柱(80 cm×6cm)进行初步分离，分别用蒸馏水，0．2、0．5、 0．8mol／LNaCI及0．1mol／LNaOH溶液进行阶 梯洗脱，得PSW一1，PSW一2，PSW-3，PSW-4和 PSW一5。PSW一1溶于水中，加入Feling试剂至产生 沉淀[4]，离心，上清液加入25％醋酸中和，透析，乙 醇沉淀，得PSW一1B，反复用G一75纯化，得均一多糖 PSWlB—b。PSW一2、PSW一3、PSW一4和PSW一5分另0 用SephacrylS一300柱反复分离纯化，得到4个均一 多糖组分PSW2A一1、PSW3A、PSW4A、PSW5B。 2．2纯度的鉴定和相对分子质量的测定：高效凝胶 渗透色谱法(HPGPC)，流动相为3mmol／LNaAc， 体积流量0．5mL／min。标准曲线根据标准葡聚糖 DextranT一700、580、T一500、T一80、T一70、T一40、T一11 和T一9．3的相对分子质量和保留时间制作，然后根 据多糖样品在相同色谱条件下的洗脱或保留时间， 根据标准曲线由GPC软件计算得出该样品的相对 分子质量[5]。 2．3 比旋光度[a]哿的测定：准确称取多糖样品适 量，以蒸馏水配成一定浓度的溶液，在(20±0．1)℃ 于数字式自动旋光仪上测得其旋光度，通过公式计 算比旋光度。 2．4 中性糖、糖醛酸和蛋白质的质量分数的测定： 分别按照苯酚一硫酸法[6]、间苯基苯酚法[71和Lowry 法[8]，测定中性糖、糖醛酸和蛋白质的质量分数。 2．5糖组分分析：取3mg样品，加入2mol／L三氟 乙酸(TFA)4～6mL，充N。封管，1lo℃下水解2 h，溶液于40℃减压蒸干，反复加甲醇蒸数次以除 尽TFA。蒸干后用0．5mL蒸馏水溶解，取少量在纤 维素板上薄层色谱，初步鉴定单糖组成和是否含糖 醛酸。水解产物以NaBH。还原、醋酐乙酰化制备阿 尔迪醇乙酸酯衍生物后进行GC分析凹]。 2．6糖醛酸的还原：取20mg样品，溶于20mL蒸 馏水中，室温下搅拌使其完全溶解，然后加入0．5g， 碳化二亚胺试剂CMC，于自动电位滴定仪上磁力搅 拌反应，设定滴定终点为pH值4．75，至pH值不再 变动即终止滴定。另配制2mol／LNaBH。和4mol／ LHCl溶液，设定滴定终点pH值为7．0，磁力搅拌 下缓慢滴人2mol／LNaBH。溶液进行还原，以4 mol／LHCl溶液自动滴定以调节pH值在7．0左 右。反应完毕后，反应液对蒸馏水透析2d左右，冷 冻干燥，干燥后的样品按上述操作再重复还原2 次‘1州。 2．7免疫活性检测：小鼠脾细胞、样品以及ConA 或LPS溶液于5％CO。及37℃培养箱中培养48h， 结束前5h加入MTT，终止培养后加溶解液孵育 6～7h，用酶标仪于570nm处测定吸光度值[1¨。 3结果和讨论 3．1 纯度、相对分子质量及比旋光度：PSWlB—b、 PSW2A—l、PSW3A、PSW4A、PSW5B在HPGPC上 都呈现单一对称峰，可以判定为均一多糖。计算所得 相对分子质量和所测比旋光度见1。 表1黄精中5种多糖的相对分子质量和比旋光度 Table1 Molecularweightsandspecificrotations offivepOlysaccharidesinP．sibiricum 3．2 中性糖、糖醛酸和蛋白质的质量分数： PSWlB—b为中性糖，在280nm处无明显吸收，表明 不含肽或蛋白质；PSW2A一1在280nm处无明显吸 收，Lowry法检测结果也表明不含蛋白质；PSW3A一 1糖醛酸的量较高，而PSW4A一1、PSWSB含蛋白质 的量较高，见表2。 表2黄精多糖的中性糖、糖醛酸和蛋白质的质量分数 Table2 Contenofsugar，uronicacid，andprotein inpOlysaccharides0fP． sibiricum 3．3 糖组成分析结果：PSw2A一1由GC分析可得 其组成为鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖，摩尔比为 1．7：1：4．3，经CMC—NaBH。还原后组成摩尔比为 1．7：1：5．7，说明PSW2A一1组成为鼠李糖、阿拉 伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸，比例为1．7：1：4．3： 1．4，糖醛酸的量与比色法所测的结果一致。 PSW3A一1的GC分析可得其组成为鼠李糖、阿 拉伯糖、木糖和半乳糖，摩尔比为2．4：1．5：1： 4．0，经CMC—NaBH4还原后摩尔比为4．3：1．5： 1：9．0。还原前鼠李糖的量测得结果偏低，这是由于 鼠李糖部分连接在半乳糖醛酸上，在水解时难以完 全释放所致。所以PSW3A一1组成应为鼠李糖、阿拉 万方数据 ·1134· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第8期2006年8月 伯糖、木糖、半乳糖和半乳糖醛酸，比例为4．3： 1．5：1：4．0：5．0，糖醛酸的量与比色法所测基本 一致。 PSWlB—b由单一半乳糖组成的半乳聚糖； PSW4A组成为鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖 醛酸，比例为1：1．4：1．9：0．8；PSw5B中性糖组 成为鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖，比例为1： 1．5：3．4：1．3。 3．4 IR光谱分析和13C—NMR谱：PSWlB—b， PSW2A一1和PSW3A一1的IR谱中都显示了典型的 糖环结构，810、870cm_1处没有吸收峰，表明不含有 甘露糖。PSW2A一1和PSW3A一1在1730am-1左右 出现吸收峰，说明可能含有糖醛。PSWIB—b的 13C—NMR谱中，d106．43～10．66为B一半乳糖的C一1 吸收峰。PSW2A-'1的13C—NMR谱中，d176．02为a一 半乳糖醛酸6位羰基碳的吸收峰，艿109．8～111．8 为a一阿拉伯糖的C一1信号，艿19．18和18．93处的吸 收峰为a一鼠李糖的C一6信号。PSW3A一1在d 178．02出现信号较强的半乳糖醛酸吸收峰，说明含 糖醛酸的量较高，艿110．3处吸收峰为a一阿拉伯糖 产生，艿107．4为13一半乳糖产生，艿101．7处吸收峰 则为鼠李糖的异头碳信号，信号归属参阅文献报 道‘1“。 3．5 药理活性“药理试验结果显示所有样品均无细 胞毒性，PSW3A一1、PSW4A、PSW5具有明显的促 进免疫功能活性。 4 结论 实验结果表明黄精水提物中含有中性多糖、酸 性多糖和糖蛋白复合物，其主要特征是均含有较高 量的半乳糖。免疫活性实验结果初步表明酸性多糖 (PSW2A一1、PSW3A一1)的活性高于中性糖(PSW 1B—b)，而糖蛋白复合物(PSW3A一1、PSW4A、PSw 5B)的活性也高于一般多糖(PSW2A一1、PSW1B— b)，具体的构效关系待进一步研究。 References： [1]ChP(中国药典)[s]．V01．i．1995． [2]ShiL，MengYW，LiW．ProgressofPolygonatumandits polysaccharidesstudiesonpharmacology[J]．NatProdRes Dev(天然产物研究与开发)，1999，11(3)：67—71． [3]YangMH，YuDQ． Studyonthepolysaccharidesand oligosaccharidesofPolygonatumsibiricum[J]．ChinPharm J(药学通报)，1980，15(7)：44． [4]WhistlerRL．MethodsinCarbohydrateChemistry[M]．New York：AcademicPressInc，1965． Es]WeiYA，FangJN．Determinationofhomogeneityand molecularweightofpolysaccharidesbyHPGPCIJ]．Acta PharmSin(药学学报)，1989，24(7)：532—536． [6]ZhangWJ．BiochemicalTechniquesinComplexCarbohy— 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(1．中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京100094；2．香港城市大学生物及化学系，香港； 3．河北大学化学与环境科学学院化学系，河北保定071002；4．香港城市大学深圳研究院，广东深圳518057) 摘要：目的研究补中益气汤的主要化学成分及其对环磷酰胺免疫抑制小鼠的调节作用。方法采用LC—MS方 法对补中益气汤进行了液相和质谱分析，通过MTT法测定补中益气汤对环磷酰胺免疫抑制小鼠的T、B淋巴细胞 增殖和NK细胞活性的影响。结果补中益气汤中主要化学成分是多糖、黄酮类和皂苷类化合物，能够显著提高环 收稿日期：2005一ll一10 基金项目：国家“863”计划基金资助项目(2003AA222052) 作者简介：高璩春(1980--)，女，河北人，中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所2002级直博生，主要从事生药学研究。 乜一mall：gjlngchun蟛hotmall-com *通讯作者肖培根E—mail：xiaopg@public．bta．net．en杨梦苏E—mail：BHMYANG@cityu．edu．hk 万方数据